利用超微粉碎提高花色苷生物可接受率

張佩雯，黃光捷，駱昌錦，冼瑩瑩，周欣燕，郭紅輝，*

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 東莞 523808；2.韶關(guān)學(xué)院英東食品學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

花色苷是具有2-苯基苯并吡喃結(jié)構(gòu)的一類(lèi)植物化學(xué)物，對(duì)可見(jiàn)光的最大吸收波長(zhǎng)在460 nm～540 nm處，可以使植物呈現(xiàn)紅色、紫色乃至黑色。深色植物性食品中的花色苷含量較為豐富，例如漿果（越橘、藍(lán)莓、草莓、葡萄和黑醋栗等）、蔬菜（紫甘藍(lán)、紫洋蔥和紅菜薹等）、薯類(lèi)（紫馬鈴薯和紫番薯）和谷物（高粱、紫玉米和黑米等），花色苷含量通常介于50 mg/kg～3 100 mg/kg（以鮮重計(jì)），平衡膳食者每天通過(guò)這些食物可以攝入數(shù)十毫克的花色苷[1-2]。除了賦予植物性食品鮮艷的色澤，近年來(lái)的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)增加膳食花色苷攝入有助于降低非酒精性脂肪性肝病、2型糖尿病及心血管疾病等慢性代謝性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。根據(jù)已有對(duì)慢性病人群的隨機(jī)對(duì)照臨床干預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)提出花色苷預(yù)防慢性病的攝入量特定建議值為50.0 mg/d[5]。然而，由于食物破碎程度和基質(zhì)成分的影響，不同食物來(lái)源花色苷的生物利用度和生物活性差異較大，攝入量和健康效應(yīng)之間的量效關(guān)系尚不明確，無(wú)法制定準(zhǔn)確的攝入量參考值范圍[6]。

花色苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)含有多個(gè)酚羥基，極性較強(qiáng)，容易與蛋白質(zhì)、膳食纖維等食物基質(zhì)成分結(jié)合在一起，加上細(xì)胞壁對(duì)消化酶的物理阻隔效應(yīng)，在消化過(guò)程中難以釋放出來(lái)，無(wú)法被吸收利用[7-8]。準(zhǔn)確判定膳食花色苷經(jīng)過(guò)胃腸消化后可被機(jī)體利用的程度，即花色苷的生物可接受率或生物利用度，是建立攝入量和健康效應(yīng)關(guān)系的前提條件。體內(nèi)試驗(yàn)往往存在研究周期長(zhǎng)、個(gè)體間的差異、結(jié)果重現(xiàn)性差、費(fèi)用高、倫理限制等問(wèn)題，而近些年不斷完善的體外模擬胃腸消化模型為研究多酚類(lèi)植物化學(xué)物的生物利用提供了便利條件[9]。模擬體外消化模型分為胃消化和腸消化兩個(gè)階段。基于國(guó)際多領(lǐng)域?qū)＜夜沧R(shí)的INFOGEST建立了一套更加接近人體生理環(huán)境的體外口腔-胃-小腸模擬消化吸收模型，對(duì)不同食物當(dāng)中的營(yíng)養(yǎng)素進(jìn)行了體外模擬消化吸收研究，提出可以用消化液當(dāng)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的釋放量與總攝入量的比值表示其生物可接受率，模擬某種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在機(jī)體的消化吸收利用情況[10]。

因此，本研究選擇藍(lán)莓、紫甘藍(lán)、紫番薯和黑米分別作為漿果、蔬菜、薯類(lèi)和谷物的代表性食物，通過(guò)超微粉碎和消化酶破除細(xì)胞壁和食物基質(zhì)對(duì)花色苷的束縛作用，利用體外胃腸消化模型研究花色苷生物可接受率的變化，為準(zhǔn)確評(píng)估食物花色苷可被機(jī)體利用的程度提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

“兔眼”藍(lán)莓：安慶市茂祥農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司；紫甘藍(lán)、“廣紫薯八號(hào)”紫番薯、黑米：韶關(guān)市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。胃蛋白酶（≥250 U/mg）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；豬膽鹽和豬胰酶復(fù)合物（蛋白酶≥100 U/mg，淀粉酶≥100 U/mg，脂肪酶≥8 U/mg）：廣州鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；C18色譜柱（粒徑5μm，250mm×4.6mm）、甲醇、甲酸色譜純：北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心；其它化學(xué)試劑為市售分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

DHG-9420A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DZF-6050真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DLF18中藥粉碎機(jī)：溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司；YF2-2氣流式超微粉碎機(jī)：瑞安永歷制藥機(jī)械有限公司；SHA-B恒溫振蕩水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司；TM3030電子顯微鏡：日立高新技術(shù)公司；LS-POP激光粒度儀：珠海歐美克儀器有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀：島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植物材料粉碎

60℃條件下，利用鼓風(fēng)干燥箱和真空干燥箱將藍(lán)莓、紫甘藍(lán)、紫番薯和黑米干燥至含水量≤10%。植物材料投料進(jìn)入中藥粉碎機(jī)中進(jìn)行機(jī)械粉碎，得到粗粉；利用氣流式超微粉碎機(jī)將植物材料粗粉在轉(zhuǎn)速20 000 r/min條件下粉碎兩次，每次3 min，得到超微粉。將制備好的粉末用鋁箔袋密封，置于-18℃冰箱中保藏待用。

1.3.2 粒度測(cè)定

準(zhǔn)確稱取粗粉和超微粉樣粉各1.00 g，溶于80 mL蒸餾水中，用磁力攪拌器攪拌10 min至均勻，使用激光粒度分析儀測(cè)定樣品粒徑，采用公式計(jì)算離散度表示樣品粒徑的分布情況。

式中：Dn代表有n%的顆粒粒徑小于該數(shù)值[11]。

1.3.3 顯微形貌

將粗粉與超微粉分別均勻粘附在導(dǎo)電膠帶上，置于載物臺(tái)，選擇5個(gè)視野拍照。

1.3.4 主要營(yíng)養(yǎng)成分和花色苷含量測(cè)定

參照現(xiàn)行食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[12]分別測(cè)定脂肪（GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》）、蛋白質(zhì)（GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》）、總膳食纖維（GB 5009.88—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中膳食纖維的測(cè)定》）、水分（GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》）和灰分（GB 5009.4—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》）的含量，計(jì)算出碳水化合物含量（GB/Z 21922—2008《食品營(yíng)養(yǎng)成分基本術(shù)語(yǔ)》）[12]。

準(zhǔn)確稱量1.00 g粉體，投入10 mL甲醇，密封后在37℃的恒溫水浴搖床中60 r/min振蕩提取2 h，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，用分光光度計(jì)在520 nm處測(cè)定濾液吸光度，采用公式計(jì)算粉體花色苷含量[8]。

式中：X為粉體花色苷含量，mg/g；ΔT為pH1.0和pH4.5緩沖液稀釋待測(cè)液后的吸光度差值；V為稀釋體積，L；F為稀釋倍數(shù)；M為矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量（M=449.2）；ε為矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)[ε=26 900 L/（mol·cm）]；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 模擬消化

取植物材料粗粉和超微粉各1.00 g置于離心管中，加入人工胃液15 mL（表1）[10]，用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值為2.0，置于振蕩速率為40 r/min，37℃的恒溫水浴搖床中避光振蕩2h，完成模擬胃消化；加入25mL人工腸液，用飽和NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8，置于振蕩速率為60 r/min，37℃恒溫水浴搖床避光振蕩4 h，完成模擬小腸消化；收集消化液，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，在高效液相色譜儀檢測(cè)濾液花色苷含量，以同體積甲醇代替人工胃液和腸液，作為花色苷最大釋放量參照[13]。

表1 人工消化液組成Table 1 Composition of simulated digestion fluids

1.3.6 花色苷生物可接受率

高效液相色譜儀進(jìn)樣量為20 μL，洗脫速度設(shè)置為1.0 mL/min，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為2%甲酸水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為520 nm，梯度洗脫：0～5 min，90%B；5 min～35 min，90%～60%B；35 min～55 min，60%～40%B；55 min～60 min，40%～0%B；60 min～70 min，90%B。

對(duì)各個(gè)樣品消化液花色苷峰面積進(jìn)行自動(dòng)積分求和，以甲醇提取樣品的花色苷峰面積總和設(shè)定為100%，采用公式計(jì)算花色苷生物可接受率[13]。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果用3次重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)±S表示，對(duì)粗粉與超微粉的理化參數(shù)運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行分析，對(duì)花色苷生物可接受率采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為p＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 超微粉碎對(duì)食物樣品粒徑分布的影響

食物樣品粗粉和超微粉粒徑分布見(jiàn)表2。

表2 食物樣品粗粉和超微粉粒徑分布Table 2 Particle size distribution of coarse and superfine food powders

植物細(xì)胞的直徑通常為30 μm～100 μm，一般機(jī)械粉碎得到的粉體直徑約為150 μm～300 μm，很難將細(xì)胞壁破碎[14]。經(jīng)過(guò)超微粉碎，4種食物樣品的粒徑D10、D50和D90均顯著低于粗粉（表2），其中D50符合超微粉的粒徑判斷標(biāo)準(zhǔn)（≤25 μm），從而達(dá)到了破除細(xì)胞壁的預(yù)期效果[15]。紫甘藍(lán)、黑米和紫番薯3種食物樣品超微粉離散度均顯著小于粗粉，說(shuō)明其粒徑分布更加均勻；然而，超微粉碎并未使藍(lán)莓果粉離散度顯著降低，可能與漿果中果膠質(zhì)含量較高，粉體不易分散有關(guān)[16]。

2.2 不同粉體的顯微形貌

4種樣品粗粉和超微粉放大400倍的顯微形貌如圖1所示。

由圖1可知，粗粉顆粒明顯大于超微粉，紫甘藍(lán)、黑米和紫番薯3種離散度較大的粗粉粒徑大小更為不均勻，形狀也不規(guī)則；與其他學(xué)者的研究結(jié)果相似[14-15]，經(jīng)過(guò)超微粉碎，食物樣品的絕大部分纖維束冠狀結(jié)構(gòu)被破碎，質(zhì)地更加蓬松，粉體顆粒大小均勻，直徑較小，顆粒形貌趨于一致。

圖1 各種食物粉體顯微形貌Fig.1 The micromorphology of various food powders

2.3 超微粉碎對(duì)食物樣品主要營(yíng)養(yǎng)成分的影響

食物破碎程度會(huì)直接影響到消化酶與食物顆粒的接觸，從而決定營(yíng)養(yǎng)素的消化吸收率[17]。為明確粉碎程度對(duì)宏量營(yíng)養(yǎng)素釋放的影響，利用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品理化檢驗(yàn)方法對(duì)4種食物樣品的營(yíng)養(yǎng)成分組成做了分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 4種食物樣品粗粉和超微粉的營(yíng)養(yǎng)成分組成Table 3 Nutrient composition of coarse and superfine powders of four food samples

表3結(jié)果表明，粉碎程度對(duì)食物脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物、總膳食纖維和灰分含量檢測(cè)值并沒(méi)有造成顯著影響。經(jīng)過(guò)超微粉碎后，由于破除了細(xì)胞壁和部分食物基質(zhì)對(duì)花色苷釋放的阻隔作用，4種食物樣品的花色苷含量檢測(cè)值均有顯著提高，其中藍(lán)莓和紫甘藍(lán)的檢測(cè)值增加幅度統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著（p<0.01）。

2.4 超微粉碎和纖維素酶對(duì)食物樣品花色苷生物可接受率的影響

花色苷的生物活性大小取決于其被機(jī)體吸收和利用程度，現(xiàn)有動(dòng)物整體生物利用度試驗(yàn)和人群代謝動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，不同食物來(lái)源花色苷的生物利用度差異較大，介于0.8%～12.4%之間[18]，生物利用度從大到小順序?yàn)椋夯ㄉ諉误w、花色苷提取物、澄清果汁和固態(tài)食物[19]?；ㄉ赵谥参锛?xì)胞內(nèi)可以通過(guò)共價(jià)鍵、氫鍵和親水作用力與碳水化合物和蛋白質(zhì)等基質(zhì)成分結(jié)合，在胃消化階段，胃液的強(qiáng)酸性可以將部分花色苷從食物基質(zhì)解離出來(lái)，通常不同食物花色苷的釋放量差別不大，而在腸消化階段，pH值偏堿性，花色苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)由黃烊鹽陽(yáng)離子轉(zhuǎn)變?yōu)椴闋柾蛘呒状际郊賶A，與食物基質(zhì)結(jié)合更加緊密，就需要蛋白酶和淀粉酶酶解將花色苷從食物基質(zhì)釋放[20]。超微粉碎和纖維素酶對(duì)食物樣品花色苷生物可接受率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 4種食物樣品粗粉和超微粉的花色苷生物可接受率Fig.2 Anthocyanin bioaccessibility of coarse and superfine powders of four food samples

圖2結(jié)果顯示，藍(lán)莓、黑米和紫番薯粗粉花色苷的生物可接受率均超過(guò)60%，而紫甘藍(lán)粗粉的生物可接受率最低，僅為46.5%。細(xì)胞壁的物理阻隔和食物基質(zhì)結(jié)合效應(yīng)可能是影響花色苷在腸道被吸收利用的主要因素[21]。進(jìn)一步對(duì)超微粉花色苷生物可接受率的檢測(cè)結(jié)果表明，藍(lán)莓、紫甘藍(lán)、黑米和紫番薯超微粉花色苷峰面積均顯著大于粗粉（p＜0.05），計(jì)算得到的花色苷生物可接受率較粗粉分別提高37.1%、87.7%、24.7%和23.8%，說(shuō)明超微粉碎可以有效提高花色苷的生物可接受率。與pH示差法檢測(cè)花色苷總量結(jié)果相似（表3），藍(lán)莓和紫甘藍(lán)不同粉體花色苷的生物可接受率差異極顯著，可能與粉體較高膳食纖維含量有關(guān)。

3 結(jié)論

綜上所述，超微粉碎可以有效破除細(xì)胞壁和食物基質(zhì)對(duì)藍(lán)莓、紫甘藍(lán)、黑米和紫番薯中花色苷的阻隔效應(yīng)，將花色苷的生物可接受率提高23.8%～87.7%。在利用纖維素含量較高的植物材料制備花色苷提取物或者固體飲料等富含花色苷的食品時(shí)，通過(guò)超微粉碎輔助處理原料將有助于提高花色苷的提取效率或者機(jī)體對(duì)花色苷的吸收利用程度。