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      利用納米孔測序鑒定蓖麻蠶病害

      2021-03-30 02:21:20陳大嵩李健雄戴建青
      環(huán)境昆蟲學(xué)報 2021年1期
      關(guān)鍵詞:蠶病文庫高通量

      陳大嵩,黃 鴻,吳 華,李健雄,戴建青

      (廣東省科學(xué)院動物研究所,廣東省動物保護與資源利用重點實驗室,廣東省野生動物保護與利用公共實驗室,廣州 510260)

      蓖麻蠶Samiaricini,又叫惠利蠶、木薯蠶,大蠶蛾科Saturniidae樗蠶屬的馴養(yǎng)絹絲與食用的非滯育經(jīng)濟型昆蟲。原產(chǎn)于印度東北部的阿薩姆邦,由寬帶樗蠶Samiacanningi馴化而來(Peigler & Calhoun, 2013)。我國自1951年,由中國科學(xué)院實驗生物研究所朱洗教授引進飼養(yǎng)蓖麻蠶。蓖麻蠶繭殼奶白色,可用于生產(chǎn)絹紡原料,為全世界僅次于家蠶與柞蠶的第三大絹絲昆蟲,其蠶絲質(zhì)量僅次于家蠶BombyxmoriLinnaeus并優(yōu)于柞蠶AnthereapernyiGuerin-Meneville (van Beeketal., 2000),蠶絲可設(shè)計成優(yōu)良的生物材料與細胞支撐介質(zhì)(Paletal., 2013),其熟蠶與蛹亦是優(yōu)質(zhì)昆蟲食品(Longvahetal., 2011),蠶蛹油脂可提煉優(yōu)質(zhì)健康的食用油(王衛(wèi)飛等, 2018),卵可繁殖多種寄生蜂(莫現(xiàn)會等, 2016)。蓖麻蠶即可室內(nèi)飼養(yǎng)亦可放養(yǎng),除家蠶外,為僅有的幾種可以在室內(nèi)大量圈養(yǎng)的絹絲昆蟲。蓖麻蠶的寄主植物相較家蠶與柞蠶更廣,一般以大戟科的蓖麻與木薯做飼料大量飼養(yǎng),替代寄主包括大戟科的烏桕Sapiumsebiferum(L.)Roxb.、夾竹桃科的雞蛋花Plumeriarubra、苦木科的臭椿Ajugalupulina、馬??岂R桑CoriarianepalensisWall.、蕓香科吳茱萸Euodiaruticarpa、菊科的蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz.和萵苣LactucasativaL. var. angustanaIrish.等。以蓖麻-蓖麻蠶與木薯-蓖麻蠶的形式進行栽培-養(yǎng)殖的聯(lián)合增加了蓖麻與木薯的產(chǎn)值,是帶動蓖麻與木薯種植業(yè)的重要因素之一。

      蓖麻蠶生產(chǎn)上可能遭受侵害的毀滅性病害包括蓖麻蠶微粒子病(劉士賢等, 1964;謝偉東, 1989)、膿病(葉育昌, 1982;李敏棠等, 1985)、軟化病等(吳汝章, 1987),甚至同時感染多個疾病。此外,被污染的蠶室、蠶具、蠶卵很易殘留病原,且隨著累代對病原物的不停積累,蠶病會呈現(xiàn)愈發(fā)嚴(yán)重的趨勢并且病原物亦愈發(fā)難以清除。目前常用的分子生物學(xué)檢測蠶病病原手段包括PCR、實時熒光qPCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增LAMP、巢式PCR等方法。隨著高通量測序方法的發(fā)展,測序成本的不斷降低,高通量檢測方法被廣泛應(yīng)用在各種病原的檢測中。在各高通量測序平臺中,牛津納米孔公司Oxford Nanopore的掌上納米孔測序儀MinION是一款便攜式測序儀,能夠直接進行DNA和RNA測序,擁有超長的讀長、實時測序、隨時終止等特性,被廣泛應(yīng)用在檢測多種病原體中(Warwick Dugdaleetal., 2019;Wongsurawatetal., 2019)。本文通過利用MinION測序儀對蓖麻蠶病蠶組織樣品的DNA進行測序,鑒定病蠶感染的病原物,以實現(xiàn)利用高通量測序技術(shù)對蓖麻蠶疾病進行監(jiān)控。

      1 材料與方法

      1.1 DNA提取

      蠶病取自江蘇省南京市蠶農(nóng)的蠶室,接種于實驗室內(nèi)飼養(yǎng)的蓖麻蠶1齡幼蟲,接種后至2~3齡幼蟲集體發(fā)病,幼蟲脫離寄主、拒食、拉稀,死后呈現(xiàn)發(fā)黑、軟化等癥狀,死后蠶體整體用于DNA提取以獲得足夠量的起始DNA濃度。待測蠶體首先在80℃孵育5 min以殺滅病原以防交叉污染,每1 g蠶體組織放于10 mL CTAB裂解液(2% CTAB,100 mM Tris (pH 8.0),20 mM EDTA,1.4 M NaCl,3%疏基乙醇)中研磨,65℃水浴2 h。待降溫至室溫,加入等體積的酚氯仿異戊醇(25 ∶24 ∶1)萃取,震蕩10 s后離心10 min,取上清液重復(fù)上一步再次加入等體積的酚氯仿異戊醇萃取。上清液加入等體積的異丙醇沉淀DNA,顛倒混勻后,離心10 min。棄上清留取DNA沉淀,加入適量70%乙醇清洗DNA,離心5 min后棄上清并用移液器吸干液體,晾干DNA后加入100 μL無菌水溶解DNA。

      1.2 納米孔測序文庫構(gòu)建

      DNA溶液經(jīng)過微量分光光度計測量DNA含量,取2 μg DNA溶液加入Covaris g-TUBE打斷管上部,8 500 r/min離心1 min將DNA溶液離心到下部,顛倒后8 500 r/min離心1 min將DNA溶液重新離心到上部,DNA溶液取出1 μL加入微量分光光度計測量DNA含量并保證1 μg以上的DNA用于下一步實驗。利用末端修復(fù)試劑盒(NEBNext End repair / dA-tailing Module,E7546)對打斷的DNA進行末端修復(fù),利用磁珠(AMPure XP beads)對DNA文庫進行回收,取1 μL文庫加入微量分光光度計測量DNA含量并保證700 ng以上的DNA用于測序。利用末端連接試劑盒(NEB Blunt/TA Ligase Master Mix,M0367)把連接測序試劑盒(1D Genomic DNA by ligation,SQK-LSK108)中的接頭連接到DNA上,并用AMPure XP磁珠回收DNA文庫,取1 μL文庫加入微量分光光度計測量DNA含量并保證430 ng以上的DNA用于測序。DNA測序芯片(Flow Cells R.9.4.1)放入MinION測序儀并連接電腦,對機器與芯片進行質(zhì)檢并保證芯片有800以上的可用納米孔,從芯片priming port孔取出20~30 μL緩沖液以去除氣泡,從priming port加入800 μL測序緩沖液并靜置5 min。打開sample port孔,再次從priming port加入200 μL測序緩沖液,DNA文庫與連接測序試劑盒中的測序珠(LLB)與緩沖液(RBF)混合,一滴一滴加入到sample port孔,關(guān)閉sample port與priming port。

      1.3 納米孔測序與分析

      MinION測序儀運行48 h,合并獲得fastq文件,測序原始數(shù)據(jù)儲存在國家基因庫生命大數(shù)據(jù)可信計算平臺(項目編號:CNP0001421,測序編號:CNR0339720)。從公共核酸序列數(shù)據(jù)庫NCBI下載各微孢子、各核多角體病毒、白僵菌、柞蠶腸球菌基因組,作為病原體序列數(shù)據(jù)庫,利用minimap2(v2.17)把測序序列比對到病原體數(shù)據(jù)庫中,以檢測測序結(jié)果。

      2 結(jié)果與分析

      通過MinION測序儀獲得2 116 314條DNA序列約1.87 G個堿基,最長53 282 bp,中位數(shù)563,均值884,序列長度大多超過300 bp且集中在 300~1 500 bp長度(圖1)。其中,4 476條序列(占總序列2.1‰)被minimap2比對到病原數(shù)據(jù)庫(圖2),且與比對到蓖麻蠶基因組類似,序列長度與比對堿基數(shù)量的散點圖集中在一片V字區(qū)域,并沒有線性關(guān)系。比對長度超過800 pb的序列中157條序列比對到家蠶微粒子Nosemabombycis基因組,139條序列比對到柞蠶腸球菌Enterococcuspernyi基因組(部分比對結(jié)果見表1),比對長度超過300 bp的序列分別有206和313條序列比對到家蠶微粒子和柞蠶腸球菌基因組(圖3),這說明樣品組織已經(jīng)感染兩種病原體。

      圖1 MinION測序序列長度分布圖Fig.1 Distribution of the sequence lengths obtained by MinION

      圖2 序列比對結(jié)果散點圖Fig.2 Scatter plot of mapping result注:A圖,序列與蓖麻蠶基因組比對結(jié)果;B圖,序列與病原數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果。Note:A, mapping results to genome; B, mapping results to pathogen database.

      表1 部分序列比對結(jié)果

      圖3 比對到病原基因組且比對長度超過300 bp的序列長度分布小提琴圖Fig.3 Violin plot of the sequence length mapped to pathology genomes with more than 300 pb mapping length 注:小提琴圖寬度代表序列的數(shù)量。Note:Widths of violin plot represent the sequence amount.

      3 結(jié)論與討論

      昆蟲組織具有高蛋白質(zhì)、高脂肪的特性,并且在被病原體感染后,壞死組織的DNA被降解,然而高通量測序?qū)NA提取的質(zhì)量有較高的要求并且起始建庫的DNA須達到足夠數(shù)量,因此昆蟲DNA的提取質(zhì)量決定了最終測序結(jié)果的優(yōu)劣。本研究采用提高裂解液與增加萃取次數(shù)的方式提高DNA的提取純度與數(shù)量,為昆蟲構(gòu)建高通量測序文庫提供參考。

      單分子納米孔測序技術(shù)具有高通量、超長讀長、可以直接檢測堿基甲基化修飾、無需PCR擴增和體積較小便于攜帶等優(yōu)勢,可應(yīng)用于動植物和微生物基因組測序、宏基因組測序、RNA直接測序、微生物檢測、DNA與RNA甲基化檢測、mRNA的polyA長度定量等研究(曹影等, 2020。然而,單分子納米孔測序的結(jié)果具有較高的錯誤率,是阻礙其應(yīng)用的關(guān)鍵。目前MinION測序儀的單堿基準(zhǔn)確率約85%,修正后的一致性序列的準(zhǔn)確率可達97%~99%,因此對單分子納米孔測序的分析具有一定的挑戰(zhàn)。在DNA文庫構(gòu)建時,本研究通過DNA低速離心打斷管以獲取更長的DNA片段以構(gòu)建測序文庫,有利于增加序列比對的長度以增加可信度。值得注意的是,minimap2的比對長度并未與序列長度成線性關(guān)系,可能與minimap2的算法有關(guān),因此本研究選取的置信區(qū)間為最低300 bp的比對長度,即比對長度超過300 bp為可信比對結(jié)果。同時,比對數(shù)據(jù)庫中病原物基因組序列的豐富度與病原物種類的選擇,會對鑒定結(jié)果起關(guān)鍵作用并影響最終鑒定結(jié)果。因此,在選擇病原物種核酸序列時,應(yīng)盡可能涵蓋所有蠶病病原的基因組序列,降低比對錯誤與假陽性。本實驗選擇真菌性病害病原、細菌性病害、微粒子基因組以及所有桿狀病毒基因組序列,盡可能構(gòu)建全面的病原序列數(shù)據(jù)庫以降低鑒定的誤差,并且通過過濾序列本身長度短且比對長度較短的序列,以增加比對結(jié)果可靠性。

      本研究通過MinION測序儀對蓖麻蠶病蠶基因組進行測序,與病原基因組序列庫進行比對,無需PCR擴增步驟,降低了假陽性。利用MinION等高通量測序手段對病蠶、蠶具或蠶室進行檢測不僅可以一次性準(zhǔn)確的鑒定蠶病,也摒棄了PCR方法可能具備的假陽性現(xiàn)象,而且其不需要模板設(shè)計引物,甚至可以鑒定新病原等的特性,可以與PCR鑒定方法形成互補,對蠶病的全面監(jiān)測提供保障。

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