磺胺甲惡唑高效降解菌群的多樣性分析和降解微生物的分離表征

趙冬雪, 劉璐, 穆迎春, 韓剛, 張洪玉, 房洪博, 阮志勇, 宋金龍*

1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 遼寧 錦州 121013；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院, 北京 100141；3.黑龍江省博物館, 哈爾濱150001；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所, 北京 100081

我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖量常年位居世界首位，巨大的產(chǎn)量主要依靠高密度養(yǎng)殖，該類養(yǎng)殖方式增加了水生動(dòng)物病害的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。抗菌藥物具有殺滅水產(chǎn)病原菌的效果，可有效抑制水產(chǎn)動(dòng)物疾病。磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole，SMX)，又名新諾明，化學(xué)名為N-(5-甲基-3-異惡唑基)-4-氨基苯磺酰胺，可有效抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖中嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、熒光假單胞菌和諾卡氏菌等引起的細(xì)菌性疾病，是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常用的廣譜抗菌藥物[1]。然而，隨著該藥物的大量使用，殘留污染問題越來(lái)越嚴(yán)重。磺胺甲惡唑中67%～90%不能被水生動(dòng)物完全代謝，部分藥物以原形或代謝產(chǎn)物形式被排出體外，經(jīng)養(yǎng)殖廢水和污水匯集，最終回流入地表水中[2]。養(yǎng)殖污廢水[3]、地表水[4-5]和地下水[6]等多種水體環(huán)境中均已檢出該藥物殘留，水生環(huán)境遭到威脅。而部分殘留在水生動(dòng)物體內(nèi)的藥物，一旦通過食物鏈進(jìn)入人體，將對(duì)泌尿系統(tǒng)功能造成破壞，威脅人類健康[7-9]。2017年10月27日，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)進(jìn)一步將磺胺甲惡唑列為3類致癌物。因此，研究并解決當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中頻發(fā)的磺胺類藥物藥害殘留問題，對(duì)保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全以及我國(guó)漁業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展具有重要價(jià)值。

國(guó)內(nèi)外研究表明，磺胺甲惡唑的降解主要有物理法、化學(xué)法和微生物法，物理法包括吸附、光降解和熱降解等[1]。其中，微生物法具有成本低、生態(tài)環(huán)境友好和無(wú)二次污染等特點(diǎn)，被證明是目前修復(fù)養(yǎng)殖水體中磺胺甲惡唑殘留的有效方法[10]。迄今為止，已有超過20株可降解磺胺甲惡唑的微生物被報(bào)道，這些菌株在實(shí)驗(yàn)室條件下都表現(xiàn)出優(yōu)秀的降解能力。

磺胺甲惡唑濃度較低時(shí)，Ochrobactrumsp. SMX-PM1-SA1、Labryssp. SMX-W1-SC11和Gordoniasp. SMX-W2-SCD14對(duì)5 mg·L-1磺胺甲惡唑288 h的降解率為45.2%、62.2%和51.4%[11]，Phanerochaetechrysosporium[12]和PlanococcuskocuriiO516[13]對(duì)10 mg·L-1磺胺甲惡唑在72 h和24 h降解率為74.0%和20%?；前芳讗哼驖舛容^高時(shí)，Achromobactersp. JL9對(duì)50 mg·L-1磺胺甲惡唑120 h的降解率為63.1%[14]，硫酸鹽還原菌對(duì)200 mg·L-1磺胺甲惡唑192 h的降解率為21.3%[15]。此外，AchromobacterdenitrificansPR1[16]、Acinetobactersp.[17]、Pseudomonassp.[18]、Marinobactersp.[18]等菌株對(duì)磺胺甲惡唑也表現(xiàn)出了一定的降解能力。

綜上所述，已報(bào)道的菌株中大部分對(duì)高濃度磺胺甲惡唑耐受能力較差，降解效率較低，缺乏對(duì)降解后代謝產(chǎn)物和代謝途徑的研究。為進(jìn)一步獲得磺胺甲惡唑高效降解菌株，本研究采用連續(xù)富集配合組學(xué)分析的研究方法，以期獲得高效磺胺甲惡唑降解菌，并進(jìn)行最適環(huán)境條件優(yōu)化，推測(cè)了其可能的降解途徑，為水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中磺胺甲惡唑的去除提供了優(yōu)良降解菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品采集 活性污泥樣品采自江蘇省蘇州市某藥廠廢水處理池，用于磺胺甲惡唑降解菌的分離。

1.1.2主要試劑 磺胺甲惡唑標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自索萊寶公司，純度為≥99.5%；甲醇，乙腈等試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司，實(shí)驗(yàn)用水為高純水。

1.1.3培養(yǎng)基 無(wú)機(jī)鹽(MSM)培養(yǎng)基(g·L-1)∶K2HPO41.5，KH2PO40.5，NH4Cl 1，NaCl 1，MgSO4·7H2O 0.2，pH 7。Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(g·L-1)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1活性污泥中菌群的富集 以活性污泥樣品為初始接種物，進(jìn)行微生物群落的富集。將5 g樣品加入盛有100 mL MSM培養(yǎng)基的三角瓶中，以50 mg·L-1磺胺甲惡唑?yàn)槲ㄒ惶荚?，置于恒溫振蕩?30℃、150 r·min-1)培養(yǎng)7 d，后按10%(體積質(zhì)量分?jǐn)?shù))接入新鮮無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，并將磺胺甲惡唑的濃度提升1倍，連續(xù)傳代4次，最終使富集物中的磺胺甲惡唑濃度達(dá)到300 mg·L-1，將每個(gè)代次的富集培養(yǎng)物分別命名為SMX1、SMX2、SMX3和SMX4[19]。

1.2.2富集培養(yǎng)物微生物群落組成和區(qū)系變化分析 運(yùn)用Omega土壤細(xì)菌總DNA試劑盒對(duì)活性和富集樣品行了總DNA提取，純化回收后進(jìn)行了16S rRNA V3-V4區(qū)擴(kuò)增。通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)，806R(5′-GGA-CTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR體系參照王亞妮等[20]的方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物純化回收后，送交百邁克基因科技公司進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序。對(duì)獲得的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行OTU(operational taxonomic units)物種注釋，分析每個(gè)代次群落菌群豐度變化，比較菌群組成結(jié)構(gòu)差異。

1.2.3磺胺甲惡唑降解菌的分離 根據(jù)對(duì)富集物菌群組成和區(qū)系變化的分析，選擇第4代富集樣品開展磺胺甲惡唑降解菌的分離。將100 μL富集樣品均勻涂布在含有100 mg·L-1磺胺甲惡唑的MSM固體平板上，挑選形態(tài)不同且生長(zhǎng)良好的菌落，通過連續(xù)多次劃線純化分離磺胺甲惡唑降解菌。

1.2.4磺胺甲惡唑降解菌的鑒定 對(duì)分離到的降解菌株進(jìn)行全基因組提取，方法參照(Omega)細(xì)菌總DNA提取說(shuō)明書進(jìn)行。純化回收后，以菌株總DNA為模板進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，通用引物分別為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′ACGGHTACCTTGTTTACGACTT-3′)。PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件與王亞妮等[21]的方法一致。對(duì)PCR產(chǎn)物回收后送交博邁德科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。獲得序列后運(yùn)用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析，并運(yùn)用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5磺胺甲惡唑降解試驗(yàn) 將分離到的菌株接種于LB培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器(30 ℃、150 r·min-1)培養(yǎng)12 h，取10 mL菌液加入離心管后，以6 000 r·min-1離心并棄上清液，沉淀菌體部分用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次后備用。降解試驗(yàn)采用100 mg·L-1磺胺甲惡唑的初始濃度，以1%菌體量接種，研究降解菌在MSM培養(yǎng)基中對(duì)磺胺甲惡唑的降解效果?；前芳讗哼驓埩暨\(yùn)用高效液相色譜(Agilent 1290，USA)檢測(cè)，采用Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相A為0.1%甲酸(體積分?jǐn)?shù))，B為甲醇。靶向篩查梯度洗脫程序：0～2 min，95% A；2～25 min，95%～5% A；25～35 min，5% A；35～40 min，95% A；進(jìn)樣量為20 μL,柱溫30 ℃[22]，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出培養(yǎng)液中磺胺甲惡唑濃度，計(jì)算降解能力[23]。

1.2.6環(huán)境因素對(duì)LLE3降解效率的影響 分別設(shè)置不同的培養(yǎng)溫度(15、20、25、30、35、40和45 ℃)，不同MSM培養(yǎng)基初始pH(4、5、6、7、8和9)以及不同初始接種量(1×107、2×107、3×107、5×107、8×107和10×107CFU·mL-1)研究環(huán)境因素對(duì)菌株LLE3降解能力的影響。

1.2.7菌株LLE3降解磺胺甲惡唑的代謝產(chǎn)物鑒定 運(yùn)用液相和高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)菌株LLE3的代謝產(chǎn)物。將菌株LLE3降解磺胺甲惡唑的培養(yǎng)液10 mL與等體積甲醇加入離心管中，在渦旋混合儀上均勻混合1 min。隨后將離心管放入搖床中以220 r·min-1混合30 min，再將離心管以5 000 r·min-1離心5 min。吸取上層有機(jī)相，并用0.22 μm孔徑的濾膜過濾。采用Waters液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)，具體條件為，Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100.0 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流速為0.2 mL·min-1，流動(dòng)相A為0.1%甲酸(體積分?jǐn)?shù))，B為甲醇。靶向篩查梯度洗脫程序：0～2 min，95% A；2～25 min，95%～5% A；25～35 min，5% A；35～40 min，95% A；進(jìn)樣量為20 μL，柱溫30 ℃[14]。質(zhì)譜條件DuoSprayTM離子源，電噴霧電離(ESI)，正離子模式掃描，離子源溫度為550 ℃；噴霧電壓為5 500 V，去簇電壓(DP)為65 V；霧化氣(GS1)為60 psi；輔助霧化氣(GS2)為60 psi；氣簾氣(CUR)為35 psi。積累時(shí)間為0.25 s，信息依賴性掃描(IDA)模式；IDA觸發(fā)15個(gè)子離子掃描；碰撞電壓為(35±15)eV，TOF MS進(jìn)行全掃描，TOF MS/MS進(jìn)行二級(jí)子離子掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 磺胺甲惡唑降解菌群組成和區(qū)系變化分析

經(jīng)高通量測(cè)序污泥樣品和4代富集培養(yǎng)物SMX0、SMX1、SMX2、SMX3和SMX4，分別獲得了5 978、6 012、6 048、6 005和6 003個(gè)有效序列。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析和OTU注釋，結(jié)果(圖1)表明污泥樣品SMX0中的6 015個(gè)基因序列被聚集成166個(gè)OTU，屬水平上總OTU比值由高到低主要分屬于BSV13、Lentimicrobium、Flavisolibacter、Ramlibacter和Rhodoferax。經(jīng)過富集后，培養(yǎng)物SMX1中細(xì)菌多樣性迅速降低，6 005個(gè)序列僅聚集為23個(gè)OTU，主要菌群分屬于Pseudomonas、Sphingobacterium、Escherichia-Shigella、Alcaligenes和Sedimentibacter。2次傳代后，Sphingobacterium的總OTUs比值從8.92%提升到52.72%，逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌群。再經(jīng)3、4次傳代后，最終富集物SMX4中6 003個(gè)序列聚類到16個(gè)OTU，細(xì)菌多樣性明顯降低，Sphingobacterium則成為絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌群，占總OTUs比值達(dá)93.68%。從整體上看，隨著磺胺甲惡唑初始濃度的增加，每個(gè)代次富集培養(yǎng)中的微生物多樣性逐漸降低，OTUs從最初的166個(gè)降至16個(gè)，菌群豐度和組成也發(fā)生了顯著改變，經(jīng)4次連續(xù)富集后Sphingobacterium占OTUs總數(shù)比值高達(dá)93.68%，說(shuō)明Sphingobacterium菌屬很有可能在SMX的降解中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步分離高效磺胺甲惡唑降解菌群提供了重要信息。

圖1 富集培養(yǎng)物中微生物屬水平相對(duì)豐度分布圖Fig.1 Relative abundance distribution of microbial genus level in enriched cultures

2.2 降解菌株的分離與鑒定

在富集培養(yǎng)物SMX4中分離到5株磺胺甲惡唑降解菌，分別命名為L(zhǎng)LE1～5，其中LLE3和LLE5降解效果較好，且LLE3 在7 d內(nèi)對(duì)100 mg·L-1的磺胺甲惡唑降解率達(dá)89.5%，因此，選擇菌株LLE3進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA鑒定。從菌落形態(tài)上看，菌株LLE3菌落表面光滑，邊緣整齊，呈檸檬黃色。在顯微鏡下，菌株LLE3呈短桿狀，長(zhǎng)0.6～1.8 μm，寬0.3～0.6 μm，革蘭氏染色陰性。生理生化結(jié)果表明，菌株LLE3可以利用葡聚糖、D-麥芽糖、D-海藻糖、D-纖維、二糖龍膽、二糖、蔗糖、D-松二糖、水蘇糖等，但不能利用D-山梨醇、D-甘露醇和D-阿糖醇。將菌株LLE3的16S rRNA基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列登錄號(hào)為MW261785，BLAST結(jié)果表明，LLE3與水谷鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriummizutaii) NCTC12149 16S rRNA 基因的相似性為99.09%，通過MEGA 6.0構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出(圖2)，菌株LLE3與鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)的菌種匯聚在一起。因此，根據(jù)形態(tài)、生理生化和16S rRNA序列分析，初步將LLE3鑒定為水谷鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriummizutaii)。

2.3 溫度對(duì)菌株LLE3降解效率的影響

本文研究了不同溫度梯度對(duì)菌株LLE3降解磺胺甲惡唑效率的影響。從圖3中可以看出菌株LLE3在15～40 ℃范圍內(nèi)均可降解磺胺甲惡唑，溫度耐受性較好。其中，在25～35 ℃的區(qū)間內(nèi)7 d時(shí)對(duì)初始濃度100 mg·L-1磺胺甲惡唑降解效率均達(dá)到60%以上，30 ℃時(shí)降解效率最高，達(dá)到了93.6%。當(dāng)溫度低于20 ℃時(shí)降解效率明顯下降，在20 ℃和15 ℃時(shí)降解率分別為33.8%和56.7%。當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，降解率為48.2%。由此可見，菌株LLE3具有一定的耐冷性，這也與鞘氨醇桿菌屬的其他菌株類似。

圖2 基于LLE3 16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on LLE3 16S rRNA sequence

圖3 不同溫度對(duì)LLE3降解效率的影響Fig.3 Effect of different temperatures on the degradation efficiency of LLE3

2.4 初始pH對(duì)菌株LLE3降解效率的影響

pH是影響菌株降解效率的關(guān)鍵因素之一，不同pH對(duì)菌株降解影響的結(jié)果(圖4)表明，LLE3可以在pH為4～9的范圍內(nèi)降解磺胺甲惡唑，最適pH為7，最高降解效率達(dá)到了92.2%。此外，LLE在pH為5～8的范圍內(nèi)降解效率均超過50%，說(shuō)明菌株LLE3在偏中性的條件下降解效率較高。當(dāng)pH降低至4時(shí)，降解效率仍有35.5%，說(shuō)明菌株對(duì)酸性條件具有一定的耐受性。當(dāng)pH為9時(shí)，降解效率為42.4%，說(shuō)明LLE3在偏酸、中性和偏堿的條件下均可使用。

圖4 不同pH對(duì)LLE3降解效率的影響Fig.4 Effect of different pH on the degradation efficiency of LLE3

2.5 初始接種濃度對(duì)菌株LLE3降解效率的影響

研究了不同初始接種濃度對(duì)菌株降解磺胺甲惡唑的影響，如圖5所示，當(dāng)接種濃度為5×107CFU·mL-1時(shí)，菌株LLE3降解效率最高，為92.1%，且在初始接種濃度(2～8)×107CFU·mL-1的范圍內(nèi)降解效率均超過90%，當(dāng)接種量增加為8×107CFU·mL-1時(shí)降解效率為85%，10×107CFU·mL-1時(shí)降解效率為76.9%。由此可見，菌株LLE3在提高接種濃度時(shí)降解效率無(wú)明顯變化，初始接種量對(duì)菌株LLE3降解率影響較低。

圖5 接種量對(duì)LLE3降解效率的影響Fig.5 Effect of inoculation on the degradation efficiency of LLE3

2.6 菌株LLE3降解磺胺甲惡唑特性研究

研究了最適條件下菌株LLE3對(duì)磺胺甲惡唑的降解特性，從結(jié)果(圖6)中可知，菌株LLE3對(duì)磺胺甲惡唑的降解效率最高發(fā)生在1～4 d，在4 d時(shí)降解率達(dá)82.2%，而菌體濃度也相應(yīng)達(dá)到了83.2×107CFU·mL-1，降解效率與菌體生長(zhǎng)濃度呈正相關(guān)。5～7 d時(shí)，菌株LLE3進(jìn)入了生長(zhǎng)平臺(tái)期，相應(yīng)的對(duì)磺胺甲惡唑降解速率逐漸降低，最終，菌株LLE3在7 d內(nèi)對(duì)初始濃度為100 mg·mL-1的磺胺甲惡唑降解率達(dá)到了93.4%。本研究首次發(fā)現(xiàn)水谷鞘氨醇桿菌對(duì)磺胺甲惡唑具有較好的降解效果。

2.7 菌株LLE3降解磺胺甲惡唑代謝產(chǎn)物的研究

運(yùn)用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法，檢測(cè)了磺胺甲惡唑在MSM液體培養(yǎng)基中經(jīng)菌株LLE3降解3 d后的代謝產(chǎn)物，結(jié)果如圖7所示。檢測(cè)到2個(gè)片段的質(zhì)荷比分別為253和281 m·z-1，根據(jù)磺胺甲惡唑的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的推斷，質(zhì)荷比253 m·z-1為磺胺甲惡唑母體化合物，降解質(zhì)荷比為281 m·z-1的物質(zhì)推斷為N-[4-(1，2-惡唑-3-基氨磺?；?苯基]乙酰胺。該菌株主要是將磺胺甲惡唑一端的苯基上的氨基氧化為乙酰胺基，同時(shí)將甲惡唑環(huán)上的甲基去掉，從而成為最終的產(chǎn)物N-[4-(1，2-惡唑-3-基氨磺酰基)苯基]乙酰胺。

3 討論

鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)為不產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛存在于自然界中。Yabuuchi等[24]首次提出將Sphingobacterium單獨(dú)成屬以來(lái)，鞘氨醇桿菌屬的新種相繼被科研工作者們從不同的生境中發(fā)掘，如土壤、植物、動(dòng)物，甚至心室體液、尿液等臨床樣本。其中，嗜溫鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriumthalpophilum)和多食鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriummultivorum)被報(bào)道具有石油烴的降解能力，如SphingobacteriummultivorumSWH-2具有較強(qiáng)的石油降解活性，并在該菌中發(fā)現(xiàn)了降解酶[25]。此外，雖然目前發(fā)現(xiàn)的大部分鞘氨醇桿菌都對(duì)多種抗生素具有抗藥性，但迄今為止，尚無(wú)鞘氨醇桿菌屬對(duì)抗菌藥物直接降解的相關(guān)報(bào)道。本研究分離的水谷鞘氨醇桿菌是第一次報(bào)道鞘氨醇桿菌屬可以降解磺胺甲惡唑。該菌的發(fā)現(xiàn)不但填補(bǔ)了鞘氨醇桿菌屬菌株的功能范圍，也為修復(fù)磺胺甲惡唑污染的養(yǎng)殖環(huán)境提供了寶貴的微生物資源。

圖6 LLE3降解磺胺甲惡唑降解特性Fig.6 Degradation characteristics of LLE3 degrading sulfamethoxazole

圖7 菌株LLE3降解磺胺甲惡唑產(chǎn)物的質(zhì)譜圖Fig.7 Mass spectrum of the sulfamethoxazole degradation product by strain LLE3

近年來(lái)，研究人員已經(jīng)從土壤、活性污泥、養(yǎng)殖水體中分離到了一批具有較好磺胺甲惡唑降解能力的菌株，如PlanococcuskocuriiO516[13]，Achromobactersp. JL9[14]，Phanerochaetechrysosporium[12]和Acinetobactersp.[17]等，與已報(bào)道的菌株相比較，菌株LLE3具有更佳的環(huán)境適應(yīng)性和耐受性。從環(huán)境因素對(duì)降解效果影響的研究中可以看出，菌株LLE3在15～45 ℃、pH 4～9的范圍內(nèi)均可降解磺胺甲惡唑，這對(duì)于將來(lái)該菌株在養(yǎng)殖環(huán)境中的實(shí)際應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。且生理生化結(jié)果顯示，LLE3可以利用多種碳源，可見該菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)代謝類型豐富，具有降解其他復(fù)雜化合物的潛力。

現(xiàn)有報(bào)道結(jié)果表明，鞘氨醇桿菌屬的菌株大多都不能產(chǎn)生抗生素，但對(duì)抗生素具有抗藥性，這是鞘氨醇桿菌適應(yīng)極端環(huán)境的重要因素[26]?？股厥且活惐旧硪种莆⑸锷L(zhǎng)的化合物，因此降解菌首先需要具備抗生素的耐藥性。然而，有研究指出，Klebsiellapneumoniae能利用氯霉素作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，但是藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些菌株對(duì)氯霉素是敏感的，這表明細(xì)菌的耐藥過程和降解藥物過程是兩個(gè)獨(dú)立的途徑[27-28]。從菌株LLE3降解磺胺甲惡唑的產(chǎn)物來(lái)看，該菌主要是將磺胺甲惡唑一端的苯基上的氨基氧化為乙酰胺基，同時(shí)將甲惡唑環(huán)上的甲基去掉，從而成為最終的產(chǎn)物N-[4-(1，2-惡唑-3-基氨磺?；?苯基]乙酰胺。說(shuō)明該菌具有明確的磺胺甲惡唑的降解功能，不僅僅是具有較好的耐受性。雖然從降解產(chǎn)物上來(lái)看，該菌并不能完全礦化磺胺甲惡唑，但產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物N-[4-(1，2-惡唑-3-基氨磺酰基)苯基]乙酰胺為首次報(bào)道，為研究微生物降解磺胺類藥物途徑的研究提供了一定參考。

本研究運(yùn)用連續(xù)富集傳代結(jié)合高通量測(cè)序的方法，分析了磺胺甲惡唑降解富集物中微生物群落組成和變化，找出了與降解相關(guān)的核心微生物。進(jìn)一步分離純化到了高效磺胺甲惡唑降解菌，經(jīng)初步鑒定為SphingobacteriummizutaiiLLE3。通過單因素試驗(yàn)確定了該菌最適的降解條件為30 ℃，pH 7，初始接種量5.0×107CFU·mL-1。該菌7 d內(nèi)對(duì)磺胺甲惡唑降解效率為93.7%。菌株LLE3降解磺胺甲惡唑的主要代謝產(chǎn)物為N-[4-(1，2-惡唑-3-基氨磺?；?苯基]乙酰胺，本研究為磺胺甲惡唑污染的生物修復(fù)提供了優(yōu)良的微生物資源。