索骨丹中黃酮的抗氧化活性分析*

張 韞，楊 秀，劉 學(xué)，史瑞萌，馬曉彤

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

索骨丹，又名水五龍、慕荷、牛角七等，是虎耳草科植物七葉鬼燈檠的根莖，有涼血止血，消腫解毒等作用，內(nèi)用可治療甲狀腺腫、咽喉腫痛，外用可治療外傷出血、子宮脫垂等[1]。索骨丹中含有多元酚、蒽醌、黃酮、多糖等多種成分，黃酮是其主要成分之一[2]。索骨丹中的黃酮具有良好的抗氧化性，對自由基能起到清除作用，同時可防止細(xì)胞衰老退化并增強免疫力[3]。

實驗主要用超聲提取法提取索骨丹中的黃酮，然后以黃酮為抗氧化劑(自由基清除劑)，用熒光和紫外光譜法測定索骨丹黃酮對羥自由基、亞硝酸鹽、超氧陰離子的清除及對鐵離子還原能力，并與經(jīng)典抗氧化性劑(維生素C)對比，分析評價索骨丹中黃酮的抗氧化性。實驗從清除自由基能力的角度評價索骨丹黃酮的體外抗氧化活性，為索骨丹藥材的深入開發(fā)利用及大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，對新型食品添加劑的研發(fā)也具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

索骨丹藥材：經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院汪興軍老師鑒定為七葉鬼燈檠的根莖；蘆丁：純度98%，批號20140919，士鋒生物科技有限公司；焦性沒食子酸、N-1-萘乙二胺鹽酸鹽：分析純，科密歐化學(xué)試劑有限公司；苯甲酸：分析純，北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；無水對氨基苯磺酸：分析純，天力化學(xué)試劑有限公司；2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)：純度99.7%，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為分析純，市售。

紫外-可見分光光度計：UV-762，酸度計：PHS-3C，上海佑科儀器儀表有限公司；熒光分光光度計：LS-55，美國PerkinElmer有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-2000A，循環(huán)水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)，予華儀器有限責(zé)任公司；高速萬能粉碎機：FW200A，北京科偉永興儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：黃驊航天儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集與處理

索骨丹藥材粉碎過250 μm篩，得索骨丹粉末。稱取30 g索骨丹粉末置于索氏提取器中，加入3倍體積的石油醚回流去除脂質(zhì)，至石油醚呈無色，揮干溶劑備用。稱取處理后的索骨丹粉末5 g置于錐形瓶中用乙醇作為提取溶劑，以超聲法提取總黃酮，并旋蒸濃縮溶劑至20～30 mL，得索骨丹黃酮提取液。采用真空干燥法烘干溶劑用分析天平準(zhǔn)確稱量，確定黃酮的濃度。

1.2.2 紫外-可見分光光度法測定索骨丹黃酮的抗氧化能力

1.2.2.1 索骨丹黃酮對羥自由基的清除能力

Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基與加入的水楊酸生成2，3-二羥基苯甲酸，該物質(zhì)在510 nm處有紫外-可見區(qū)吸收[4-5]。如在反應(yīng)體系中加入抗氧化物質(zhì)降低體系中的羥自由基濃度，就會降低2，3-二羥基苯甲酸濃度，導(dǎo)致510 nm處的吸光度減小。

精密吸取1.0 mLc(FeSO4)=8.8 mmol/L溶液于試管中，依次加入1.0 mLc(水楊酸)=9.1 mmol/L溶液、1.0 mL索骨丹提取溶液、5.0 mL蒸餾水振蕩混勻后加入1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.06% H2O2溶液，避光條件下37 ℃水浴30 min，于510 nm處測定吸光度A1；將索骨丹提取溶液替換成等量蒸餾水，測得吸光度為A0。清除率的計算見公式(1)，同法測定相同質(zhì)量濃度下維生素C的清除率。

(1)

1.2.2.2 索骨丹黃酮對亞硝酸鹽的清除能力

在2個10 mL的容量瓶中均加入5.0 μg/mL的NaNO22 mL，其中一個容量瓶中加入5 mL黃酮提取液，搖勻放置10 min，另一份作空白。兩瓶內(nèi)均加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%對氨基苯磺酸溶液，搖勻放置5 min，再加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，加水定容，靜置15 min。在583 nm處測吸光度，加黃酮提取液的溶液測得吸光度A1，未加黃酮提取液的溶液吸光度A0，以公式(1)計算清除率[4-7]，同法測定相同濃度下維生素C的清除率。

1.2.2.3 索骨丹黃酮對超氧陰離子的清除能力

將1.0 mL不同濃度黃酮提取液加入2.5 mLc(Tris-HCl)=50 mmol/L緩沖液(pH=8.2)，定容于25 mL容量瓶。在25 ℃下反應(yīng)20 min，再加入1.0 mLc(鄰苯三酚)=3.0 mmol/L溶液反應(yīng)5 min，加入HCl溶液終止反應(yīng)，在325 nm處測定吸光度記為A1，用等體積的蒸餾水代替黃酮提取液，測得吸光度為A0，代入公式(1)計算清除率，同法測定相同濃度下維生素C對超氧陰離子的清除率[8]。

1.2.2.4 鐵離子還原能力(FRAP)測定

FRAP工作液的配制：0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3溶液，以體積比10∶1∶1比例混合配制FRAP工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL FeSO4溶液各0.1 mL，加入3.0 mL FRAP工作液，3.0 mL蒸餾水，37 ℃反應(yīng)5 min。以蒸餾水代替FeSO4加入FRAP工作液為空白，于593 nm處測定吸光度。以質(zhì)量濃度ρ(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=1.47ρ+0.07，相關(guān)系數(shù)R=0.999 1。

樣品的抗氧化活性(FRAP值)以達到相同吸光度所需FeSO4的物質(zhì)的量表示(mmol)。取不同質(zhì)量濃度的黃酮樣品溶液0.030、0.060、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL 0.1 mL，用上述FeSO4的方法測定抗氧化能力。根據(jù)FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出對應(yīng)FeSO4溶液的濃度，樣品的抗氧化活性以達到同樣的吸光度數(shù)值為FRAP值[9-10]。同法測定相同質(zhì)量濃度下維生素C的抗氧化活性。

1.2.3 熒光分光光度法測定索骨丹黃酮的抗氧化能力

1.2.3.1 索骨丹黃酮對羥自由基的清除能力

在10 mL的比色管中，依次加入pH=5.47 KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液2.0 mL，c(苯甲酸)=1.0 mol/L溶液2.0 mL，c(FeSO4)=1.0 mmol/L溶液0.6 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3% H2O2溶液1.2 mL，加蒸餾水定容至刻度，混勻，反應(yīng)2 h，進行熒光光譜掃描確定最大激發(fā)波長及發(fā)射波長[5]。

按上述方法加入試劑，以λex=290 nm、λem=598 nm為測定波長，狹縫均為10 nm，掃速為300 nm/min，測定上述體系的熒光強度F，計算其與空白參比溶液(苯甲酸與緩沖溶液)熒光強度F0之差ΔF，由此可間接求得Fenton體系所產(chǎn)生羥自由基的量[11-12]。于上述的Fenton體系中，加入不同濃度的索骨丹黃酮提取液再加入FeSO4溶液，同法測定熒光強度Fs，則羥自由基清除率的計算見公式(2)。

(2)

1.2.3.2 索骨丹黃酮對超氧陰離子的清除能力

在第1個試管中加入索骨丹的黃酮提取液和0.8 mLc[Al(NO3)3]=1.0 mmol/L溶液搖勻，稀釋至5 mL，5 min后以λex=320 mm、λem=596 nm為測定波長，狹縫10 nm，掃速300 nm/min，測其熒光強度F0。在另一試管中加入pH=8.2 Tris-HCl 緩沖液2.0 mL，在25 ℃中加熱10 min，再加入預(yù)熱過的c(鄰苯三酚)=0.3 mmol/L溶液0.1 mL，立即加入不同濃度的黃酮提取液，反應(yīng)4 min后加入c[Al(NO3)3]=1.0 mmol/L溶液搖勻，稀釋至5 mL，測其熒光強度F1。計算清除率見公式(3)。

(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外分光光度法的測定結(jié)果

2.1.1 對羥自由基清除的測定

紫外光譜法測定黃酮對羥自由基清除率，見圖1。

ρ/(μg·mL-1)圖1 紫外光譜法測定黃酮對羥自由基清除率

由圖1可知，索骨丹黃酮對羥自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的不斷增大而增大，ρ(索骨丹黃酮)=16 μg/mL，清除率可達63.54%；ρ(維生素C)=16 μg/mL時清除率為55.52%。質(zhì)量濃度范圍相同，索骨丹黃酮對羥自由基的清除能力優(yōu)于維生素C的清除能力。

2.1.2 對亞硝酸鹽清除的測定

ρ/(μg·mL-1)圖2 紫外光譜法測定黃酮對亞硝酸鹽的清除率

由圖2可知，ρ(索骨丹黃酮)=1～6 μg/mL，對亞硝酸鹽的清除率是隨質(zhì)量濃度的增大而增大，最高可達66.38%，ρ(索骨丹黃酮)=6～14 μg/mL，對亞硝酸鹽的清除率呈平穩(wěn)趨勢，基本保持在約66%；ρ(維生素C)=1～4 μg/mL，對亞硝酸鹽的清除率隨質(zhì)量濃度的增大而迅速增大，ρ(維生素C)=4～14 μg/mL，清除率上升趨勢減緩，其清除率最高可達52.55%，可以看出，質(zhì)量濃度范圍相同，索骨丹黃酮對亞硝酸鹽的清除能力優(yōu)于維生素C。

2.1.3 對超氧陰離子清除的測定

鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng)生成超氧陰離子，在325 nm處有最大紫外吸收。如在體系中加入能清除超氧陰離子的物質(zhì)可以使生成的超氧陰離子含量降低，從而導(dǎo)致吸光度降低。因此，可通過測定325 nm處吸光度的判斷索骨丹中黃酮對超氧陰離子的清除能力，見圖3。

ρ/(μg·mL-1)圖3 紫外光譜法測定黃酮對超氧陰離子的清除率

由圖3可知，ρ(索骨丹黃酮)=1～16 μg/mL，對超氧陰離子的清除率隨質(zhì)量濃度的增大而增大，拐點位于2.5 μg/mL，清除率最高可達87.66%；ρ(維生素C)=1～10 μg/mL，對超氧陰離子的清除率是隨質(zhì)量濃度的增大而增大，ρ(維生素C)=10～16 μg/mL，清除率隨質(zhì)量濃度的增大基本不變甚至有下降趨勢，其最大清除率達71.22%。質(zhì)量濃度范圍相同，索骨丹黃酮對超氧陰離子的清除能力優(yōu)于維生素C。

2.1.4 對鐵離子還原能力的測定

Fe3+與TPTZ在酸性條件下無顏色反應(yīng)，加入抗氧化物質(zhì)時發(fā)生還原反應(yīng)生成藍色Fe2+-TPTZ，在593 nm處有紫外吸收。測定593 nm吸光度就可以確定總抗氧化能力，見圖4。

ρ/(μg·mL-1)圖4 鐵離子還原能力測定

由圖4可知，ρ(索骨丹黃酮)=0.03～0.5 μg/mL，對鐵離子的還原隨質(zhì)量濃度的增大而迅速增大的，ρ(索骨丹黃酮)=0.5～1.0 μg/mL清除率趨于平穩(wěn)；ρ(索骨丹黃酮)=0.03～0.5 μg/mL，對鐵離子的還原隨質(zhì)量濃度的增大而迅速增大，ρ(索骨丹黃酮)=0.5～1.0 μg/mL，清除率趨于平穩(wěn)，F(xiàn)RAP最大值為0.372。在該質(zhì)量濃度范圍索骨丹黃酮對鐵離子的還原能力依然優(yōu)于維生素C的清除能力。

2.2 熒光光譜法的測定結(jié)果

2.2.1 對羥自由基清除的測定

實驗發(fā)現(xiàn)索骨丹黃酮對體系的熒光有猝滅作用。以ρ(索骨丹黃酮)為橫坐標(biāo)，對羥自由基的清除率為縱坐標(biāo)作圖，見圖5。

由圖5可知，ρ(索骨丹黃酮)=26～433 μg/mL，索骨丹黃酮對羥自由基的清除率是隨質(zhì)量濃度的增大而增大，ρ(索骨丹黃酮)=433 μg/mL清除率最大，達95.54%。

ρ/(μg·mL-1)圖5 熒光光譜法測定黃酮對羥自由基的清除率

2.2.2 對超氧陰離子清除的測定

以ρ(索骨丹黃酮)為橫坐標(biāo)，對超氧陰離子清除率為縱坐標(biāo)作圖，見圖6。

ρ/(μg·mL-1)圖6 熒光測定黃酮對超氧陰離子的清除率

由圖6可知，ρ(索骨丹黃酮)=0～65 μg/mL，清除率隨質(zhì)量濃度增大而增大，ρ(索骨丹黃酮)=65 μg/mL，索骨丹黃酮對超氧陰離子的清除率最大達77.67%，隨后隨著質(zhì)量濃度的增大清除率逐漸減小。

3 結(jié) 論

實驗采用紫外-可見分光光度法和熒光分光光度法，以維生素C為對照，測定索骨丹黃酮對自由基的清除能力。結(jié)果表明索骨丹的黃酮對超氧陰離子、羥自由基、亞硝酸鹽3種自由基具有一定的清除能力且對鐵離子有較好的還原能力，且清除作用隨質(zhì)量濃度增加而增強，均優(yōu)于經(jīng)典抗氧化劑維生素C，具有良好的抗氧化活性。對陜西地方藥材索骨丹的深度開發(fā)及抗氧化研究提供了理論基礎(chǔ)和實驗參考。