CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在家畜中的應(yīng)用研究進(jìn)展

王 彤，高元鵬，韓 靜，張景程，李喜和，何婷依，曹貴方*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市 010018；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)，陜西楊凌 712021；3.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市 010021)

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指利用基因工程將外源基因整合到動(dòng)物基因組或是對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行人為定向改造，修飾后的遺傳物質(zhì)可以穩(wěn)定遺傳給后代的動(dòng)物。世界公認(rèn)的第一例真正意義上的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是在1982年，Palmiter研究員利用原核顯微注射的方式將人生長(zhǎng)激素基因?qū)氲叫∈笤伺咛ブ兴鶚?gòu)建[1]。1985年，Hammer研究員同樣利用原核顯微注射法成功獲得了轉(zhuǎn)基因家畜[2]。盡管使用原核顯微注射技術(shù)來(lái)制備轉(zhuǎn)基家畜效率較低，但是由于操作直觀、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)一直被視為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的常規(guī)操作。

1996年，Campbell研究人員利用體細(xì)胞核移植技術(shù)(somatic cell nuclear transfer,SCNT)成功獲得了克隆羊[3]。1997年，Wilmut研究員利用SCNT等操作成功獲得體細(xì)胞克隆羊“多莉”，這使得在體細(xì)胞上進(jìn)行基因編輯，再結(jié)合SCNT來(lái)獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成為可能。由于在自然條件下體細(xì)胞同源重組效率極低，再加上SCNT效率也較低[4]，利用SCNT建立的動(dòng)物經(jīng)常會(huì)發(fā)生猝死或引發(fā)與健康相關(guān)的并發(fā)癥，所以只有有限數(shù)量轉(zhuǎn)基因家畜被報(bào)道。

人工核酸內(nèi)切酶(engineered endonuclease,EEN)的出現(xiàn)不但顯著提高了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)效率，而且使得精準(zhǔn)打靶成為可能。EEN主要是由鋅指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)組成。其中CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)相對(duì)于其他兩種系統(tǒng)來(lái)說(shuō)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、效率高、應(yīng)用范圍廣和成本低，被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的建立上。

2006年利用轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)的ATryn獲得上市許可，這是世界首例獲得上市許可的利用轉(zhuǎn)基因山羊乳腺反應(yīng)器生產(chǎn)的基因工程蛋白藥物。2015年FDA批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因三文魚上市，2017年轉(zhuǎn)基因三文魚登上加拿大的餐桌，這是全球首次批準(zhǔn)可食用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。2020年12月14日FDA批準(zhǔn)了敲除豬細(xì)胞表面α-半乳糖(Alpha-gal)蛋白酶的轉(zhuǎn)基因豬-GalSafe上市，這是首次獲得批準(zhǔn)的既可以用于人類食用也可用于人類醫(yī)療的轉(zhuǎn)基因家畜，這也是科學(xué)創(chuàng)新偉大的里程碑。由此可見(jiàn)，未來(lái)會(huì)有越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制品以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物被允許上市，這也極大的鼓舞了科研人員對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的信心和熱情。

本文主要綜述CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在家畜生產(chǎn)中取得的研究成果，并對(duì)其存在問(wèn)題與未來(lái)發(fā)展進(jìn)行討論。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)概述

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌抵抗病毒與噬菌體入侵的一種不斷進(jìn)化的適應(yīng)性免疫防御機(jī)制[5]，該系統(tǒng)可以識(shí)別外源基因并對(duì)其進(jìn)行切割，從而抵御其侵染。2011年Makrova等將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為3種類型，分別為TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ。其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)僅由1個(gè)Cas9核酸內(nèi)切酶就可以對(duì)DNA特定位點(diǎn)進(jìn)行切割，組成成分相對(duì)簡(jiǎn)單，是目前研究最徹底的一種[6]。

CRISPR/Cas9獲得性免疫保護(hù)機(jī)制主要有3個(gè)階段，分別是CRISPR間隔序列的獲得、CRISPR基因的表達(dá)和CRISPR干擾[7]。當(dāng)外源基因入侵細(xì)菌時(shí)，CRISPR/Cas9通過(guò)前間隔序列鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM)將候選的原間隔序列剪切插入到CRISPR序列前導(dǎo)區(qū)的下游并修復(fù)。當(dāng)外源基因再次入侵時(shí)，CRISPR基因的表達(dá)水平迅速上升，轉(zhuǎn)錄生成前體CRISPR RNA(pre CRISPR derived RNA,pre-crRNA)和反式作用CRISPR RNA(trans acting CRISPR RNA,tracrRNA)，前者會(huì)被Cas蛋白剪切為成熟的crRNA(CRISPR-derived RNA)。最后，tracrRNA與crRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成一條雙鏈的RNA并與Cas9蛋白形成具有DNA內(nèi)切酶活性的核糖核蛋白復(fù)合物crRNP。crRNP與外源的靶序列互補(bǔ)配對(duì)，并將Cas9蛋白引導(dǎo)至在PAM附近并對(duì)其DNA雙鏈進(jìn)行切割，從而降解外源DNA保護(hù)宿主細(xì)胞免受病毒與噬菌體的侵染。

2012年，Jinek將CRISPR/Cas9系統(tǒng)的tracrRNA以及crRNA人工融合為一條向?qū)NA(guide RNA,gRNA)，從而將CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)一步簡(jiǎn)化為只由一條單鏈向?qū)NA和一個(gè)Cas9核酸酶組成的系統(tǒng)[8]。針對(duì)DNA雙鏈斷裂(double strand break,DSB)，細(xì)胞主要通過(guò)非同源末端連接(non homologous end joining,NHEJ)和同源重組(homologous directed recombination,HDR)的修復(fù)方式進(jìn)行修復(fù)。其中細(xì)胞主要是通過(guò)NHEJ修復(fù)途徑來(lái)對(duì)DNA進(jìn)行修復(fù)，但是會(huì)引入微小堿基的隨機(jī)插入或缺失(small insert or delete,Indels)，這將導(dǎo)致基因組重要結(jié)構(gòu)被破壞，或是因?yàn)橐拼a突變從而過(guò)早形成終止密碼子導(dǎo)致基因敲除(knock-out,KO)。HDR修復(fù)機(jī)制是在有修復(fù)模板存在的情況下對(duì)DNA進(jìn)行精準(zhǔn)修復(fù)，利用其原理可以實(shí)現(xiàn)基因組定點(diǎn)插入(knock-in,KI)，或是單堿基的替換。

2013年，張鋒和Church等分別實(shí)現(xiàn)了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在哺乳動(dòng)物的最早期應(yīng)用。2015年麻省理工學(xué)院腦研究所聯(lián)合哈佛醫(yī)學(xué)院對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行改造，大大降低了該系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)[9]，從而提高了利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的安全性。法國(guó)生物化學(xué)家Emmanuelle Charpentier和美國(guó)生物學(xué)家Jennifer Doudna更是因?yàn)閷?duì)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)做出的突出貢獻(xiàn)，在2020年10月7日獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，表明了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在科學(xué)領(lǐng)域不可替代的革命性意義。

2 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在豬的研究應(yīng)用

2.1 在抗病轉(zhuǎn)基因上的研究應(yīng)用

豬是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，豬肉是人類動(dòng)物蛋白的主要來(lái)源之一。隨著全球人口數(shù)量的不斷增加，豬肉需求量在逐日增長(zhǎng)，全球養(yǎng)豬的規(guī)模在不斷擴(kuò)大，但是由于密集化飼養(yǎng)導(dǎo)致豬的新發(fā)和再發(fā)疫病也相繼出現(xiàn)，從而給養(yǎng)豬行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，針對(duì)抗病轉(zhuǎn)基因豬品種的培育已經(jīng)刻不容緩。目前研究人員主要是通過(guò)編輯宿主的受體，或是通過(guò)將抑制病毒增殖的基因插入到宿主的基因組的方法來(lái)抑制病毒。由于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)制備簡(jiǎn)單、效率高等優(yōu)點(diǎn)，在豬的抗病育種中具有極大的潛力。

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又稱為豬藍(lán)耳病，是由于感染了豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)所導(dǎo)致。PRRS會(huì)導(dǎo)致懷孕母豬早產(chǎn)或流產(chǎn)；新生仔豬虛弱、初生重較低、發(fā)燒咳嗽、生長(zhǎng)性能下降；公豬厭食、嗜睡和精子質(zhì)量下降等癥狀。PRRS每年都會(huì)給養(yǎng)豬行業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。2006年，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(high-pathogenic-porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)成為我國(guó)豬的主要流行病，HP-PRRSV起源于Ⅱ型的PRRSV，比傳統(tǒng)的PRRSV具有更高的發(fā)病率與死亡率。研究發(fā)現(xiàn)CD163是PRRSV進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵受體基因，CD163全蛋白或是與病毒互作的SRCR5區(qū)的基因缺失可使基因敲除豬以及相應(yīng)的宿主細(xì)胞對(duì)Ⅰ型和Ⅱ型的PRRSV分離株產(chǎn)生抵抗力。2018年，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)吳珍芳研究團(tuán)隊(duì)使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與SCNT相結(jié)合，獲得了CD163基因敲除的杜洛克豬[10]。試驗(yàn)進(jìn)一步證明了敲除CD163基因的杜洛克豬可對(duì)HP-PRRSV感染具有完全的抵抗力，CD163的缺失并不影響巨噬細(xì)胞向單核細(xì)胞的分化和巨噬細(xì)胞對(duì)Hp-Hb的攝取。CD163基因敲除豬的構(gòu)建為抵抗PRRSV提供了寶貴的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。這是通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在動(dòng)物水平上進(jìn)行基因組編輯來(lái)抵御病毒的感染，為以后研究病毒與宿主的關(guān)系提供了寶貴材料與思路。

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是一種在家豬與野豬病死率高達(dá)100%的病毒性疾病，目前還沒(méi)有有效的疫苗和治療方法來(lái)抑制非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)的感染。2018年，研究人員將靶向ASFV磷蛋白p30的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)導(dǎo)入到病毒體內(nèi)。由于靶向切割A(yù)SFV-p30基因組，所以導(dǎo)致由ASFV引起的空斑完全消失，并且病毒產(chǎn)量降低了4個(gè)數(shù)量級(jí)[11]。由此可見(jiàn)，利用CRISPR/Cas9靶向ASFV-p30是抵抗ASFV的一種有效的策略。核糖核酸酶L(RNase L)是受Ⅰ型干擾素調(diào)控的一種重要的抗病毒內(nèi)切核酸酶，但是豬的核糖核酸酶L(sRNase L)的作用機(jī)制尚不明確。2019年，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除豬PK-15細(xì)胞系的sRNase L[12]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，sRNase L具有多種生物學(xué)功能，包括降解細(xì)胞單鏈RNA、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、下調(diào)干擾素刺激基因(interferon stimulated genes,ISGs)的轉(zhuǎn)錄水平以及具有抵抗豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)的活性，這一發(fā)現(xiàn)為生產(chǎn)PRV弱毒疫苗提供了寶貴的思路。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)直接對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行編輯，可用來(lái)研究病毒與宿主細(xì)胞之間的聯(lián)系、病毒致病機(jī)理以及新型疫苗的構(gòu)建。

2.2 在異種器官移植和疾病模型上的研究應(yīng)用

家豬在生理學(xué)與解剖學(xué)方面與人類的器官有相似的特征。在人類器官短缺的情況下，家豬可以作為優(yōu)良的供體動(dòng)物為人類提供器官。但是豬與靈長(zhǎng)類進(jìn)行異種器官移植后會(huì)引起超急性免疫排斥反應(yīng)、急性血管排斥反應(yīng)和細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)和慢性排斥反應(yīng)，并且豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(Porcine endogenous retrovirus,PERV)也阻礙著異種器官移植的發(fā)展。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的簡(jiǎn)便高效性縮短了對(duì)家豬多基因人源化改造和對(duì)PERV編輯的時(shí)間，從而加速了豬與靈長(zhǎng)類異種器官移植的發(fā)展與應(yīng)用。

豬血管內(nèi)皮上的α-Gal是由α1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(α1.3-galactosyltransferase，GGTA1)催化合成的細(xì)胞表面抗原。該抗原能被靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)的抗體識(shí)別，從而引起超急性免疫排斥反應(yīng)。2016年，研究人員使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與SCNT獲得了GGTA1雙等位基因敲除豬，GGTA1的敲除降低了豬到靈長(zhǎng)類所引起的超急性免疫排斥反應(yīng)。然而研究發(fā)現(xiàn)，將敲除GGTA1轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行器官移植后，仍有抗體沉積、補(bǔ)體激活和血栓的形成。Byrne發(fā)現(xiàn)豬體內(nèi)的β-1,4 N-乙酸氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(β-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase 2,β4GalNT2)可催化合成SD(a)抗原，當(dāng)移植到靈長(zhǎng)類就引起免疫排斥。因此，將巴馬豬的GGTA1和β4GalNT2基因敲除可以極大的降低其器官與組織的免疫原性。2019年，戴一凡研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)制備了GGTA1/β4GalNT2雙基因敲除的巴馬豬成纖維細(xì)胞系[13]。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可快速構(gòu)建雙基因敲除的細(xì)胞系，并為大量獲得GGTA1/β4GalNT2雙基因敲除的巴馬豬打下基礎(chǔ)。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可最大限度地降低對(duì)異種移植的抗體屏障，這些特異性抗原敲除豬的建立將掃除豬到靈長(zhǎng)類異種器官移植的安全障礙，推動(dòng)豬器官到臨床的應(yīng)用。

楊璐菡科研團(tuán)隊(duì)在豬異種器官移植上做出了突出貢獻(xiàn)。2015年，楊璐菡首次鑒定出豬細(xì)胞內(nèi)存在PERV完整譜系和在染色體上的拷貝數(shù)，并且證明了利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)豬PK-15細(xì)胞系PERV的62個(gè)拷貝數(shù)的敲除，從而使人感染PERV風(fēng)險(xiǎn)下降至以前的1/1 000[14]。2017年，獲得了100%敲除PREV的轉(zhuǎn)基因豬1.0并取名為“萊卡”。2020年，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合轉(zhuǎn)座子技術(shù)成功獲得了敲除3種異種抗原同時(shí)插入9種人類基因的轉(zhuǎn)基因豬3.0。轉(zhuǎn)基因豬3.0已基本解決了免疫排斥問(wèn)題，這是迄今為止最適合給人類捐獻(xiàn)器官的轉(zhuǎn)基因豬。

豬作為人類疾病模型動(dòng)物是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)，到目前為止利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了許多人類疾病模型豬。2015年，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功獲得了敲除3個(gè)等位基因IGM突變的仔豬[15]，成功獲得了免疫缺陷疾病模型豬。2016年，獲得了敲除腫瘤抑制基因RUNX3的人類胃癌模型豬[16]。2017年，敲除巴馬小型豬的載脂蛋白E基因和低密度脂蛋白受體基因，可以作為人類心血管疾病模型豬[17]，同年獲得了敲除INS基因的糖尿病模型豬[18]。2018年，獲得了亨廷頓模型豬，這為神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制和治療研究提供了寶貴的模型動(dòng)物。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以高效構(gòu)建人類疾病模型動(dòng)物，可更好地對(duì)人類疾病發(fā)生發(fā)展進(jìn)行研究，從而為研制新抗病藥物和治療方案提供寶貴的動(dòng)物材料。

2.3 生產(chǎn)性能的研究應(yīng)用

2015年，吉林大學(xué)研究人員[19]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與有限稀釋的方法獲得了無(wú)篩選標(biāo)記的敲除肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin,MSTN)的轉(zhuǎn)基因豬，并在組織學(xué)上顯示新生MSTN敲除仔豬的背最長(zhǎng)肌存在較多的肌纖維核，表明MSTN基因在豬胚胎發(fā)育的過(guò)程中對(duì)肌纖維數(shù)量有一定的調(diào)節(jié)作用。2018年，研究人員[20]利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)巴馬豬胰島素樣生長(zhǎng)因子2(Insulin like growth factor 2,IGF2)的內(nèi)含子3-3072位點(diǎn)進(jìn)行編輯，結(jié)果表明，編輯非編碼區(qū)也可以提高巴馬豬的產(chǎn)肉量。這首次證明了編輯非編碼區(qū)可以改善家畜的經(jīng)濟(jì)性狀。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可高效地培育具有更高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因豬。

3 CRSIPR/Cas9基因編輯技術(shù)在牛的研究應(yīng)用

3.1 在抗病轉(zhuǎn)基因育種上的研究應(yīng)用

?？共∮N一直是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的熱點(diǎn)。牛的結(jié)核病是由于牛分支桿菌(Mycobacteriumbovis，M.bovis)感染造成的一種人畜共患病。2017年，張涌院士團(tuán)隊(duì)[21]首次利用Cas9的突變體單切口酶(Cas9 nickase,Cas9n)，在牛的成纖維細(xì)胞精準(zhǔn)插入外源NRAMP1基因，并成功獲得了11頭轉(zhuǎn)基因牛。精準(zhǔn)插入外源基因NRAMP1可以提高牛對(duì)結(jié)核病的抵抗能力，同時(shí)也證明Cas9n可以降低脫靶效率，提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生物安全性。牛副結(jié)核病是由于牛感染副結(jié)核分支桿菌(paratuberculosis,MAP)所引的，每年都會(huì)對(duì)奶制品造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn)白介素10受體α(interleukin-10 receptoralpha,IL-10RA)對(duì)MAP具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。2020年，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了一株敲除IL10RA基因的牛乳腺上皮細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，敲除IL-10RA的牛乳腺上皮細(xì)胞可以降低促炎細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子3(suppressor of cytokine signaling3,SOCS3)的表達(dá)，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子TNFA、IL-1A、IL-1B和IL-6基因的表達(dá)。敲除牛乳腺上皮細(xì)胞IL-10RA的獲得有助于深入了解IL-10RA抗炎癥的相關(guān)機(jī)制和MAP裂解產(chǎn)物作用機(jī)理，可作為評(píng)估不同抗炎藥物抗炎效果的細(xì)胞模型。2020年，研究人員通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了敲除CD46基因的細(xì)胞系[22]。證明不同的牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染性強(qiáng)烈依賴于CD46，而在敲除CD46的情況下，仍然有一部分病毒顆粒進(jìn)入宿主細(xì)胞中。敲除CD46的細(xì)胞系獲得，可用于闡明CD46受體在瘟疫病毒生物學(xué)和生長(zhǎng)周期中的作用機(jī)制。

3.2 在早期胚胎動(dòng)物模型上的研究應(yīng)用

早期基因工程編輯效率低，再加上牛的生殖周期長(zhǎng)，導(dǎo)致牛胚胎發(fā)育過(guò)程中很大程度上是未知的。OCT4對(duì)哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞譜系分化和生殖細(xì)胞多能性的維持起著十分重要的作用，但是OCT4在牛囊胚形成和細(xì)胞譜系特性尚不明確。2017年，研究人員[23]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與SCNT獲得了敲除OCT4的牛胚胎。研究發(fā)現(xiàn)，敲除牛OCT4的囊胚與敲除小鼠OCT4的囊胚的發(fā)育存在很大區(qū)別，但是與人類缺陷OCT4的囊胚發(fā)育相似。2018年，Bradford等[24]直接在牛的受精卵注射靶向OCT4基因的sgRNA與Cas9蛋白所組成的核糖核蛋白復(fù)合物，導(dǎo)致牛胚胎在第5天發(fā)育停滯，從而導(dǎo)致囊胚難以形成。敲除OCT4的牛胚胎可以為人類早期胚胎發(fā)育缺陷提供模型動(dòng)物，也為牛的胚胎發(fā)育提供了寶貴的材料。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的獲得主要是通過(guò)兩種方式，一種是通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行編輯，然后通過(guò)SCNT獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；另一種是將sgRNA-Cas9復(fù)合物顯微注射到受精卵中，再通過(guò)胚胎移植的方式來(lái)獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。但是，由于SCNT在培育健康克隆動(dòng)物上效率比較低，再加上對(duì)操作人員的技術(shù)要求以及對(duì)儀器器材要求較高，并且通過(guò)SCNT構(gòu)建的胚胎容易形成嵌合體動(dòng)物。以上這些缺點(diǎn)都在制約著轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究發(fā)展。2018年，研究人員[25]將靶向OCT4的sgRNA-Cas9所組成的核糖體復(fù)合物通過(guò)優(yōu)化的電穿孔的方式轉(zhuǎn)染到牛的受精卵中。研究表明，OCT4的編輯效率高達(dá)92%，大多數(shù)胚胎(11/13)呈現(xiàn)雙等位基因編輯并且只有一個(gè)(1/13)胚胎發(fā)生了遺傳嵌合體。利用電穿孔技術(shù)將CRISPR/Cas9系統(tǒng)導(dǎo)入到受精卵中，這種方法極大的降低操作難度，使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物更加容易獲得。

4 CRSIPR/Cas9技術(shù)在羊的研究應(yīng)用

4.1 生產(chǎn)性能上的研究應(yīng)用

羊是我國(guó)重要的家畜之一，為人類提供優(yōu)質(zhì)的肉制品、奶制品和毛制品。轉(zhuǎn)基因羊具有生產(chǎn)更加優(yōu)質(zhì)的肉制品、奶制品和毛制品，也可以生產(chǎn)有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的治療性蛋白的潛力。2014年，首次證明了CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可在山羊中應(yīng)用，在3 d時(shí)間內(nèi)可對(duì)所有內(nèi)源性基因進(jìn)行編輯，經(jīng)過(guò)多重編輯的山羊可以在5個(gè)月內(nèi)獲得。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與SCNT相結(jié)合可快速獲得轉(zhuǎn)基因羊。

山羊奶具有高比例的脂肪和蛋白質(zhì)含量并且在成分上也更加接近人乳，山羊奶已經(jīng)成為牛奶的重要補(bǔ)充乳品。但是在山羊奶里的β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)是人類尤其是嬰兒的主要過(guò)敏原，經(jīng)過(guò)加熱處理或發(fā)酵的方式都不能消除。2017年[26]，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了敲除BLG的轉(zhuǎn)基因山羊。敲除BLG的轉(zhuǎn)基因山羊奶中BLG蛋白濃度有所降低，為改良山羊奶的成分提供了新思路。2017年，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了敲除BLG基因的同時(shí)，在BLG位點(diǎn)插入了人乳鐵蛋白，從而消除了人對(duì)于山羊奶的過(guò)敏反應(yīng)，并提高了山羊奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[27]。

2014年，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)分別在綿羊與山羊上獲得了敲除MSTN雙等位基因的轉(zhuǎn)基因羊。2018年，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了敲除MSTN基因并在MSTN位點(diǎn)插入FAT-1基因的轉(zhuǎn)基因山羊[28]。FAT-1表達(dá)上調(diào)可以增加ω-3多不飽和脂肪酸的含量從而降低n-6/n-3的比例，降低患神經(jīng)疾病和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[29]。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)加速了對(duì)綿羊與山羊在產(chǎn)肉性能上的改良。

隨著生活水平的提升，人類對(duì)高品質(zhì)羊絨的需求量也越來(lái)越高。成纖維生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor 5,FGF5)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial cell growth factor， VEGF)是調(diào)控毛發(fā)生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因。2016年，陳玉林研究團(tuán)隊(duì)利用顯微注射將靶向MSTN與FGF5的sgRNAs與Cas9-mRNA同時(shí)注射到山羊的胚胎中。試驗(yàn)證明，敲除FGF5基因可以增加毛囊數(shù)量和纖維長(zhǎng)度，從而生產(chǎn)更多的羊絨。2020年，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)獲得5只敲除FGF5的杜泊羊[30]。敲除FGF5的轉(zhuǎn)基因綿羊FGF5基因表達(dá)水平顯著降低，且所有FGF5蛋白功能紊亂，在表型上毛囊密度與細(xì)毛度顯著增加。這是首次建立FGF5、FGFR1、androgen、AR、Wnt/β-catenin、Shh/Gli2、c-myc和krts在內(nèi)的下游信號(hào)通路。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步改善FGF5的功能、治療雄激素性脫發(fā)提供了思路，也為培育產(chǎn)絨量高、絨纖維品質(zhì)好的轉(zhuǎn)基因絨山羊提供了寶貴的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

4.2 在其他方面的研究應(yīng)用

褪黑素是一種重要的抗氧化劑，具有重要的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。2017年，研究人員[31]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)生產(chǎn)出富含褪黑素乳腺生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因羊。這是第1例表達(dá)AANAT和ASMT基因的模型動(dòng)物，為大型轉(zhuǎn)基因家畜的制作奠定了基礎(chǔ)。2018年，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與SCNT相結(jié)合敲除了綿羊的囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(transmembrane conductance regulator,CFTR)，敲除CFTR基因的綿羊出現(xiàn)了與人類囊性纖維化(cystic fibrosis,CF)一致的臨床癥狀。綿羊囊性纖維化動(dòng)物模型的建立將成為研究人類CF有價(jià)值的疾病模型動(dòng)物[32]。

5 討論與展望

盡管CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在家畜的應(yīng)用中已經(jīng)取得令人矚目的成果，但是由于釀膿鏈球菌Cas9(StreptococcuspyogenesCas,SpCas9)的高脫靶率、嚴(yán)格的PAM要求、高細(xì)胞毒性[33-36]的缺點(diǎn)，以及細(xì)胞發(fā)生HDR修復(fù)途徑效率低[37]的因素，都限制其使用范圍。

2018年，Charpentier等研究人員將Cas9與CtIP融合，可顯著提高轉(zhuǎn)基因的靶向整合效率。2020年，朱健康院士發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)磷酸化修飾和硫代修飾后的供體可極大地提高CRISPR/Cas9在水稻中介導(dǎo)的靶向插入效率，并且在此基礎(chǔ)上，他們還發(fā)現(xiàn)在基因組上串聯(lián)重復(fù)片段可以提高點(diǎn)突變效率。這些成果為提高CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在家畜的靶向修復(fù)效率提供了可靠的試驗(yàn)依據(jù)與思路。

利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)家畜基因組進(jìn)行編輯時(shí)，會(huì)有一定的概率對(duì)非靶位點(diǎn)進(jìn)行編輯。為了降低脫靶效應(yīng)，有科研團(tuán)隊(duì)發(fā)明了單堿基編輯器系統(tǒng)，該系統(tǒng)在不產(chǎn)生DSB的情況下就可以發(fā)生單堿基替換，從而降低脫靶效應(yīng)。此外，還有一種新CRISPR變異體，通過(guò)催化受損的Cas9蛋白核酸酶和逆轉(zhuǎn)錄酶融合而成，稱之為prime editor。在不需要DSB或供體DNA模板的情況下，進(jìn)行精確的靶向插入、缺失和點(diǎn)突變。這種方法可以有效地降低脫靶效應(yīng)帶來(lái)的副產(chǎn)品，減少對(duì)動(dòng)物體的危害。

嗜熱鏈球菌Cas9(StreptococcusthermophilusCas9,St1Cas9)是釀膿鏈球菌SpCas9的一個(gè)相對(duì)較小的同源物，它能夠?qū)Σ煌N生物體內(nèi)的基因組進(jìn)行編輯，與SpCas9相比，它具有更低的細(xì)胞毒性、更高的特異性和更長(zhǎng)的PAM要求。2020年季泉江研究團(tuán)隊(duì)與甘建華研究團(tuán)隊(duì)解析St1Cas9-sgRNA-DNA的三元復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，并揭示了HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域切割DNA的分子機(jī)制，同時(shí)也揭示了St1Cas9運(yùn)用氫鍵和范德華力來(lái)識(shí)別較為復(fù)雜的NNAGAA的PAM序列。研究人員依據(jù)其分子機(jī)制進(jìn)行定向進(jìn)化，成功地將St1Cas9的PAM識(shí)別范圍從野生型的NNAGAA拓展為NNRNAA，從而擴(kuò)大了St1Cas9的基因編輯范圍，使得St1Cas9在基因編輯系統(tǒng)具有更為廣闊的應(yīng)用前景。

綜上所述，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在轉(zhuǎn)基因家畜中已經(jīng)取得了重大研究成果，隨著技術(shù)的不斷完善，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)一定會(huì)在農(nóng)業(yè)與人類醫(yī)學(xué)中取得更多令人矚目的成果。