普通煙草WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族的全基因組鑒定及分析

李曉旭 ，郭存，蒲文宣，劉萬峰，張銀霞，孫楠，何鑫璽，劉成，許良濤，高軍平*

1 湖南中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心，長沙市勞動中路386號 410007；2 中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11號 266101；3 曲靖市煙草公司，曲靖市麒麟?yún)^(qū)官坡巷51號 655000

WOX（WUSCHEL-related homeobox，WOX）轉(zhuǎn)錄因子家族是植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子家族[1]。WOX轉(zhuǎn)錄因子家族是同源異型盒超家族的一個亞家族，其成員均含有一段 60～66個氨基酸組成的典型同源異型結(jié)構(gòu)域（homeodomain），其同源異型結(jié)構(gòu)域具有典型的helix-loop-helix-turn-helix的結(jié)構(gòu)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，從50個物種中鑒定出350多個具有典型同源異型結(jié)構(gòu)域的WOX轉(zhuǎn)錄因子，進化分析發(fā)現(xiàn)這些WOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員形成了三個分支（clade）[3]。其中現(xiàn)代進化分支（modern clade）又稱為 WUS進化支（WUS clade），其成員僅來自高等的種子植物；中間進化分支（intermediate clade）中僅含有來自維管植物中的WOX成員；而在古代進化分支（ancient clade）中含有包括古老藻類在內(nèi)的所有物種的WOX家族成員[3]。

在植物中，WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員參與植物的組織器官的起始、形態(tài)建成和分生組織中干細胞穩(wěn)態(tài)等多種生物學過程調(diào)控[1,4]。在擬南芥中，鑒定了AtWUS 和AtWOX5 等15 個WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員[5]。值得注意的是，AtWUS 基因的缺失突變體wus-1 因種子萌發(fā)后相當長時間內(nèi)沒有真葉出現(xiàn)而被首次鑒定到[6]。同時，wus-1 突變體在其整個生命周期中表現(xiàn)為生長點消失，走走停停（stop-and-go），花器官數(shù)量減少且異常[6]。進一步研究表明WUS 基因在莖頂端分生組織（shoot apical meristem，SAM）的組織中心（Organizing Center, OC）特異性表達，而在wus-1 突變體中，干細胞加速分化進而導致生長點消失[6]。因此，在擬南芥中，轉(zhuǎn)錄因子AtWUS 的功能是維持莖頂端分生組織中干細胞的數(shù)目和特性，抑制干細胞的分化[6-8]。同時，AtWOX5 基因在根頂端分生組織（root apical meristem，RAM）中的靜止中心（Quiescent Centre，QC）中表達，研究表明WOX5 功能與WUS 類似，在RAM 中維持干細胞的數(shù)目和特性，抑制干細胞的分化[9-11]。此外，AtWOX4/AtWOX14 在擬南芥維管干細胞分化中起重要作用[12-13]。研究表明，在胚胎發(fā)育過程中AtWOX2/AtWOX8 共同調(diào)節(jié)頂端基軸的形成[14]。研究發(fā)現(xiàn)，AtWOX8 和AtWOX9 能夠促進胚胎細胞分裂[14-16]。此外報道 AtWOX13 在果實的發(fā)育和形成中發(fā)揮作用[17]。

煙草是一種經(jīng)濟作物，其生長發(fā)育過程對煙草株型和產(chǎn)量起重要作用，同時煙草頂端分生組織和側(cè)生分生組織發(fā)育分子調(diào)控的研究具有重要的理論意義和實踐價值。在煙草中，B3、SBP、RLP、KNOX 和Aux/IAA 等與生長發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)的基因家族已經(jīng)被分析鑒定[18-22]。本研究利用比較基因組學和生物信息學的方法，對煙草基因組的WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員進行鑒定、系統(tǒng)進化分析、共線性分析、保守基序分析、基因表達分析和GO 注釋分析。本研究為煙草分生組織發(fā)育的分子調(diào)控和WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員的功能解析提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

栽培煙草K326 保存并種植于煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點實驗室，在現(xiàn)蕾期采集煙草莖尖、莖、根尖、根、葉片5 個組織，液氮迅速冷凍后放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RNAiso Plus 提取試劑盒、PrimeScript 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Ex Taq 熒光定量試劑盒均購自大連寶生物公司。熒光定量PCR 儀ABI 7500 購自ABI 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 煙草WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定及序列分析

根據(jù)文獻報道[5,23,24]，利用擬南芥TAIR 數(shù)據(jù)庫（http://www.arabidopsis.org/）和茄科基因組數(shù)據(jù)庫（http://solgenomics.net/），下載擬南芥、番茄和馬鈴薯WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員的蛋白序列。使用MAFFT，在默認參數(shù)下對下載的序列進行多序列比對。基于序列比對結(jié)果，使用HMMER v3.0 建立HMM 檢索譜（HMM profile）。在茄科植物數(shù)據(jù)庫下載普通煙草K326 蛋白序列數(shù)據(jù)庫，使用所建立的HMM 檢索譜對煙草蛋白序列數(shù)據(jù)庫在默認參數(shù)下進行檢索，獲得候選序列。利用Pfam（http://pfam.sanger.ac.uk/）對候選序列蛋白結(jié)構(gòu)域進行分析，去除不含同源異型結(jié)構(gòu)域的候選序列。利用ProtParam（http://expasy.org/）對所鑒定的WOX 家族成員蛋白序列進行分子量和等電點分析。

1.2.2 多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

參考文獻[23]，提取擬南芥和鑒定的煙草WOX家族成員的蛋白全長序列，使用MAFFT 在默認參數(shù)下進行多序列比對。選取同源異型結(jié)構(gòu)域，使用Texshade 將多序列結(jié)果進行可視化展示?；跀M南芥、番茄、馬鈴薯和普通煙草WOX 蛋白多序列比對的結(jié)果，使用MGEA v6.06 重構(gòu)鄰接樹（Neighbor-Joining, NJ tree），參數(shù)設(shè)置為：Poisson Model 和Pairwise Deletion 進行分析，Bootstrap 檢驗設(shè)為1000 次。利用Tree View v1.4.2 對構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹進行可視化展示。

1.2.3 染色體定位及復制事件分析

利用茄科植物數(shù)據(jù)庫（http://solgenomics.net/），提取所鑒定的煙草WOX 轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的染色體定位信息。參考文獻[25]，對煙草WOX 基因串聯(lián)重復事件進行進行鑒定，利用Circos 對染色體定位信息和串聯(lián)重復事件進行可視化展示。參考文獻[26]，利用McScan X 對煙草基因組進行分析，對煙草WOX 基因全基因組復制重復事件進行鑒定，利用Circos 將其進行可視化展示。

1.2.4 共線性分析

在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫和茄科基因組數(shù)據(jù)庫分別下載擬南芥和普通煙草K326 基因組注釋信息。參考文獻[26]，利用McScan X 在默認參數(shù)下進行擬南芥和普通煙草基因組的共線性分析，使用TBtools 將共線性分析結(jié)果進行可視化展示。

1.2.5 保守基序分析

使用Multiple Expectation Maximization for Motif Elicitation（MEME）對WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員的蛋白序列的保守基序（motif）進行分析，參數(shù)設(shè)置為：maximum number of motifs 設(shè)定為10，motif width 設(shè)定為≥6 and ≤100，并且選擇zero or one per sequence 模式。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的處理與結(jié)果分析

參考文獻[19]，利用NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）下載轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)（SRP029183），利用Tophat 和Cuラink 等程序分析轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)并進行表達量計算，提取NtWOX 基因家族成員編碼基因的表達數(shù)據(jù)，將表達數(shù)據(jù)標準化后，使用R 語言pheatmap 程序繪制熱圖（Heatmap），將表達數(shù)據(jù)可視化。

1.2.7 煙草RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄

將采集的普通煙草各組織樣品從-80℃冰箱取出，在液氮中研磨成粉末。使用RNAiso 試劑盒提取總RNA 并去除基因組DNA，使用PrimeScript 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA 稀釋至25 ng/μL待用。

1.2.8 表達模式分析

根據(jù)NtWUSa 和NtWOX5a 基因的CDS 序列，利用Primer premier 5 設(shè)計特異性熒光定量檢測引物。NtWUSa 基因上游特異性引物序列：5'- GTCCATCA GCTTCTTCTCATGGTGTA -3'，下游特異性引物序列：5'- AGCAGAGGCTCTTTGGTAATTTTCTT -3'。NtWOX5a 基因上游特異性引物序列：5'- GAATGT CAGGGTTTTCGGTGAGGGCA -3'，下游特異性引物序列：5'- AGCTAAGTTGGGAAGATATTTTTTGT -3'。參考文獻[27]，采用普通煙草26S rRNA 基因作為管家基因。各個組織進行3 次生物學重復，每組生物學重復為獨立樣本并單獨提取 RNA，同時熒光定量實驗設(shè)置3 次技術(shù)性重復。基于2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

1.2.9 基因本體論注釋分析

參考文獻[23]，基于擬南芥和所鑒定的普通煙草WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白全長序列，利用Blast2GO在默認參數(shù)下進行比對，并完成基因本體論（Gene Ontology，GO）注釋。通過WEGO 工具分析注釋結(jié)果并完成可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 煙草WOX 轉(zhuǎn)錄因子鑒定及其理化性質(zhì)分析

根據(jù)已報道的擬南芥、番茄和馬鈴薯中WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員的蛋白序列，構(gòu)建隱馬爾可夫模型序列譜并檢索煙草蛋白數(shù)據(jù)庫。通過Pfam 對候選序列進行結(jié)構(gòu)域分析，去除不含同源異型結(jié)構(gòu)域的候選序列，最終在煙草基因組中鑒定得到23 個煙草WOX轉(zhuǎn)錄因子編碼基因。

參考文獻[5]，對新鑒定的WOX 轉(zhuǎn)錄因子進行命名。基于普通煙草和擬南芥WOX 轉(zhuǎn)錄因子蛋白全長多序列比對結(jié)果，重建鄰接樹。基于染色體定位信息和鄰接樹的進化關(guān)系，對新鑒定的番茄WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員進行命名（表1）。理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，新鑒定的煙草WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員之間理化性質(zhì)存在一定的差異，氨基酸的長度在87～380 aa 之間，蛋白分子量則介于10.48～41.86 kDa 之間，蛋白理論等電點在5.15～10.04 之間（表1）。

表1 普通煙草WOX 轉(zhuǎn)錄家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析Tab. 1 Identification and physicochemical properties analysis of the WOX transcription factor family in tobacco

續(xù)表1

圖1 普通煙草WOX 轉(zhuǎn)錄因子同源異型結(jié)構(gòu)域分析Fig. 1 The homeodomain domain analysis of WOX family members in tobacco

2.2 同源異型結(jié)構(gòu)域的鑒定和分析

基于已報道擬南芥WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員和新鑒定的煙草WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員的蛋白全長序列，在默認參數(shù)下，使用MAFFT 完成多序列比對，利用Texshade 將結(jié)果可視化，紫色代表完全保守的氨基酸，紅色/藍色代表高度保守的氨基酸（圖1）。結(jié)果表明，普通煙草WOX 家族成員和擬南芥WOX家族成員的同源異型結(jié)構(gòu)域高度相似且較為保守，均為60 個或者61 個氨基酸殘基所構(gòu)成的螺旋-環(huán)- 螺 旋- 轉(zhuǎn) 角- 螺 旋（helix-loop-helix-turn-helix）結(jié)構(gòu)。研究報道了WOX 家族成員同源異型結(jié)構(gòu)域中保守的位點，包括helix1 中的Q8、L12 以及helix3 中V47、W50、F51、Q52、N53、和R57 等。研究發(fā)現(xiàn)，在普通煙草WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員中，這8 個位點同樣高度保守。值得注意的是，AtWUS、NtWUSa和NtWUSb 同源異型結(jié)構(gòu)域由61 個氨基酸殘基組成，并且在其同源異型結(jié)構(gòu)域中多出了一個Y 殘基（Y16），說明該殘基可能對WUS 類轉(zhuǎn)錄因子功能起著重要的作用。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

為了研究普通煙草WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族的進化關(guān)系，對煙草、番茄、馬鈴薯和擬南芥WOX 轉(zhuǎn)錄因子蛋白全長序列進行多序列比對?；诒葘Y(jié)果，利用MEGA 構(gòu)建鄰接樹（圖2）。進化分析結(jié)果表明，普通煙草、番茄、馬鈴薯和擬南芥WOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員形成了3 個進化支（Clade）和9個亞家族（Subgroup）?，F(xiàn)代進化支中有WUS 和WOX1-5 共6 個亞家族，中間進化支包含了WOX9和WOX11 兩個亞家族，而古老進化支（Ancient clade）包含了WOX13 亞家族。值得注意的是，除了WOX4 亞家族，其余亞家族中均含有擬南芥和煙草中的成員，這表明了煙草和擬南芥的物種分化時間要晚于WOX 家族成員的分化時間。同時，在不同亞家族中，擬南芥和番茄WOX 家族成員的數(shù)目差異較大。在WOX3 亞家族中，煙草有NtWOX3a-NtWOX3h 共計8 個WOX 家族成員，而擬南芥只有一個成員AtWOX3 位于該亞家族中。另外，在WOX13 亞家族中，擬南芥AtWOX13、AtWOX10 和AtWOX14 位于該亞家族中，而煙草有NtWOX13a-NtWOX13d 共計4 個成員。以上結(jié)果表明，在普通煙草和擬南芥物種分化后，WOX3 和WOX13 等亞家族經(jīng)歷了不同的進化事件。

圖2 普通煙草WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)進化分析Fig .2 The phylogenetic analysis of WOX family genes in tobacco

2.4 普通煙草NtWOX 基因共線性分析

圖3 普通煙草和擬南芥WOX 基因的共線性分析Fig. 3 The syntenic analysis of WOX genes between tobacco and Arabidopsis

為了進一步解析NtWOX 家族的進化關(guān)系，利用McScan X 在默認參數(shù)下對擬南芥基因組和普通煙草K326 基因組進行共線性分析（圖3）。Chr1-Chr5分別代表擬南芥5 條染色體，Nt01-Nt24 代表普通煙草24 條染色體。結(jié)果表明，普通煙草NtWOX2a 基因與擬南芥AtWOX2 基因，普通煙草NtWOX5a 基因與擬南芥AtWOX5 基因，普通煙草NtWOX3b、NtWOX3e、NtWOX3f 基因與擬南芥AtWOX3 基因，普通煙草NtWOX13a、NtWOX13c 基因與擬南芥AtWOX3 基因，均在擬南芥和普通煙草基因組的共線性區(qū)塊中，存在共線性關(guān)系，進一步說明所鑒定的相關(guān)普通煙草NtWOX 基因與擬南芥相關(guān)AtWOX 基因直系同源。

2.5 染色體定位和串聯(lián)重復事件分析

為了進一步分析普通煙草WOX 家族的進化關(guān)系，基于煙草基因組的注釋信息，進行了煙草NtWOX 基因的染色體定位分析（圖4）。結(jié)果表明，15 個NtWOX 基因錨定在10 條普通煙草染色體上。NtWOX 基因在染色體上呈不均勻分布，3、4、6、8、9、14、17、18、21 和22 號染色體有NtWOX 基因分布。值得注意的是，9 號染色體上NtWOX3b 基因和NtWOX3c 基因串聯(lián)分布，且高度同源。串聯(lián)重復事件分析結(jié)果表明，普通煙草NtWOX3b 基因和NtWOX3c 基因來源于一次串聯(lián)重復事件。

圖4 普通煙草WOX 家族編碼基因的染色體定位及串聯(lián)重復分析Fig. 4 The chromosomal assignment and tandem duplication of NtWOX family genes in tobacco

2.6 全基因組復制事件分析

為了進一步解析NtWOX 家族的進化關(guān)系，利用McScan X 進行了普通煙草NtWOX 基因的全基因組復制分析（whole genome duplication，圖5）。結(jié)果表明，NtWOX13a、NtWOX13c 和NtWOX13d 基因形成了全基因組復制對，而NtWOX3b、NtWOX3d、NtWOX3e和NtWOX3f 基因形成了全基因組復制對。結(jié)果表明，這些普通煙草NtWOX 基因來源于一次或多次的復制事件。

圖5 普通煙草NtWOX 基因全基因組復制分析Fig. 5 The whole-genome duplication analysis of NtWOX genes in tobacco

2.7 普通煙草WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白保守基序分析

利用保守基序識別程序MEME，對新鑒定的普通煙草WOX 轉(zhuǎn)錄因子進行保守基序分析（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WOX 轉(zhuǎn)錄因子在同一亞家族內(nèi)的成員保守基序的組織形式具有高度的一致性，表明同亞一家族內(nèi)的WOX 成員可能承擔類似的生物學功能，也從側(cè)面反映了系統(tǒng)進化分析的可靠性。值得注意的是，所有WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員都含有Motif 1 和Motif 2，進一步分析表明，Motif 1 和Motif 2 組成了同源異型結(jié)構(gòu)域。同時，不同亞家族內(nèi)存在特異性分布的保守基序。在現(xiàn)代進化支內(nèi)，除了AtWOX7 和NtWOX3d，擬南芥和煙草的WOX 轉(zhuǎn)錄因子均含有Motif 4，進一步的分析發(fā)現(xiàn)其和WUS box 的序列一致。而串聯(lián)的Motif 5 和Motif 6 只分布于中間進化支WOX 成員的蛋白序列C 端。

圖6 煙草WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig. 6 The conserved motifs analysis of WOX family members in tobacco

2.8 普通煙草NtWOX 基因表達模式分析

提取并分析普通煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用R 包pheatmap 將NtWOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員的編碼基因表達數(shù)據(jù)進行可視化展示（圖7）。結(jié)果表明，煙草NtWOX 家族編碼基因在測試組織中均有表達且具有組織特異性。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，煙草WOX13 亞家族的成員在5 個組織中有較高的表達量，而另外一些WOX 亞家族成員的編碼基因表達特異性較為明顯。WUS 亞家族的NtWUSa 和NtWUSb，WOX1 亞家族的NtWOX1a 和NtWOX1b 以及NtWOX9 基因特異性地在花器官中表達；同時WOX5 亞家族的NtWOX5b基因在根中表達量較高。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，同一亞家族內(nèi)NtWOX 基因組織特異性也存在差異，在WOX3 亞家族內(nèi)，NtWOX3a 基因在根中表達量較高，NtWOX3b和NtWOX3c基因在幼嫩葉片中表達量較高，而NtWOX3f 和NtWOX3g 基因在莖中特異性的表達。

2.9 熒光定量分析

為了進一步明確煙草NtWOX 基因的表達模式，選取NtWUSa 和NtWOX5a 基因進行表達驗證分析。普通煙草測試組織平行收集3 組樣本獨立提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，每組樣本設(shè)3 次技術(shù)重復，根據(jù)2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量（圖8）。結(jié)果表明，針對NtWUSa 基因，以莖的相對表達量設(shè)定為單位1，基因NtWUSa 特異性的在莖和莖尖表達，而且在莖尖的表達量較高；針對NtWOX5a 基因，以根的相對表達量設(shè)定為單位1，基因NtWOX5a 在根尖和根特異性表達，且在根尖的表達量較高。

圖7 煙草NtWOX 基因家族成員表達模式分析Fig. 7 The expression patterns of the NtWOX genes in tobacco

2.10 煙草WOX 家族GO 注釋分析

通過Blast2GO 在默認參數(shù)下對普通煙草和擬南芥WOX 家族成員進行基因的本體論（Gene Ontology, GO）注釋，并利用WEGO 進行可視化展示（圖9）。分析發(fā)現(xiàn)，普通煙草WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員與擬南芥的相關(guān)成員在分子功能（Molecular Function）、生物學過程（Biological Process）等方面注釋結(jié)果相似，表明其可能承擔相似的功能。進一步分析結(jié)果表明，所有普通煙草WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員定位在細胞核中（nucleus），并發(fā)揮DNA 結(jié)合（DNA binding）的相關(guān)功能，這與WOX 轉(zhuǎn)錄因子的功能相一致。此外，所有煙草WOX 蛋白均被注釋為參與組織器官發(fā)育過程（multicellular organismal development）。很多煙草WOX 家族成員還參與細胞間通訊（cell communication）、脅迫響應(yīng)（response to stress）等信號轉(zhuǎn)導過程中。

3 討論

圖8 煙草NtWUSa（A）和NtWOX5a（B）基因表達模式Fig. 8 The expression patterns of the NtWUSa (A) and NtWOX5a (B) genes

WOX 轉(zhuǎn)錄家族是植物特異的轉(zhuǎn)錄因子家族，其成員含有保守的同源異型結(jié)構(gòu)域，被報道廣泛參與植物生長發(fā)育、組織器官的發(fā)生和形成、干細胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)控等重要的生命過程[28,29]。本研究利用比較基因組學和生物信息學方法，從普通煙草K326 基因組中鑒定出23 個WOX 轉(zhuǎn)錄因子編碼基因。所有普通煙草WOX 轉(zhuǎn)錄因子均含60 或者61 個氨基酸殘基組成的高度保守的同源異型結(jié)構(gòu)域?；谄胀煵莺鸵褕蟮赖臄M南芥、番茄以及馬鈴薯WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員的蛋白全長序列，通過鄰接法重建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，普通煙草和已報道的WOX 轉(zhuǎn)錄因子被分成了3 個亞支和9 個亞家族。除了WOX4 以外所有亞家族都包含了至少一個的擬南芥和煙草WOX轉(zhuǎn)錄因子，表明WOX 轉(zhuǎn)錄因子亞家族的分化形成的時間早于煙草和擬南芥的物種分化；保守基序分析發(fā)現(xiàn)，亞家族內(nèi)的普通煙草和擬南芥WOX 轉(zhuǎn)錄因子的保守基序的組織形式高度一致，表明其可能承擔類似的生物學功能。GO 注釋表明，普通煙草WOX 家族成員定位到細胞核中，參與組織器官發(fā)育、細胞間通訊過程和脅迫響應(yīng)等生物學過程。

圖9 普通煙草WOX 家族成員GO 注釋分析Fig. 9 The GO analysis of WOX family members in tobacco

在WOX13 亞家族， 擬南芥AtWOX13 與NtWOX13a - NtWOX13d 聚在一起。共線性分析發(fā)現(xiàn)，普通煙草NtWOX13a、NtWOX13c 基因與擬南芥AtWOX13 基因存在共線性關(guān)系，證明其直系同源；全基因組復制分析發(fā)現(xiàn)，NtWOX13a、NtWOX13c 和NtWOX13d 基因形成了全基因組復制對。因此，在擬南芥與煙草分化后，WOX13 亞家族成員經(jīng)歷了一次或者多次的全基因組復制事件，使WOX13 亞家族成員發(fā)生擴張。

此外，在WOX3 亞家族中，煙草有NtWOX3a -NtWOX3h 共計8 個WOX 家族成員，與擬南芥AtWOX3 聚在一起。此外，普通煙草NtWOX3b、NtWOX3e、NtWOX3f 基因與擬南芥AtWOX3 基因存在共線性關(guān)系，說明其直系同源。復制事件分析表明，普通煙草NtWOX3b 基因和NtWOX3c 基因來源于一次串聯(lián)重復事件，而NtWOX3b、NtWOX3d、NtWOX3e和NtWOX3f 基因形成了全基因組復制對，這些基因來自一次或者多次的基因組復制事件。有意思的是，這些復制后形成的NtWOX 基因在表達模式上出現(xiàn)分化。NtWOX3b 和NtWOX3c 基因在幼嫩葉片中表達量較高，而NtWOX3f 基因在莖中特異性的表達。這表明來源于復制事件的NtWOX 基因在生物學功能上可能發(fā)生了變化。

值得注意的是，擬南芥中AtWOX5 基因在根尖中特異性表達，調(diào)控根頂端分生組織穩(wěn)態(tài)。進化分析和保守基序分析發(fā)現(xiàn)NtWOX5a 與AtWOX5 聚在WOX5 亞家族中，二者有著相似的保守基序的組織形式。共線性分析發(fā)現(xiàn)，AtWOX5 與NtWOX5a 基因存在于煙草和擬南芥的共線性區(qū)段中。此外，表達模式分析發(fā)現(xiàn)，NtWOX5a 基因同樣也在根尖、根中高表達。因此，與AtWOX5 直系同源的NtWOX5a 很可能在普通煙草的根尖中參與根頂端分生組織干細胞動態(tài)平衡調(diào)控。

4 結(jié)論

本研究利用比較基因組和生物信息學的方法，從普通煙草基因組中鑒定出23 個NtWOX 轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，所鑒定的NtWOX 轉(zhuǎn)錄因子均包含典型的同源異型結(jié)構(gòu)域。同時新鑒定的煙草NtWOX 成員被分為3 個亞支和9 個亞家族。串聯(lián)重復和全基因組重復分析發(fā)現(xiàn)，NtWOX3 和NtWOX13 亞家族因為復制事件發(fā)生從而出現(xiàn)擴張。表達分析發(fā)現(xiàn)NtWOX 基因表達存在特異性。GO 注釋分析發(fā)現(xiàn)，所鑒定的普通煙草NtWOX 轉(zhuǎn)錄因子在細胞核中結(jié)合DNA，并參與組織器官發(fā)育以及細胞間通訊和脅迫響應(yīng)等信號轉(zhuǎn)導過程。