食品級(jí)Pickering乳液的穩(wěn)定性及β-胡蘿卜素的裝載研究

馮鑫，馬良,2，戴宏杰,3,付余，余永，朱瀚昆，王紅霞，張宇昊,2,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)2(西南大學(xué) 前沿交叉學(xué)科研究院，生物學(xué)研究中心，重慶 400715) 3(軟物質(zhì)材料化學(xué)與功能制造重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

由固體顆粒代替表面活性劑穩(wěn)定的乳液統(tǒng)稱Pickering乳液[1-2]。近年來(lái)，Pickering乳液由于低成本、環(huán)保、控制釋放、抗聚集和脂質(zhì)氧化等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品體系和包埋遞送體系中，例如功能性飲料、蛋黃醬、沙拉醬、冰淇淋以及面包等[3-5]，這對(duì)于產(chǎn)品風(fēng)味的改善和品質(zhì)的提升具有重要作用。在這些應(yīng)用中，Pickering乳液往往會(huì)進(jìn)行加熱、凍融等不同處理以滿足不同的消費(fèi)需求，這就要求Pickering乳液具有較高的穩(wěn)定性以抵抗外界環(huán)境[6]。Pickering乳液的穩(wěn)定性主要與液滴的特性密切相關(guān)，液滴間的相互作用是決定乳液穩(wěn)定性的最主要因素，劉洋[6]研究表明Pickering乳液的穩(wěn)定性受pH、離子強(qiáng)度、熱處理及凍融循環(huán)等多種因素影響。改變pH值，可以通過(guò)改變顆粒本身的電荷，進(jìn)而影響乳液的穩(wěn)定性。DESTRIBATS等[7]通過(guò)調(diào)節(jié)pH制備了不同的乳清蛋白顆粒以穩(wěn)定Pickering乳液，結(jié)果表明，在pH為3.0和7.0時(shí)，Pickering乳液液滴具有較小的尺寸，且穩(wěn)定性較高，在pH為4.7時(shí)(等電點(diǎn)左右)，液滴尺寸明顯增加且穩(wěn)定性降低。鹽離子可以通過(guò)靜電屏蔽作用影響乳液的穩(wěn)定。ZHU等[8]報(bào)道了由大豆蛋白顆粒穩(wěn)定Pickering乳液的液滴尺寸隨著NaCl的添加而增大，在100 mmol/L時(shí)液滴粒徑達(dá)到最大，隨著離子強(qiáng)度的進(jìn)一步增加(200～500 mmol/L)，液滴尺寸開(kāi)始逐漸減少至相對(duì)穩(wěn)定。Pickering乳液在經(jīng)過(guò)加熱或凍融處理時(shí)，可能會(huì)發(fā)生各種物理化學(xué)變化，包括結(jié)構(gòu)破壞、水結(jié)晶、生物聚合物構(gòu)象變化、冷凍濃縮和相分離現(xiàn)象等[9-10]，進(jìn)而影響乳液體系的質(zhì)地、結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性。ZHU等[11]制備了以小麥醇溶蛋白顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液，結(jié)果表明，高鹽(200和500 mM)和80 ℃預(yù)熱處理有助于在凍融循環(huán)中維持凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而有利于改善乳液的凍融穩(wěn)定性。GE等[12]制備了不同尺寸的淀粉顆粒以穩(wěn)定Pickering乳液，結(jié)果表明Pickering乳液經(jīng)過(guò)高溫(60～90 ℃)處理后，液滴尺寸有明顯的增加，乳液的穩(wěn)定性有所降低。因此，研究Pickering乳液的穩(wěn)定性對(duì)食品乳液體系具有十分重要的意義。

類(lèi)胡蘿卜素是最重要的天然色素之一，廣泛存在于蔬菜和水果中(胡蘿卜、西紅柿、辣椒等)，并提供人類(lèi)飲食中約70%的維生素A。研究表明，類(lèi)胡蘿卜素具有優(yōu)良的抗氧化和抗炎活性，在增強(qiáng)免疫力、抗癌、預(yù)防心血管疾病、保護(hù)視網(wǎng)膜和防止老年性黃斑變性等方面具有十分重要的作用[13]。因此，類(lèi)胡蘿卜素是一種極具發(fā)展前途的功能性天然色素，可作為抗氧化劑、著色劑、膳食補(bǔ)充劑等廣泛應(yīng)用于在食品、醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域。β-胡蘿卜素作為類(lèi)胡蘿卜素中最重要的一種，由于其較高的維生素A活性和優(yōu)異的抗氧化性能而受到越來(lái)越多的關(guān)注[14-15]。研究表明，β-胡蘿卜素降低了心血管疾病、皮膚病、癌癥和眼病等的風(fēng)險(xiǎn)且提供一定的保護(hù)作用[16-17]。然而，由于β-胡蘿卜素較低的水溶性、較高的熔點(diǎn)以及特殊的結(jié)構(gòu)，使其對(duì)光、熱、氧極為敏感，很容易發(fā)生光降解、氧化和異構(gòu)化等反應(yīng)，從而降低β-胡蘿卜素的生物活性，嚴(yán)重限制了β-胡蘿卜素在食品、醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用。目前，已經(jīng)報(bào)道證明乳液系統(tǒng)裝載β-胡蘿卜素的可行性[18-20]。與傳統(tǒng)乳液相比，Pickering乳液由于具有優(yōu)異的抗脂質(zhì)氧化和環(huán)保等性能可能更有利于β-胡蘿卜素的裝載。

在本課題組前期的研究中，我們以京尼平為交聯(lián)劑，制備了食品級(jí)的明膠納米顆粒(GNPs)[21]，并且通過(guò)調(diào)控GNPs的濃度來(lái)制備不同性質(zhì)的乳液[在0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) GNPs濃度下可制備黏度較低、流動(dòng)性和穩(wěn)定性較好的Pickering乳液，在1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) GNPs濃度下可制備黏度和穩(wěn)定性較高的Pickering乳液，在1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) GNPs濃度下可制備顯著黏彈性和穩(wěn)定性的Pickering乳液][22]。因此，本研究基于前期研究的基礎(chǔ)，以1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))GNPs穩(wěn)定50%(體積分?jǐn)?shù))油相的Pickering乳液為研究對(duì)象，進(jìn)一步研究了GNPs分散液中pH、離子強(qiáng)度以及加熱處理對(duì)Pickering乳液乳析指數(shù)(creaming index，CI)、尺寸及微觀結(jié)構(gòu)的影響。此外，將前期研究所得的3種性質(zhì)的乳液應(yīng)用于β-胡蘿卜素的裝載中，主要研究了β-胡蘿卜素在Pickering乳液中的保留率、游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)釋放以及生物可及性，以期為明膠基Pickering乳液對(duì)β-胡蘿卜素的裝載以及消化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

B型明膠(來(lái)源于豬皮)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

京尼平(HPLC ≥ 98%)，成都康邦生物科技有限公司；氫氧化鈉、無(wú)水乙醇,成都市科隆化學(xué)品有限公司；九三牌大豆油(未經(jīng)純化)，九三集團(tuán)；β-胡蘿卜素,上海Adamas試劑有限公司；脂肪酶,上海Macklin生化科技有限公司；胃蛋白酶(1∶10 000)，北京索萊寶科技有限公司；牛黃膽酸鈉,上海阿拉丁生化有限公司；氯化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、正己烷,成都市科隆化學(xué)品有限公司；氯化鈣，重慶市鈦新化工有限公司；所有的試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平(JA3003B),上海精天電子儀器有限公司;漩渦混合器(QL 901 Vortex),海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司;數(shù)顯恒溫?cái)嚢杷″?HH-4),上海新諾儀器設(shè)備有限公司;實(shí)驗(yàn)室酸度計(jì)(PE 20),上海梅特勒-托利多儀器有限公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Heraeus Multifuge X3R),美國(guó)賽默飛世爾科技公司;立式顯微鏡(BX53)日本OLYMPUS公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DGG-9140A),上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;超聲波清洗器(KQ-100B),昆山超聲儀器有限公司;高速分散器(T18),美國(guó)IKA公司;水浴恒溫振蕩器(SHZ-B),上海龍躍儀器設(shè)備有限公司;紫外分光光度計(jì)(UV-2450),日本島津公司。

1.3 明膠納米顆粒的制備

參考COESTER[23]先前報(bào)道的兩步去溶劑法并做適當(dāng)?shù)男薷囊灾苽銰NPs。簡(jiǎn)而言之，將1.25 g B型明膠溶解與25 mL水，并在40 ℃下攪拌至完全溶解。然后將25 mL乙醇作為脫溶劑試劑添加到明膠溶液中，反應(yīng)體系會(huì)出現(xiàn)分層現(xiàn)象，分離得到的下層澄清液為較高相對(duì)分子質(zhì)量的明膠。然后再將其溶解到100 mL水中，并用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為12，使明膠分子遠(yuǎn)離等電點(diǎn)。隨后，在恒定攪拌速度下緩慢滴加乙醇將明膠再次去溶劑化，直至形成乳白色分散體。為了得到交聯(lián)的GNPs，向該分散液中加入10%的京尼平溶液，然后在37 ℃下攪拌3 h進(jìn)行交聯(lián)。最后在10 000×g下離心20 min得到沉淀物，用乙醇清洗后再用20 000×g離心后收集沉淀物，重復(fù)清洗3次，后用氮?dú)獯蹈桑? ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Pickering乳液的制備

根據(jù)之前的研究確定油相體積(φ=50%)[21]，以制備穩(wěn)定的Pickering乳液。將3 mL 的GNPs分散液放入10 mL離心管中，并將3 mL大豆油緩慢地添加到分散液中。然后，使用均質(zhì)機(jī)以15 000 r/min的速度將混合物均質(zhì)1 min，以獲得Pickering乳液。

1.5 顯微鏡和外觀測(cè)定

使用移動(dòng)相機(jī)獲取乳液的照片，以評(píng)估宏觀相行為，從而評(píng)估其穩(wěn)定性。為了進(jìn)一步觀察乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)，將Pickering乳液(20 μL)放置在載玻片上，并用蓋玻片覆蓋。使用立式光學(xué)顯微鏡獲取顯微鏡圖像。實(shí)驗(yàn)在25 ℃下進(jìn)行。

1.6 Pickering乳液的穩(wěn)定性測(cè)定

1.6.1 pH穩(wěn)定性

用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)1.0% GNPs分散液的pH至 3、5、7、9，測(cè)定pH對(duì)Pickering乳液(6 mL, 50 %油相)穩(wěn)定性的影響。然后用上述方法測(cè)定GNPs分散液的外觀，以及Pickering乳液的外觀和微觀結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)在25 ℃下進(jìn)行。

1.6.2 離子強(qiáng)度穩(wěn)定性

向1.0% GNPs分散液加入NaCl，使得分散液的離子強(qiáng)度為0、50、100、300和500 mmol/L，測(cè)定離子強(qiáng)度對(duì)Pickering乳液(6 mL, 50%油相)穩(wěn)定性的影響。然后用上述方法測(cè)量GNPs分散液的外觀，以及Pickering乳液的外觀、乳析指數(shù)(CI)和微觀結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)在25 ℃下進(jìn)行。CI按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：Hs是乳液析出水的高度，He是乳液的總高度。

1.6.3 熱穩(wěn)定性

將新鮮的Pickering乳液(6 mL, 1.0% GNPs，50%油相)置于離心管中，然后分別于70 ℃和100 ℃水浴中加熱不同的時(shí)間(0、5、10、15和20 min)，冷卻至25 ℃。用上述方法測(cè)量Pickering乳液的外觀，CI和微觀結(jié)構(gòu)。

1.6.4 凍融穩(wěn)定性

凍融循環(huán)由凍融期和解凍期組成。在冷凍過(guò)程中，將新鮮制備的Pickering乳液(6 mL, 0.3%～2.0% GNPs，50%油相)置于平底玻璃瓶(直徑=18 mm；高度=40 mm)中，在-20 ℃下恒溫保存24 h，然后將冷凍的樣品轉(zhuǎn)移到30 ℃的烘箱中解凍2 h，完全解凍后對(duì)凍融樣品的外觀進(jìn)行表征。

1.7 β-胡蘿卜素在體外消化過(guò)程中的穩(wěn)定性和生物可及性測(cè)定

1.7.1 β-胡蘿卜素Pickering乳液的制備

參考LIU等[24]報(bào)道的方法制備裝載β-胡蘿卜素的Pickering 乳液。首先，將β-胡蘿卜素溶于大豆油中(1 mg/mL), 超聲處理5 min，以確保β-胡蘿卜素完全溶解。然后參考方法1.4制備 Pickering乳液。

1.7.2 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確稱量1 mg β-胡蘿卜素，用正己烷溶液定容至10 mL，即為0.1 mg/mL的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取1，2，3，4，5 mL β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10 mL容量瓶中，用正己烷溶液定容至10 mL，于450 nm測(cè)定其吸光值。用吸光度對(duì)β-胡蘿卜素濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=4.625x-0.017 8,R2=0.996 5)。

1.7.3 β-胡蘿卜的保留率

將裝載β-胡蘿卜素的Pickering乳液分別裝在10 mL的平底瓶中，密封保存在4 ℃和25 ℃的開(kāi)放環(huán)境中(未避光)，間隔一定時(shí)間取出，測(cè)定Pickering乳液中β-胡蘿卜素的含量。β-胡蘿卜素含量的測(cè)定參照YUAN等[25]的方法：每個(gè)樣品取出0.5 mL于10 mL離心管中，然后分別加入2 mL無(wú)水乙醇和3 mL正己烷，在漩渦混合器上充分振蕩使乳液完全破乳，再靜置10 min使得正己烷相和乙醇相分離，將上層的正己烷吸出并收集。然后再添加3 mL正己烷重復(fù)上述操作，合并正己烷。最后用紫外分光光度計(jì)在450 nm處測(cè)定吸光度。并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算β-胡蘿卜素的含量。β-胡蘿卜素的保留率用Ct/C0表示，其中Ct表示在相應(yīng)溫度下儲(chǔ)藏t天后β-胡蘿卜素的濃度，C0表示原始Pickering乳液中β-胡蘿卜素的濃度。

1.7.4 β-胡蘿卜素的模擬體外消化模型

模擬胃液(simulated gastric fluid，SGF)的配制：2 mg/mL NaCl、7 mL/L HCl、3.2 mg/mL 胃蛋白酶，所有組分用超純水配制。

模擬腸液(simulated intestinal fluid，SIF)的配制：鹽溶液(36.7 mg/mL CaCl2、218.7 mg/mL NaCl)、24 mg/mL脂肪酶、54 mg/mL 膽鹽、其中鹽溶液用超純水配制，脂肪酶和膽鹽用5 mmol/L PBS (pH=7.0)配制。

模擬SGF消化：將SGF在37 ℃預(yù)熱5 min，取7.5 mL乳液加入到7.5 mL的胃液中。用1 moL/L NaOH迅速將混合體系pH調(diào)整至2.5，于37 ℃恒溫?fù)u床(100 r/min)消化2 h。

模擬SIF消化：乳液在胃液中消化完成后，用0.5 mol/L NaOH迅速將混合體系pH調(diào)整至7.0。將SIF在37 ℃預(yù)熱5 min，依次將1.5 mL的鹽溶液、3.5 mL的膽鹽溶液、2.5 mL的脂肪酶溶液加入到上述胃消化液中。最后于37 ℃恒溫?fù)u床(100 r/min)消化2 h。期間不斷用0.5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)混合體系中的pH維持在7.0。

1.7.5 脂質(zhì)消化

參考TAN等[26]的方法進(jìn)行脂質(zhì)消化實(shí)驗(yàn)。從乳液中釋放的游離脂肪酸含量(FFA)由所用的0.5 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的量計(jì)算得出。通過(guò)公式(2)計(jì)算消化過(guò)程中釋放的FFA：

(2)

式中:CNaOH，NaOH溶液的摩爾濃度，mol/L；VNaOH，所用NaOH溶液的體積，L；M大豆油，該油的平均分子質(zhì)量(880)，g/mol；m大豆油，所用大豆油的總質(zhì)量，g。

1.7.6 β-胡蘿卜素生物可及性的測(cè)定

β-胡蘿卜素生物可及性的測(cè)定參考LIU等[27]的方法，將消化后的混合物在4 ℃下用15 000×g離心30 min，理論上混合物將分為3層，上層為未消化的油脂，中間即為所需的膠束層，下層為難以消化或者未消化的固形物。β-胡蘿卜素的生物可及性用公式(3)計(jì)算。

β-胡蘿卜素的生物可及性/%

(3)

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立進(jìn)行3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。利用SPSS Statistics 17.0和Origin 8.0軟件進(jìn)行顯著性分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pickering乳液的pH穩(wěn)定性分析

不同pH(9, 7, 5, 3)下GNPs穩(wěn)定Pickering乳液的外觀和微觀結(jié)構(gòu)(光學(xué)顯微鏡)如圖1所示。相對(duì)于對(duì)照組(未調(diào)節(jié)pH，約為11)，在pH為5或3時(shí)，GNPs分散液發(fā)生了肉眼可見(jiàn)的聚集，尤其是在pH為5時(shí)聚集最為嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)絮狀物。光鏡圖顯示，在pH為5時(shí)，乳液發(fā)生了嚴(yán)重的相分離，僅有少量乳液被保留，隨著GNPs分散液的pH偏離5，液滴尺寸明顯減小。這可能是因?yàn)镚NPs的等電點(diǎn)為5左右，GNPs尤其是連續(xù)相中的顆粒發(fā)生聚集，不利于顆粒在界面的吸附，導(dǎo)致乳液析水并發(fā)生絮凝現(xiàn)象，降低乳液的穩(wěn)定性。偏離等電點(diǎn)時(shí)，由于較強(qiáng)的靜電排斥作用而使分散液維持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，進(jìn)而有利于顆粒在油水界面的吸附，并且乳液未出現(xiàn)破乳現(xiàn)象，表明吸附在界面上的顆粒具有較高的穩(wěn)定性[28]。因此，GNPs分散液在pH大于7的條件下制備的Pickering乳液更穩(wěn)定。

A-外觀；B-光學(xué)顯微鏡圖1 不同pH值對(duì)明膠穩(wěn)定Pickering乳液的影響Fig.1 Effect of different pH on the gelatin-stabilized Pickering emulsion

2.2 Pickering乳液的離子強(qiáng)度穩(wěn)定性分析

不同離子強(qiáng)度(0, 50, 100, 300和500 mmol/L)下GNPs穩(wěn)定 Pickering乳液的外觀和微觀結(jié)構(gòu)如圖2所示。由圖2可得，當(dāng)離子強(qiáng)度為50 mmol/L時(shí)，乳液的CI和液滴粒徑均有所增加，隨著離子強(qiáng)度的進(jìn)一步增加(100～500 mmol/L)，CI和液滴粒徑略有改善并保持穩(wěn)定。這可能是因?yàn)榈碗x子強(qiáng)度下，離子通過(guò)靜電作用屏蔽了顆粒的表面電荷，降低顆粒與顆粒之間的排斥作用，促進(jìn)了顆粒的聚集，不利于顆粒在油滴表面的吸附及重排，從而導(dǎo)致液滴粒徑增加以及水層的產(chǎn)生[29]。隨著離子強(qiáng)度的增加(100～500 mmol/L)，滲透壓增加，乳液的保水性增加，因此CI逐漸減小并保持相對(duì)穩(wěn)定。離子強(qiáng)度的增加(100～500 mmol/L)，可能降低了GNPs的擴(kuò)散速率，但由于表面電荷增加，促使更多的顆粒吸附到油水界面并參與了界面的穩(wěn)定，賦予乳液較強(qiáng)的粘彈性膜和更高的界面壓力，改善了液滴間的相互作用，使得液滴尺寸相對(duì)減小，乳液變得相對(duì)穩(wěn)定[30-31]。這一現(xiàn)象與ZHU等[8]的研究類(lèi)似，由大豆蛋白顆粒穩(wěn)定Pickering乳液的液滴尺寸隨著NaCl的添加而增大，在100 mmol/L時(shí)液滴粒徑達(dá)到最大，隨著離子強(qiáng)度的進(jìn)一步增加(200～500 mmol/L)，乳液液滴的粒徑開(kāi)始減少至穩(wěn)定。

A-外觀；B-電位和CI；C-光學(xué)顯微鏡圖2 不同離子強(qiáng)度對(duì)明膠穩(wěn)定Pickering乳液的影響Fig.2 Effect of different ionic strength on the gelatin-stabilized Pickering emulsion注：圖中不同的小寫(xiě)字母表示有顯著性差異(P<0.05)

2.3 Pickering乳液的熱穩(wěn)定性分析

經(jīng)過(guò)不同溫度(70 ℃, 100 ℃)和時(shí)間(0、5、10、15、20 min)處理后的Pickering乳液的外觀和微觀如圖3所示。乳液經(jīng)過(guò)70 ℃或100 ℃處理后，出現(xiàn)明顯的水層，且CI隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。光鏡圖結(jié)果顯示，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，液滴間隙明顯增大，且液滴尺寸也隨之增加。明膠顆粒的非共價(jià)作用以氫鍵為主，加熱處理可能導(dǎo)致氫鍵的破壞，從而使連續(xù)相中顆粒形成的緊密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，液滴間隙變大，持水能力下降，從而導(dǎo)致水層的產(chǎn)生以及CI的增加。另一方面，加熱處理還促進(jìn)部分油滴發(fā)生聚集使得液滴尺寸增加[32]。總體來(lái)看，Pickering乳液經(jīng)過(guò)加熱殺菌處理后，雖然有一定的析水，但不會(huì)導(dǎo)致破乳，因此乳液可以耐受高溫處理。

A-外觀和CI；B-光學(xué)顯微鏡圖3 不同熱處理溫度對(duì)明膠穩(wěn)定Pickering乳液的影響Fig.3 Effect of different heat treatment temperature on the gelatin-stabilized Pickering emulsion注：圖中不同的小寫(xiě)字母表示有顯著性差異(P<0.05)

2.4 Pickering乳液的凍融穩(wěn)定性分析

不同GNPs濃度(0.3%～2.0%)穩(wěn)定的Pickering乳液凍融穩(wěn)定性如圖4所示。由圖所示，所制備的乳液經(jīng)過(guò)一次凍融后即發(fā)生嚴(yán)重的破乳現(xiàn)象，且隨著濃度的增加(0.3%～2.0%)，破乳現(xiàn)象沒(méi)有明顯的改善，表明乳液的凍融穩(wěn)定性較差。這可能是因?yàn)槊髂z顆粒之間形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)主要靠氫鍵維系，乳液在冷凍條件下，形成了冰晶，造成了明膠顆粒的脫水，從而影響了明膠顆粒之間氫鍵的平衡，而蛋白之間的共價(jià)交聯(lián)可能并不足以單獨(dú)維系明膠網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定，因此顆粒之間形成的網(wǎng)絡(luò)崩潰，界面膜被破壞，乳液破乳。因此，如何進(jìn)一步提高明膠納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液的凍融穩(wěn)定性是未來(lái)需要進(jìn)一步研究的方向之一。

2.5 Pickering乳液的pH穩(wěn)定性分析負(fù)載β-胡蘿卜素乳液的外觀

負(fù)載β-胡蘿卜的Pickering乳液素在不同儲(chǔ)藏溫度下(4 ℃, 25 ℃)的外觀如圖5所示。隨著GNPs濃度(0.5%～1.5%)的增加，負(fù)載β-胡蘿卜素的Pickering乳液的灰藍(lán)色逐漸加深。4 ℃下儲(chǔ)藏30 d后，流動(dòng)性較好的乳液(0.5% GNPs)有輕微的β-胡蘿卜素析出，黏度較高的乳液(1.0% GNPs)和高黏彈性的乳液(1.5% GNPs)仍然表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性。然而，25 ℃下儲(chǔ)藏20 d后，流動(dòng)性較好的乳液(0.5% GNPs)發(fā)生明顯的相分離現(xiàn)象，黏度較高的乳液(1.0% GNPs)也產(chǎn)生輕微的相分離，而高粘彈性的乳液(1.5% GNPs)仍具有較高的穩(wěn)定性。

圖4 凍融處理對(duì)明膠穩(wěn)定Pickering乳液的影響Fig.4 Effect of freezing-thawing treatment on the gelatin-stabilized Pickering emulsion

圖5 不同儲(chǔ)藏溫度對(duì)負(fù)載β-胡蘿卜素Pickering乳液的影響Fig.5 Effect of different storage temperatures on the Pickering emulsion loaded with β-carotene

2.6 Pickering乳液裝載β-胡蘿卜素的保留率分析

Pickering乳液負(fù)載β-胡蘿卜素在不同儲(chǔ)藏溫度下(4 ℃, 25 ℃)的保留率如圖6所示。由圖6可得，β-胡蘿卜素在儲(chǔ)存過(guò)程中都有一定程度的降解。在4 ℃ 條件下儲(chǔ)藏30 d后，3種性質(zhì)的乳液仍可保留70%以上的β-胡蘿卜素。高黏彈性(1.5% GNPs)和黏度較高(1.0% GNPs)的乳液對(duì)β-胡蘿卜素具有更好的保護(hù)作用，但兩者之間沒(méi)有明顯的差異。而流動(dòng)性較好的乳液(0.5% GNPs)對(duì)β-胡蘿卜素的保護(hù)作用明顯不如前兩者，與外觀圖一致。然而，乳液在25 ℃下儲(chǔ)藏20 d后即損失了約60%的β-胡蘿卜素。高黏彈性乳液對(duì)β-胡蘿卜素的保護(hù)作用明顯高于其他2種乳液?？赡艿脑蚴歉唣椥匀橐壕哂懈泳o密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、較厚的界面吸附層以及高黏度，抑制了β-胡蘿卜素的降解。另一方面，由GNPs穩(wěn)定的Pickering乳液顯示出灰藍(lán)色，且隨著GNPs濃度的增加，灰藍(lán)色逐漸加深(圖5)，這可能對(duì)β-胡蘿卜素的光降解也有一定的抑制作用。再者，β-胡蘿卜素的降解隨著儲(chǔ)藏溫度的增加而加快，可能的原因是溫度升高增加了乳液的流動(dòng)性，促進(jìn)了β-胡蘿卜素的降解，不利于乳液對(duì)β-胡蘿卜素的保護(hù)[25]?？傮w而言，高黏彈性的Pickering乳液可能更適合于β-胡蘿卜素的包埋遞送。

圖6 不同儲(chǔ)藏溫度對(duì)β-胡蘿卜素保留率的影響(大豆油作為對(duì)照)Fig.6 Effect of different storage temperature on the retention rate of β-carotene (soybean oil as control)

2.7 Pickering乳液裝載β-胡蘿卜素的體外消化特性

乳液經(jīng)過(guò)胃部消化后到達(dá)腸液，此時(shí)釋放的油滴與脂肪酶接觸后分解成游離脂肪酸(FFA)，油滴中負(fù)載的活性成分才可以被釋放，從而被上皮細(xì)胞消化吸收。因此，研究乳液的FFA釋放對(duì)于活性成分的吸收具有重要的指導(dǎo)意義。負(fù)載β-胡蘿卜素的Pickering乳液的(FFA)釋放曲線如圖7所示。由圖7可得，F(xiàn)FA釋放發(fā)生在腸液消化的整個(gè)階段，且隨著消化時(shí)間的增加，F(xiàn)FA釋放量逐漸增加。經(jīng)過(guò)2 h模擬消化后，對(duì)照組的FFA釋放量高達(dá)60%，流動(dòng)性好的乳液的FFA釋放量約為45%，明顯低于對(duì)照組，并且隨著GNPs濃度的增加，F(xiàn)FA釋放速率和釋放量逐漸減少，保持在30%左右，并且高黏彈性乳液的FFA明顯低于其他組，可能的原因是高黏彈性的Pickering乳液具有更加致密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，較厚的界面吸附層以及相對(duì)較高的黏度，一定程度上阻礙了油滴與脂肪酶的接觸，從而導(dǎo)致FFA的釋放速率和釋放量的減少[26]。

A-FFA;B-生物可及性圖7 Pickering乳液的FFA和生物可及性(大豆油作為對(duì)照)Fig.7 The FFA and bio-accessibility of Pickering emulsion (soybean oil as control)注：圖中不同的小寫(xiě)字母表示有顯著性差異(P<0.05)

活性物質(zhì)的生物可及性是指攝入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)過(guò)消化后能提供給人體吸收部分的比例，也就是經(jīng)過(guò)胃腸消化后可被小腸上皮細(xì)胞吸收的比例。在模擬小腸中的消化過(guò)程結(jié)束時(shí)，將經(jīng)過(guò)腸液消化后的混合物離心，混合物分為3層，上層為未消化的油相，中間為膠束層，下層為固形物。收集膠束層以確定Pickering乳液中β-胡蘿卜素的生物可及性。結(jié)果表明，β-胡蘿卜素的生物可及性隨著GNPs濃度的增加而增加，尤其是在1.5% GNPs濃度下制備的高黏彈性乳液，顯示了最大的生物可及性(40%)，可能的原因是高粘彈性乳液具有較緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、相對(duì)較高的黏度和良好的不易流動(dòng)性，一定程度上減少了釋放油滴在消化過(guò)程中的聚集，增加了β-胡蘿卜素在膠束相的保留量。流動(dòng)性較好的乳液網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對(duì)疏松，釋放的油滴可以聚集成大油滴，不利于β-胡蘿卜素在膠束相中的保留。另一方面，高粘彈性乳液的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也有利于抑制了β-胡蘿卜素的降解[33]。因此，高粘彈性的Pickering乳液可顯著增加β-胡蘿卜素的生物可及性。

3 結(jié)論

(1)GNPs分散液的pH大于7時(shí)，由于較強(qiáng)的靜電斥力，使得Pickering乳液具有較高的穩(wěn)定性，但在酸性條件下穩(wěn)定性較差；NaCl的添加導(dǎo)致靜電屏蔽的產(chǎn)生，使得液滴尺寸和CI增加(0～50 mmol/L)，隨著NaCl的進(jìn)一步增加(100～500 mmol/L)，由于表面電荷增加，改善了液滴間的相互作用，使得液滴尺寸相對(duì)減小并保持穩(wěn)定；乳液經(jīng)過(guò)加熱(70 ℃和100 ℃)處理后，導(dǎo)致液滴尺寸和CI增加，但乳液并未出現(xiàn)破乳現(xiàn)象；凍融過(guò)程中，冰晶的形成破壞了界面膜以及明膠顆粒通過(guò)氫鍵形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),使得Pickering乳液不耐凍融。

(2)3種性質(zhì)的Pickering乳液對(duì)裝載的β-胡蘿卜素的穩(wěn)定性表現(xiàn)出優(yōu)異的保護(hù)作用，甚至經(jīng)過(guò)30 d的儲(chǔ)藏，仍有70%以上的β-胡蘿卜素被保留。

(3)體外消化研究表明，高黏彈性的乳液由于具有較高的黏度、較厚的界面吸附層以及致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，抑制了脂肪酶接觸油脂，從而降低了FFA的釋放速度和釋放量。此外，Pickering乳液的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)抑制了β-胡蘿卜素的降解，減輕了油滴的聚集，從而增加β-胡蘿卜素的生物可及性。