牛肉低溫貯藏環(huán)境中沙門(mén)氏菌誘導(dǎo)耐酸響應(yīng)的存在程度及其產(chǎn)生機(jī)制

郎晨曉，張一敏，朱立賢，梁榮蓉，毛衍偉，楊嘯吟，韓廣星，羅 欣,*，董鵬程,*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系臨沂站，山東 臨沂 276000）

沙門(mén)氏菌（Salmonella）能夠引起腹痛、腹瀉、腸胃炎和發(fā)燒等疾病，是世界范圍內(nèi)造成人類感染和經(jīng)濟(jì)損失的重要食源性致病菌[1]。據(jù)歐盟食品安全局統(tǒng)計(jì)，沙門(mén)氏菌在2017年引發(fā)93 583 例人類感染，并在2013—2017年間始終是引發(fā)歐盟食源性疾病的第二大食源性致病菌[2]。在我國(guó)，動(dòng)物性食品的消費(fèi)是引發(fā)沙門(mén)氏菌病的首要原因[3]。誘導(dǎo)耐酸響應(yīng)（acid tolerance response，ATR）是指細(xì)菌在微酸條件下生存一段時(shí)間后（即誘導(dǎo)過(guò)程），對(duì)普遍致死的強(qiáng)酸性環(huán)境（即酸激介質(zhì)）的抵抗能力增強(qiáng)的現(xiàn)象，又稱作酸耐受應(yīng)答反應(yīng)[4]。ATR一旦形成，不僅能提高細(xì)菌對(duì)酸的抵抗，還能增強(qiáng)菌株毒力基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)菌耐熱、耐鹽、耐氧化等能力，使細(xì)菌輕易越過(guò)食品加工過(guò)程中的各類柵欄因子，危害終端食品的安全[4-5]。針對(duì)肉類生產(chǎn)，冷鮮牛肉的生產(chǎn)及成熟過(guò)程具有誘發(fā)沙門(mén)氏菌ATR的可能，這些誘導(dǎo)因素包括酸性消毒減菌劑的廣泛應(yīng)用在工廠內(nèi)部形成的弱酸環(huán)境、宰后胴體pH值的降低、高蛋白的營(yíng)養(yǎng)成分等[6-8]。然而目前沙門(mén)氏菌ATR被引發(fā)后，其在肉牛的屠宰過(guò)程及牛肉貯藏過(guò)程中的消長(zhǎng)規(guī)律仍不明確，并且，外界的弱酸性環(huán)境誘發(fā)細(xì)菌的ATR相關(guān)反應(yīng)機(jī)理仍需進(jìn)一步探索。

細(xì)菌誘導(dǎo)耐酸現(xiàn)象的產(chǎn)生是多重生理生化作用的共同結(jié)果，如雙組分調(diào)控系統(tǒng)（two-component regulatory system，TCS）、酸休克蛋白（acid shock proteins，ASPs）、細(xì)胞膜脂肪酸組成的調(diào)節(jié)、膜系統(tǒng)對(duì)質(zhì)子的阻擋及外排以及基于氨基酸代謝的細(xì)胞內(nèi)pH值平衡的維持等過(guò)程[9]。其中，TCS對(duì)于酸性信號(hào)的感知至關(guān)重要[10]，它由一個(gè)跨膜的組氨酸蛋白激酶和一個(gè)位于胞質(zhì)內(nèi)的調(diào)控蛋白組成，是細(xì)菌感知外界環(huán)境信號(hào)，并將信號(hào)分子傳導(dǎo)至菌體內(nèi)部，從而激發(fā)相應(yīng)調(diào)控機(jī)制的重要結(jié)構(gòu)[11]。多個(gè)研究表明，作為T(mén)CS體系中的一種，PhoP/PhoQ可以響應(yīng)酸性信號(hào)，激活下游的ATR，產(chǎn)生小分子ASPs增強(qiáng)細(xì)菌的酸耐受能力[12-14]。然而，除ASPs外，PhoP/PhoQ與氨基酸代謝等機(jī)制的相互作用仍鮮見(jiàn)報(bào)道。氨基酸代謝能夠通過(guò)脫羧作用消耗質(zhì)子并產(chǎn)生堿性物質(zhì)，是細(xì)菌維持胞內(nèi)pH值穩(wěn)定的重要生化過(guò)程，沙門(mén)氏菌的精氨酸脫羧和賴氨酸脫羧系統(tǒng)也被廣泛報(bào)道[15-16]。Tran等[10]通過(guò)定量蛋白質(zhì)組對(duì)沙門(mén)氏菌PhoP/PhoQ正常及缺失菌株進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)缺失組中與精氨酸代謝相關(guān)的約10 種蛋白質(zhì)表達(dá)出現(xiàn)差異，說(shuō)明沙門(mén)氏菌的精氨酸代謝與PhoP/PhoQ調(diào)控有關(guān)。鑒于精氨酸代謝是細(xì)菌ATR的重要機(jī)制[15]，推測(cè)除了ASPs途徑，氨基酸代謝可能也是PhoP/PhoQ調(diào)控的重要靶過(guò)程。與此同時(shí)，除PhoP/PhoQ外，雙組分系統(tǒng)有著多元化的信號(hào)感應(yīng)體系，如PmrA/PmrB、EvgS/EvgA也能對(duì)H+作出響應(yīng)[17-18]，有可能在調(diào)節(jié)氨基酸代謝方面存在協(xié)同或拮抗作用。

因此，本研究模擬沙門(mén)氏菌在牛肉生產(chǎn)、貯藏過(guò)程中經(jīng)歷的弱酸、低溫、高蛋白的環(huán)境，輔以λRed基因敲除技術(shù)，探究微酸誘導(dǎo)、低溫長(zhǎng)期貯藏、雙組分調(diào)控對(duì)沙門(mén)氏菌ATR的影響，以明確ATR在牛肉加工與貯藏過(guò)程中的存在程度與消長(zhǎng)規(guī)律。并通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）、氨基酸添加實(shí)驗(yàn)等技術(shù)建立雙組分系統(tǒng)與氨基酸代謝的聯(lián)系，提出并驗(yàn)證沙門(mén)氏菌的雙組分系統(tǒng)PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB能夠感應(yīng)細(xì)胞外H+濃度，并調(diào)控氨基酸代謝系統(tǒng)以獲得更高的耐酸性這一理論假設(shè)，旨在進(jìn)一步解釋細(xì)菌誘導(dǎo)ATR產(chǎn)生的內(nèi)在機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

鼠傷寒沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（S. typhimuriumATCC 14028）由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院肉品實(shí)驗(yàn)室保存。

腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂（brain heart infusion agar，BHIA） 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；MiniBEST Universal RNA提取試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real time） 寶生物工程（大連）有限公司；L-精氨酸、L-賴氨酸 北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R離心機(jī)、移液槍 德國(guó)Eppendorf公司；G154DWS滅菌鍋 致微（廈門(mén)）儀器有限公司；T100 PCR儀、CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 TCS缺陷菌株的構(gòu)建

參照姜娜等[19]的方法，利用λRed重組系統(tǒng)，分別構(gòu)建TCS PhoP/PhoQ缺失菌株ΔphoP和TCS PmrA/PmrB缺失菌株ΔpmrA。首先，利用PCR技術(shù)構(gòu)建phoP和pmrA基因的同源打靶片段，片段的上下游為目的基因的同源臂，中間為卡那霉素抗性基因。同時(shí)，為制作感受態(tài)細(xì)胞，將質(zhì)粒pKD46轉(zhuǎn)化至鼠傷寒沙門(mén)氏菌14028，并用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)Red重組蛋白的表達(dá)。而后將PCR擴(kuò)增的同源片段電轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞，使打靶片段與菌體基因組發(fā)生同源重組，并同時(shí)獲得氨芐抗性，立刻孵育重組細(xì)胞，復(fù)蘇后用卡那霉素和氨芐青霉素抗性平板篩選突變子。最后將質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)化入鑒定成功的突變子，利用其表達(dá)的FLP翻轉(zhuǎn)酶去除重組菌的抗性，獲得ΔphoP和ΔpmrA菌株。

1.3.2 肉質(zhì)培養(yǎng)基（meat medium，ME）的制備

參照álvarez-Ordó?ez等[20]的方法，將牛肉去除脂肪和筋腱后切碎，375 g牛肉與750 mL去離子水在燒杯中混勻后滅菌（121 ℃、15 min），然后用無(wú)菌紗布過(guò)濾出肉湯，分裝于100 mL離心管并置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 低溫貯藏過(guò)程中沙門(mén)氏菌耐酸能力的測(cè)定

參照Buchanan等[21]的方法，利用添加葡萄糖的方式激發(fā)出細(xì)菌的ATR。TSBG培養(yǎng)基（添加10 g/100 mL葡萄糖的TSB培養(yǎng)基）的pH值在培養(yǎng)過(guò)程中緩慢下降，能夠?yàn)榧?xì)菌提供溫和的酸性適應(yīng)環(huán)境，達(dá)到酸誘導(dǎo)的目的。

將-20 ℃保存的正常沙門(mén)氏菌14028和ΔphoP（20 μL）接種于10 mL NTSB培養(yǎng)基（TSB去除葡萄糖）中37 ℃過(guò)夜活化，然后取100 μL培養(yǎng)物分別接種于50 mL NTSB（對(duì)照組）和50 mL TSBG（微酸誘導(dǎo)組），37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)物10 000×g、4 ℃離心5 min得到的菌體轉(zhuǎn)移至（4±2）℃的100 mL ME中低溫貯藏7 d。貯藏過(guò)程中菌株耐酸能力的測(cè)定參照Liu Jiamei等[22]的方法，在第1天和第7天從ME中取出適量菌液，根據(jù)提前測(cè)定的培養(yǎng)基中的活菌濃度，通過(guò)蛋白胨緩沖液稀釋后接種于9 mL pH 3的BHI（用HCl溶液調(diào)節(jié)）中，統(tǒng)一細(xì)胞濃度為5（lg（CFU/mL）），37 ℃酸激2 h。在酸激前和酸激后，梯度稀釋并涂布于BHIA平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。進(jìn)行3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

參照Skandamis等[23]方法，用菌落下降數(shù)表示耐酸能力。菌落下降數(shù)是指菌株在酸激前與酸激后的菌落對(duì)數(shù)值的差（lg（CFU/mL））。菌落下降數(shù)值越大，代表菌株的耐酸能力越弱。

1.3.4 氨基酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定

將沙門(mén)氏菌14028、ΔphoP和ΔpmrA（20 μL）接種于10 mL NTSB中活化后，取20 μL培養(yǎng)物接種于10 mL的pH值為5.4的NTSB（牛肉的極限pH值為5.4[24]）中，37 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)。

按照RNA提取試劑盒說(shuō)明提取3 種菌的RNA，將符合濃度和純度的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20 ℃保存。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser的說(shuō)明進(jìn)行real-time PCR，PCR體系包括2 μL cDNA、12.5 μL 2×SYBR PremixExTaq(Tli RNaseH Plus)、9.5 μL RNase Free Water和0.5 μL濃度為10 μmol/L的上下游引物。PCR程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線按儀器默認(rèn)程序。

本實(shí)驗(yàn)所用的基因?yàn)榫彼岽x中編碼精氨酸脫羧酶的adiA、賴氨酸代謝中編碼賴氨酸脫羧酶的cadA以及內(nèi)參基因rrsA，引物的堿基序列[25]見(jiàn)表1。

表 1 real-time PCR的引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

參照Livak等[26]的2-??Ct方法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)分析，將組分系統(tǒng)正常的沙門(mén)氏菌的基因表達(dá)量作為對(duì)照，最終結(jié)果用2-??Ct表示。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次獨(dú)立重復(fù)。

1.3.5 添加氨基酸實(shí)驗(yàn)的菌株ATR分析

參照J(rèn)onge等[27]的方法，取1 mL 1.3.4節(jié)過(guò)夜誘導(dǎo)后的3 種菌液（細(xì)胞濃度約為7.5（lg（CFU/mL））），分別接種于9 mL pH 2.5（用HCl調(diào)節(jié)）的純礦物質(zhì)培養(yǎng)基（MM）、添加0.01 g/100 mLL-精氨酸的礦物質(zhì)培養(yǎng)基（MM+Arg）、添加0.01 g/100 mLL-賴氨酸的礦物質(zhì)培養(yǎng)基（MM+Lys）中，置于37 ℃酸激2 h。在酸激前和酸激后分別進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，最終用菌落下降數(shù)表示菌株的耐酸能力。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次獨(dú)立重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

real-time PCR數(shù)據(jù)用Bio-Rad CFX Manager 3.1軟件處理。用SAS 9.0軟件的混合模型（MIXED Procedure）進(jìn)行耐酸性分析，在低溫貯藏的耐酸性測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，雙組分系統(tǒng)、微酸誘導(dǎo)處理、貯藏時(shí)間及其交互作用作為影響耐酸性的固定因素，實(shí)驗(yàn)重復(fù)作為隨機(jī)因素，在酸激介質(zhì)中添加氨基酸的耐酸性測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，酸激介質(zhì)、雙組分系統(tǒng)及其交互作用作為影響耐酸性的固定因素，實(shí)驗(yàn)重復(fù)作為隨機(jī)因素，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05，差異顯著。用Sigmaplot 10.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微酸誘導(dǎo)、雙組分基因敲除及長(zhǎng)時(shí)間低溫貯藏對(duì)沙門(mén)氏菌耐酸性的影響

表2顯示經(jīng)過(guò)不同誘導(dǎo)處理的PhoP/PhoQ正常菌（14028）和缺失菌（ΔphoP）在不同貯藏時(shí)間點(diǎn)的耐酸情況，菌落下降數(shù)越大細(xì)菌的耐酸能力越弱。雙組分系統(tǒng)、微酸誘導(dǎo)處理、低溫貯藏時(shí)間三因素的交互作用對(duì)耐酸能力影響不顯著（P＞0.05）。雙組分系統(tǒng)和微酸誘導(dǎo)處理、微酸誘導(dǎo)處理和低溫貯藏時(shí)間的交互作用對(duì)耐酸能力有顯著影響（P＜0.05）。

表 2 低溫貯藏（（4±2）℃）過(guò)程中不同誘導(dǎo)處理的菌株耐酸能力Table 2 Acid tolerance of strains with different induction treatments during storage at (4± 2) ℃

圖 1 低溫貯藏（（4±2） ℃）過(guò)程中沙門(mén)氏菌的耐酸能力Fig. 1 Acid tolerance of Salmonella during storage at (4 ± 2) ℃

圖1為沙門(mén)氏菌ATR的產(chǎn)生以及在低溫貯藏過(guò)程中的消長(zhǎng)變化，及貯藏前微酸誘導(dǎo)處理和低溫貯藏時(shí)間的交互作用對(duì)沙門(mén)氏菌耐酸性的影響。經(jīng)過(guò)TSBG微酸誘導(dǎo)菌株的耐酸能力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明沙門(mén)氏菌分解其中葡萄糖形成的微酸環(huán)境能夠激發(fā)細(xì)菌的ATR，與Malheiros[28]和Samelis[29]等的研究結(jié)果一致。誘導(dǎo)菌株在第7天的耐酸性仍顯著高于未誘導(dǎo)組（P＜0.05），這說(shuō)明，沙門(mén)氏菌的ATR一旦產(chǎn)生，在低溫環(huán)境中至少可以維持7 d，該結(jié)果表明，致病菌的ATR可能會(huì)貫穿牛肉的整個(gè)分割、運(yùn)輸和貯藏過(guò)程，并且其產(chǎn)生的耐酸、耐滲透壓、耐鹽等交叉保護(hù)作用可能隨原料一直進(jìn)入下游產(chǎn)品（如發(fā)酵肉制品），突破柵欄因子，對(duì)食品安全造成極大的危害，但目前這種現(xiàn)象在牛肉產(chǎn)業(yè)的存在卻很少受到重視。

相對(duì)于微酸誘導(dǎo)組，對(duì)照組菌株在7 d低溫貯藏過(guò)程中的耐酸能力無(wú)顯著變化（P＞0.05），說(shuō)明雖然在長(zhǎng)期貯藏過(guò)程中沙門(mén)氏菌一直處于微酸的肉湯培養(yǎng)基中（pH值為5.2～5.7），但該低溫環(huán)境并未引發(fā)對(duì)照組菌株耐酸性的增強(qiáng)，其原因可能是沙門(mén)氏菌的誘導(dǎo)耐酸應(yīng)激狀態(tài)的產(chǎn)生需要蛋白質(zhì)從頭合成以及能量大量消耗[30]，而低溫的貯藏環(huán)境可能抑制了相關(guān)酶的活性，進(jìn)而抑制了貯藏過(guò)程中ATR的產(chǎn)生。與之形成對(duì)比的是，誘導(dǎo)菌株在第7天的耐酸能力顯著高于第1天（P＜0.05），這可能是因?yàn)橘A藏期之前的微酸誘導(dǎo)處理已經(jīng)激發(fā)了細(xì)菌包含誘導(dǎo)耐酸在內(nèi)的某些應(yīng)激機(jī)制，產(chǎn)生酸休克蛋白，在貯藏過(guò)程中持續(xù)調(diào)節(jié)沙門(mén)氏菌生理過(guò)程，進(jìn)而表現(xiàn)出逐步增強(qiáng)的耐酸性現(xiàn)象。類似地，Tiwari等[30]的研究表明貯藏前誘導(dǎo)的沙門(mén)氏菌從外界酸性信號(hào)感知到ATR相關(guān)蛋白的合成僅需要1 h，在1 h后添加四環(huán)素和氯霉素等抑制蛋白產(chǎn)生的抗生素對(duì)于誘導(dǎo)耐酸的抑制已經(jīng)失去效果，同時(shí)，溫度因素對(duì)于ATR的影響極大，并且顯著高于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)耐酸性的影響。

圖 2 不同菌株的耐酸能力Fig. 2 Acid tolerance of different strains

為研究雙組分系統(tǒng)PhoP/PhoQ對(duì)菌株誘導(dǎo)耐酸能力的貢獻(xiàn)，分析微酸誘導(dǎo)處理和敲除雙組分基因的交互作用對(duì)耐酸性的影響，如圖2所示。結(jié)果顯示，PhoP/PhoQ對(duì)耐酸性的提升與細(xì)菌貯藏前微酸誘導(dǎo)處理有顯著交互影響（P＜0.05）。phoP基因的敲除能夠顯著降低微酸誘導(dǎo)處理組沙門(mén)氏菌的耐酸能力（P＜0.05），但對(duì)對(duì)照組的影響并不顯著（P＞0.05）。該結(jié)果表明微酸誘導(dǎo)處理和雙組分系統(tǒng)能夠協(xié)同提升沙門(mén)氏菌的耐酸能力，是沙門(mén)氏菌ATR系統(tǒng)的兩個(gè)重要組成成分，并證實(shí)了微酸環(huán)境中的H+通過(guò)PhoP/PhoQ啟動(dòng)沙門(mén)氏菌內(nèi)部的耐酸機(jī)制Soncini等[17]研究結(jié)果表明PhoP/PhoQ能夠感應(yīng)環(huán)境中的H+，當(dāng)環(huán)境中的Mg2+濃度較高時(shí)，被PhoP/PhoQ激活的下游基因的表達(dá)反而出現(xiàn)下調(diào)，出現(xiàn)拮抗效應(yīng)，但本實(shí)驗(yàn)中PhoP/PhoQ調(diào)控ATR的過(guò)程是否受金屬離子影響仍待研究。

當(dāng)phoP缺失后，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的沙門(mén)氏菌的耐酸能力雖然降低，但仍顯著高于未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株（P＜0.05），這說(shuō)明在誘導(dǎo)菌株抵抗酸性脅迫的過(guò)程中，除PhoP/PhoQ，還有其他耐酸機(jī)制的保護(hù)作用，如其他雙組分信號(hào)感應(yīng)體系、細(xì)胞膜系統(tǒng)和質(zhì)子外排系統(tǒng)等。已有研究表明，細(xì)菌的PmrA/PmrB、OmpR/EnvZ等雙組分系統(tǒng)也能夠?qū)ν饨绲乃嵝孕盘?hào)作出響應(yīng)[17,31]。

2.2 TCS缺失對(duì)精氨酸和賴氨酸代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量的影響

氨基酸脫羧反應(yīng)能夠消耗細(xì)胞內(nèi)部的質(zhì)子，配合細(xì)胞膜上的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系，維持細(xì)胞內(nèi)部的pH值，減少外界酸性環(huán)境對(duì)細(xì)胞的損傷，提高細(xì)菌在酸性脅迫下的殘存率，其中，精氨酸脫羧系統(tǒng)和賴氨酸脫羧系統(tǒng)是重要的組成部分[15-16]。為研究PmrA/PmrB是否與PhoP/PhoQ相同，也能調(diào)控沙門(mén)氏菌ATR，并且該過(guò)程是否是通過(guò)精氨酸和賴氨酸兩種脫羧代謝途徑實(shí)現(xiàn)，本研究對(duì)比了PmrA/PmrB和PhoP/PhoQ缺失前后，沙門(mén)氏菌的兩種脫羧酶編碼基因（adiA和cadA）的表達(dá)水平。

圖 3 組分系統(tǒng)基因缺失后精氨酸脫羧酶編碼基因adiA相對(duì)表達(dá)量變化Fig. 3 Change in adiA (encoding arginine decarboxylase) expression under the deficiency of TCS-related genes

圖3結(jié)果顯示，沙門(mén)氏菌的phoP和pmrA缺失后，精氨酸脫羧酶編碼基因adiA相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。該結(jié)果表明，除PhoP/PhoQ，PmrA/PmrB也能被環(huán)境中的H+信號(hào)激活，進(jìn)而對(duì)ATR產(chǎn)生調(diào)控，精氨酸脫羧系統(tǒng)是它們的正向調(diào)控靶系統(tǒng)。Brenneman等[32]發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌株的adiA和adiC（編碼逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）被誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，PhoP/PhoQ缺失沙門(mén)氏菌在pH 3.0的環(huán)境中存活能力顯著提升，間接證實(shí)了雙組分系統(tǒng)對(duì)氨基酸代謝的調(diào)控。Tran等[10]發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌的PhoP/PhoQ缺失后，與精氨酸代謝相關(guān)的10 種蛋白質(zhì)表達(dá)出現(xiàn)差異，說(shuō)明精氨酸代謝與PhoP/PhoQ有關(guān)，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

圖 4 組分系統(tǒng)基因缺失后賴氨酸脫羧酶編碼基因cadA相對(duì)表達(dá)量變化Fig. 4 Change in cadA (encoding lysine decarboxylase) expression under the deficiency of TCS-related genes

圖4結(jié)果顯示，與adiA結(jié)果類似，ΔphoP和ΔpmrA的賴氨酸脫羧酶編碼基因cadA相對(duì)表達(dá)量也顯著低于正常菌（P＜0.05）。說(shuō)明除精氨酸脫羧通路外，賴氨酸脫羧系統(tǒng)也能夠受到PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB的正向調(diào)控。值得注意的是，沙門(mén)氏菌的PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB在應(yīng)激調(diào)控過(guò)程中可能存在協(xié)同作用，如Kato[33]和Spector[5]等研究表明，當(dāng)菌株的PhoP/PhoQ被環(huán)境中Mg2+信號(hào)激活后，能夠促進(jìn)下游PmrD蛋白的表達(dá)，而PmrD又能夠進(jìn)一步激活PmrA/PmrB，兩種TCS進(jìn)而共同調(diào)控下游機(jī)制，如對(duì)脂多糖上脂質(zhì)A進(jìn)行修飾等。但本實(shí)驗(yàn)中的兩種氨基酸代謝的調(diào)控過(guò)程中，PmrA/PmrB與PhoP/PhoQ是否存在聯(lián)系，仍需進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。

2.3 酸激介質(zhì)中添加精氨酸和氨基酸對(duì)菌株ATR的影響

為從表觀現(xiàn)象驗(yàn)證PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB能夠通過(guò)精氨酸代謝和賴氨酸代謝進(jìn)一步調(diào)控沙門(mén)氏菌的誘導(dǎo)耐酸現(xiàn)象，通過(guò)在酸激介質(zhì)中添加精氨酸和賴氨酸，對(duì)比PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB正常與缺陷菌株的耐酸能力（表3），結(jié)果顯示雙組分系統(tǒng)、氨基酸添加的交互作用能顯著影響沙門(mén)氏菌的耐酸性（P＜0.05）。

表 3 不同酸激條件下菌株的耐酸能力Table 3 Acid tolerance of different strains under different acid challenge conditions

對(duì)于同一菌株，在作為酸激介質(zhì)的純礦物質(zhì)培養(yǎng)基MM中添加精氨酸和賴氨酸后，3 種雙組分系統(tǒng)處理（正常菌、ΔphoP、ΔpmrA）的耐酸性均顯著升高（P＜0.05），該結(jié)果說(shuō)明精氨酸和賴氨酸代謝都是沙門(mén)氏菌提高自身耐酸性的重要途徑，同時(shí)，在MM中雙組分系統(tǒng)突變菌的耐酸性顯著低于正常菌（P＜0.05），說(shuō)明除氨基酸代謝外，PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB可能還調(diào)動(dòng)了其他的耐酸機(jī)制幫助細(xì)菌應(yīng)對(duì)酸性脅迫。álvarez-Ordó?ez等[25]發(fā)現(xiàn)向MM中添加精氨酸和賴氨酸能顯著提高正常沙門(mén)氏菌的耐酸能力，Park等[34]也發(fā)現(xiàn)賴氨酸的存在能使正常沙門(mén)氏菌在pH 3的環(huán)境中殘存率顯著上升，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。此外，MM+Arg組和MM+Lys組的耐酸能力差異不顯著（P＞0.05），即不同的氨基酸種類對(duì)耐酸性的提高并無(wú)顯著影響。但Liu Jiamei等[22]發(fā)現(xiàn)在酸激培養(yǎng)基中添加賴氨酸后沙門(mén)氏菌的存活能力高于添加精氨酸的實(shí)驗(yàn)組，這種差異可能是不同血清型菌株（S. typhimurium與S. heidelberg）對(duì)氨基酸代謝能力的不同所致。

雖然MM+Arg和MM+Lys組中添加了精氨酸和賴氨酸，但phoP或pmrA基因敲除后菌株的耐酸性仍顯著低于正常組（P＜0.05），說(shuō)明氨基酸雖然有助于細(xì)菌提高酸耐受能力，但并不能改變TCS缺失導(dǎo)致的耐酸缺陷，該結(jié)果從表觀水平上驗(yàn)證了前述real-time PCR的結(jié)論，即PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB能夠通過(guò)控制氨基酸代謝增強(qiáng)沙門(mén)氏菌的耐酸能力。該發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步解釋了前期學(xué)者們?cè)诟缓瑺I(yíng)養(yǎng)的食物中的耐酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如álvarez-Ordó?ez等[20]將微酸誘導(dǎo)后的沙門(mén)氏菌接種在肉湯中，發(fā)現(xiàn)肉湯培養(yǎng)基能夠顯著延長(zhǎng)沙門(mén)氏菌在pH 3鹽酸中的存活時(shí)間；Waterman等[8]將沙門(mén)氏菌涂抹于富含蛋白質(zhì)的蛋清上也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。此外，有學(xué)者將沙門(mén)氏菌中PhoP/PhoQ的反應(yīng)調(diào)控蛋白PhoP結(jié)合磷酸基團(tuán)的天冬氨酸位點(diǎn)作為藥物作用的目標(biāo)，驗(yàn)證了藥物控制細(xì)菌毒力的可行性[35]，這提示可以通過(guò)破壞PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB的結(jié)構(gòu)或阻斷其作用途徑減弱沙門(mén)氏菌的ATR，增強(qiáng)殺菌劑效果，減少其對(duì)食品安全的危害。

3 結(jié) 論

本研究表明微酸誘導(dǎo)過(guò)程能顯著增強(qiáng)沙門(mén)氏菌的耐酸能力（P＜0.05），并且菌株的ATR一旦形成，在牛肉低溫貯藏（4 ℃）過(guò)程中可以維持至少7 d，其產(chǎn)生的交叉保護(hù)作用可能會(huì)嚴(yán)重威脅以牛肉為原料的下游產(chǎn)品的安全性。隨著貯藏保鮮技術(shù)的發(fā)展，冷鮮牛肉的貨架期也逐步延長(zhǎng)，沙門(mén)氏菌耐酸性的存續(xù)時(shí)間與不同包裝、貯藏方式下貨架期的關(guān)系仍待進(jìn)一步確定。微酸性肉質(zhì)介質(zhì)（pH 5.2～5.7）的低溫貯藏環(huán)境不能引發(fā)沙門(mén)氏菌的耐酸反應(yīng)，說(shuō)明低溫處理可以作為抑制沙門(mén)氏菌誘導(dǎo)ATR的方法?；蚯贸桶被崽砑訉?shí)驗(yàn)揭示了沙門(mén)氏菌的雙組分系統(tǒng)PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB均參與了外界酸性環(huán)境的感知，并可以通過(guò)調(diào)節(jié)精氨酸和賴氨酸的代謝水平提高細(xì)菌的耐酸性，因食品中豐富的氨基酸含量，該推論進(jìn)一步解釋了食品基質(zhì)在強(qiáng)酸環(huán)境下能為沙門(mén)氏菌提供保護(hù)的內(nèi)在機(jī)理。除PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB外，是否有其他組分系統(tǒng)參與沙門(mén)氏菌ATR的調(diào)控，以及這些系統(tǒng)能否通過(guò)酸休克蛋白和氨基酸代謝外的其他機(jī)制影響ATR仍待研究。