朱紅毛斑蛾實(shí)時熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選

陳 煉，田 忠，王小云，陳學(xué)敏，陸 溫，王小平，鄭霞林*

(1. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070)

朱紅毛斑蛾P(guān)haudaflammans(Walker)(鱗翅目Lepidoptera：毛斑蛾科Phaudidae)，是榕屬Ficus植物上一種重要的食葉害蟲，在南亞和東南亞國家其發(fā)生和為害的報道屢見不鮮(Nageshchandraetal.，1972；Verma and Dogra，1982；Fof，2015；劉俊延等，2016；Anonymous，2017；Zhengetal.，2017)。朱紅毛斑蛾在中國廣西1年發(fā)生2～3代，抗寒力強(qiáng)(Zhengetal.，2017)，以第2代預(yù)蛹期幼蟲及蛹和第3代低齡幼蟲越冬，越冬幼蟲喜在位于地表突出的根系附近或雜草叢下化蛹(劉俊延等，2015)。該蟲成蟲為日行性蛾類(Zhengetal.，2019)，以幼蟲取食榕屬植物葉片，為害嚴(yán)重時，不僅植株葉片被蠶食殆盡僅剩枝干，還會取食嫩枝韌皮部(劉俊延等，2015)，不僅影響榕樹的生長發(fā)育，還影響其凈化空氣等功能的正常發(fā)揮。目前，已篩選出幾種防治效果較佳的化學(xué)藥劑(孟令昱，2017；蔣露等，2018)，然而，由于朱紅毛斑蛾的發(fā)生地多在市區(qū)道路旁、公園和河堤岸等處，化學(xué)防治存在一定的安全隱患。因此，探索朱紅毛斑蛾環(huán)境友好型的生物防治措施十分必要。自然條件下，朱紅毛斑蛾的天敵主要為寄生蜂和寄生蠅，但寄生率較低，僅為0.9%～7.2%(Zhengetal.，2015)，防控效果有限。此外，朱紅毛斑蛾性信息素防控技術(shù)的研究也取得初步進(jìn)展(Zhengetal.，2019)。迄今為止，關(guān)于朱紅毛斑蛾的研究主要集中在生物生態(tài)學(xué)特性、防治和線粒體基因組等方面(Zhangetal., 2020)，有關(guān)轉(zhuǎn)錄組分析、內(nèi)參基因篩選、功能基因研究等方面尚未見報道。

實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)，由于其定量準(zhǔn)確、特異性性好和靈敏度高，廣泛用于昆蟲轉(zhuǎn)錄組驗證和基因表達(dá)分析等方面的研究(Van Guilderetal.，2008；史彩華等，2017；Lüetal.，2018；Shakeeletal.，2018)。qRT-PCR技術(shù)關(guān)鍵因素之一為內(nèi)參基因的選擇。合適的內(nèi)參基因可以對qRT-PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，從而糾正由RNA分離、cDNA定量、轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的變異等帶來的系列問題(Pfaffletal.，2014)，從而減少樣本間的誤差，控制內(nèi)部差異。因此，選擇何種內(nèi)參基因?qū)τ趒RT-PCR結(jié)果是否準(zhǔn)確就顯得尤為重要。常用的候選內(nèi)參基因包括肌動蛋白家族(ACTIN)(Ridgeway and Timm，2015)、微管蛋白家族(Tubulin，TUB)(Wangetal.，2015)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(Yangetal.，2018)和核糖體蛋白基因(Ribosomal protein L32，RPL-32)(Mattaetal.，2011)等。近年來，這幾類候選內(nèi)參基因在昆蟲中的表達(dá)穩(wěn)定性篩選研究已有諸多報道(Tengetal.，2012；符偉等，2012；Luetal.，2013；唐培安等，2016)，如偏瞳蔽眼蝶BicyclusanynanaButler(Arunetal.，2015)、狐眼袖蝶HeliconiusnumataCramer(Prunieretal.，2016)、桃蛀螟ConogethespunctiferailsGuenee(楊苓等，2017)和美國白蛾HyphantriacuneaDrury(陶蓉等，2019)等。

目前，已對朱紅毛斑蛾的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了組裝分析，得到完善的基因信息，使qRT-PCR內(nèi)參基因篩選試驗更具可靠性。因此，本研究以朱紅毛斑蛾不同成蟲組織(頭、胸、腹、足、翅和觸角)、性別和不同發(fā)育階段(卵、幼蟲、蛹和成蟲)為材料，利用qRT-PCR技術(shù)對鱗翅目昆蟲中常見的10個內(nèi)參基因(ACTIN2、ACTIN3、TUB1、TUB2、TUB3、EF1α、AK、GAPDH、RPL32和TBP)進(jìn)行了表達(dá)量分析，并使用GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件及RefFinder網(wǎng)站對候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了分析和評價，以篩選出朱紅毛斑蛾不同成蟲組織、性別和不同發(fā)育階段中最合適的內(nèi)參基因，為后續(xù)朱紅毛斑蛾基因表達(dá)調(diào)控等系列研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與樣品收集

于2018年6月至7月，在廣西大學(xué)校園(108.29 °E，22.85 °N)內(nèi)的垂葉榕F.benjaminaL.上采集朱紅毛斑蛾幼蟲。幼蟲放入塑料盒(半徑8.0 cm，高度12.0 cm，10頭/盒)內(nèi)飼養(yǎng)，置于溫度26±1℃，相對濕度為60%～80%和光周期L14 ∶ D10的條件下飼養(yǎng)。幼蟲飼以新鮮垂葉榕葉片，每日更換新鮮葉片直至化蛹。根據(jù)茅裕婷等(2017)提供的方法鑒別蛹的性別，雌雄蛹分開保存在不同的塑料管內(nèi)(直徑2.7 cm，高度10.3 cm)，塑料管蓋中間鉆10個孔(直徑2 mm)便于通風(fēng)，置于和飼養(yǎng)幼蟲相同的環(huán)境條件下。成蟲羽化后，隨機(jī)收集1日齡雌蟲或雄蟲頭、胸、腹、足、翅和觸角為組織樣品，每組5頭，生物學(xué)重復(fù)3次；隨機(jī)收集1日齡雌蟲和雄蟲為性別樣品，每組3頭，生物學(xué)重復(fù)3次；收集卵(50粒)、2齡幼蟲(5頭)、蛹(初期和末期各2頭)和成蟲(1日齡雌雄成蟲各2頭)為發(fā)育階段樣品，生物學(xué)重復(fù)3次；將收集的各組樣品迅速放入液氮內(nèi)，隨后轉(zhuǎn)置于-80℃冰箱保存待用。

1.2 總RNA的提取與cDNA的合成

將收集的各組樣品從-80℃冰箱中取出，置于液氮中，均按RNAiso Plus (Trizol)(TAKARA，9109，中國大連)法進(jìn)行RNA提取。用以上方法提取的RNA為模板，按照Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA，RR047，中國大連)試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。合成好的cDNA存于-20℃冰箱待用。

1.3 內(nèi)參基因的選擇及引物設(shè)計

根據(jù)其它鱗翅目昆蟲常用內(nèi)參基因(Shakeeletal.，2015；Sunetal.，2015；Xuetal.，2017；Zhangetal.，2017)，從朱紅毛斑蛾轉(zhuǎn)錄組中篩選出ACTIN2、ACTIN3、TUB1、TUB2、TUB3、EF1α、AK、GAPDH、RPL32和TBP共10個候選內(nèi)參基因(表1)，并利用National Center for Biotechnology Information(NCBI)網(wǎng)站中的引物設(shè)計工具Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast/)設(shè)計qRT-PCR引物(表2)，由生工生物工程上海(股份)有限公司合成。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和qRT-PCR

將樣品cDNA模板梯度稀釋1/2、1/10、1/50、1/250和1/1250進(jìn)行反應(yīng)，在冰上進(jìn)行反應(yīng)體系的配制，具體如下(10 μL體系)：SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)(TAKARA，RR820A，中國大連)5.0 μL，dd H2O 2.4 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.2 μL，cDNA 稀釋液2.0 μL。在ABI QuantStudio 6 Flex (Thermo Fisher Scientific，Massachusetts，USA)上進(jìn)行反應(yīng)，PCR程序如下：Hold Stage：95℃，30 s；PCR Stage：95℃，5 s；60℃，30 s；40個循環(huán)；Mel Curve Stage：95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s。保存qRT-PCR檢測數(shù)據(jù)供后續(xù)分析。

表1 朱紅毛斑蛾候選內(nèi)參基因信息

表2 朱紅毛斑蛾候選內(nèi)參基因的定量引物序列

1.5 候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

對10個候選內(nèi)參基因的綜合性評價，采用內(nèi)參基因評價軟件GeNorm(Vandesompeleetal.，2002)、Normfinder(Andersenetal.，2004)和Bestkeeper(Pfaffletal.，2004)，并采用RefFinder在線網(wǎng)站(https://www.heartcure.com.au/reffinder/)進(jìn)行綜合比較與穩(wěn)定性評估(Silveretal.，2016)。GeNorm計算不同處理中各內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性(M值)，當(dāng)M<1.5時，則該基因可用于候選內(nèi)參基因的篩選，反之則否，且M值越小代表選擇的內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好。同時，可通過GeNorm計算得到Vn/(n+1)值，當(dāng)Vn/(n+1)<0.15時，則表示該處理中這n個內(nèi)參基因達(dá)到內(nèi)參基因計算要求，無需添加n+1個內(nèi)參基因，從而得到使用內(nèi)參基因的最佳數(shù)目。Normfinder計算不同樣本組內(nèi)和組間的變化來評估內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值(stability value，SV)，該值越小表示內(nèi)參基因越穩(wěn)定，同時還可得到內(nèi)參基因的最佳組合。Bestkeeper直接使用基因循環(huán)閾值(Cq)進(jìn)行計算，通過標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation，SD)、變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)及幾何平均數(shù)(geometric mean，GM)來評估內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，且SD<1時，該基因可被作為內(nèi)參基因。最后，通過RefFinder在線網(wǎng)站對所有候選內(nèi)參基因進(jìn)行綜合排名。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物擴(kuò)增效率和特異性評價

基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)10個候選內(nèi)參基因的相關(guān)系數(shù)(R2)均在0.991～0.999之間(表3)，表明梯度稀釋的內(nèi)參基因模板cDNA獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)良好。所有候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率(E)均在97.6%(RPL32)～113.6%(TUB2)之間，位于80.0%～120.0%的要求范圍內(nèi)，且每個候選基因獲得的溶解曲線均表現(xiàn)出單一峰，說明本試驗選擇的定量引物設(shè)計合理，具有良好的擴(kuò)增效率和特異性，符合熒光定量分析的要求，適用于內(nèi)參基因的定量測定。

表3 候選內(nèi)參基因qRT-PCR引物的擴(kuò)增效率及相關(guān)系數(shù)

2.2 候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平分析

qRT-PCR分析了朱紅毛斑蛾10個候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平，Cq表示其轉(zhuǎn)錄水平。在朱紅毛斑蛾不同成蟲組織、性別和不同發(fā)育階段3組處理綜合條件下，所有基因的Cq值在15.54～30.37個循環(huán)之間(圖1)，表明各候選內(nèi)參基因各組處理中均具有較高的表達(dá)水平?；贑q值變化，發(fā)現(xiàn)各候選內(nèi)參基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平表達(dá)量均有差異，其中，RPL32表達(dá)量變化最小，其次是ACTIN3、TUB2和GAPDH；ACTIN2表達(dá)量變化最大，且Cq值大于30，因此不考慮作為內(nèi)參基因。

圖1 候選內(nèi)參基因在朱紅毛斑蛾不同樣品中的表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of candidate reference genes for different samples in Phauda flammans

2.3 朱紅毛斑蛾候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.3.1GeNorm穩(wěn)定性分析

根據(jù)GeNorm軟件對10個候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性(M值)的分析，發(fā)現(xiàn)在不同成蟲組織處理中，M值穩(wěn)定順序為TUB1=TUB2(0.284)>EF1α(0.349)>ACTIN3(0.358)>RPL32(0.439)>GAPDH(0.492)>TBP(0.559)>TUB3(0.620)>AK(0.964)>ACTIN2(1.346)，其中TUB1和TUB2為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，ACTIN2為最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因；在不同成蟲性別處理中，ACTIN2=EF1α(0.169)>AK(0.233)>ACTIN3(0.270)>RPL32(0.295)>TUB2(0.353)>GAPDH(0.396)>TUB1(0.486)>TUB3(0.654)>TBP(0.786)，其中ACTIN2和EF1α為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，TBP為最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因；在不同發(fā)育階段處理中，TUB2=TBP(0.255)>AK(0.591)>RPL32(0.806)>ACTIN3(0.986)>TUB3(1.162)>GAPDH(1.427)>ACTIN2(1.669)>TUB1(2.242)>EF1α(2.695)，TUB2和TBP為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，EF1α為最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因(圖2)，其中ACTIN2、TUB1和EF1α的M值>1.5，因此這3個基因不適合用于不同發(fā)育階段處理中的內(nèi)參基因。

圖2 geNorm軟件分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值MFig.2 Expression stability of the candidate reference genes as calculated by the geNorm注：A，不同成蟲組織；B，不同成蟲性別；C，不同發(fā)育階段。Note：A, Different adult tissues; B, Different adult sexes; C, Different developmental stages.

同時，利用GeNorm軟件對Vn/(n+1)值進(jìn)行計算，分析得到了所需要最佳內(nèi)參基因數(shù)目(圖3)。3個處理中，Vn/(n+1)值均存在小于0.15的組分，所以最佳內(nèi)參基因組合數(shù)目為2個，無需加入第3個內(nèi)參基因進(jìn)行校正。其中，在不同成蟲組織處理內(nèi)，TUB1和TUB2為最佳組合；在不同成蟲性別處理中，ACTIN2和EF1α為最佳內(nèi)參基因組合；在不同發(fā)育階段處理中，TUB2和TBP為最佳內(nèi)參基因組合。

圖3 GeNorm軟件分析不同條件下所需內(nèi)參基因的最適數(shù)目Fig.3 Determination of the optimal number of reference genes analyzed by GeNorm

2.3.2Normfinder穩(wěn)定性分析

基于Normfinder的分析，發(fā)現(xiàn)在不同成蟲組織中，TUB2為最穩(wěn)定內(nèi)參基因，與GeNorm軟件分析一致，其次是GAPDH，最不穩(wěn)定基因為RPL32；在不同成蟲性別中，TUB1為最穩(wěn)定內(nèi)參基因，其次為EF1a和ACTIN3，TBP依然為最不穩(wěn)定基因；在不同發(fā)育階段處理中，ACTIN3為最穩(wěn)定內(nèi)參基因，其次為TBP，最不穩(wěn)定基因為AK(表4)。

表4 基于NormFinder軟件的朱紅毛斑蛾內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.3.3Bestkeeper穩(wěn)定性分析

BestKeeper分析得到的標(biāo)準(zhǔn)差SD值、變異系數(shù)CV值和幾何平均數(shù)GM值等可用來判斷內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，SD、CV和GM值越小，表明基因表達(dá)越穩(wěn)定。在不同成蟲組織處理中，ACTIN3為最穩(wěn)定內(nèi)參基因，其次為AK；RPL32為最不穩(wěn)定基因，與Normfinder軟件分析結(jié)果一致。在不同成蟲性別處理中，AK為最穩(wěn)定內(nèi)參基因，其次為TUB2和GAPDH；TBP在3種分析中均為最不穩(wěn)定基。在不同發(fā)育階段處理中，ACTIN2和TUB2為最穩(wěn)定內(nèi)參基因，其次為GAPDH；最不穩(wěn)定基因為AK。所有處理每個內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)差SD值均小于1，故3組處理中的所有基因都可被作為內(nèi)參基因(表5)。

表5 基于Bestkeeper軟件的朱紅毛斑蛾內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.3.4RefFinder綜合分析

根據(jù)RefFinder綜合分析，發(fā)現(xiàn)在不同成蟲組織處理中，表達(dá)最穩(wěn)定內(nèi)參基因為TUB2，其次為GAPDH；不同性別處理中，表達(dá)最穩(wěn)定內(nèi)參基因為TUB1，其次為EF1α；在不同發(fā)育階段處理中，表達(dá)最穩(wěn)定內(nèi)參基因為ACTIN3，其次為TBP(圖4)。

圖4 RefFinder中Geomean法分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Fig.4 Expression stability of the candidate reference genes analyzed by the Geomean method in RefFinder注：A，不同成蟲組織；B，不同成蟲性別；C，不同發(fā)育階段。Note：A, Different adult tissues; B, Different adult sexes; C, Different developmental stages.

3 結(jié)論與討論

qRT-PCR是基因表達(dá)分析研究中一種非?？煽康募夹g(shù)，可對靶標(biāo)基因的表達(dá)水平定量，具有靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)(Lüetal.，2018)，是目前基因表達(dá)研究中檢測或比較mRNA水平的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。然而，其對基因表達(dá)量的成功檢測必須要有合適的內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)(Stéphanieetal.，2009)。對于qRT-PCR分析評價內(nèi)參基因，通常需添加多種參考進(jìn)行驗證，例如，不同處理條件和多種候選內(nèi)參基因的選擇(Shakeeletal.，2018)。目前，關(guān)于鱗翅目昆蟲利用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行內(nèi)參基因篩選已有諸多報道，如研究了桃蛀螟、美國白蛾和偏瞳蔽眼蝶不同發(fā)育階段、成蟲組織、性別或溫度處理下內(nèi)參基因的表達(dá)量(Arunetal.，2015；楊苓等，2017；陶蓉等，2019)。本研究基于朱紅毛斑蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，采用不同成蟲組織、性別和不同發(fā)育階段3個處理，對鱗翅目昆蟲中常見的10個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行了評定。

首先，在朱紅毛斑蛾不同成蟲組織中，TUB2和GAPDH為最適內(nèi)參基因，但結(jié)果與桃蛀螟(楊苓等，2017)、金紋細(xì)蛾P(guān)hyllonorycterringoniellaMatsumura(郭長寧，2014)和小菜蛾P(guān)lutellaxylostellaLinnaeus(Heetal.，2017)等鱗翅目昆蟲的研究結(jié)果不同，可能與物種的生物學(xué)特異性和組織樣品取樣類型差異有關(guān)。其次，在黃翅絹野螟DiaphaniacaesalisWalker內(nèi)參基因研究中，發(fā)現(xiàn)不同成蟲性別最佳內(nèi)參基因為ACTIN和EF1α(Wangetal.，2020)，其中EF1α為延伸因子1-α(elongation factor-alpha)，是在mRNA翻譯時促進(jìn)多肽鏈延伸的蛋白質(zhì)因子(Serdyuk and Galzitskaya，2007)。例如，在鱗翅目粉蝶科斑粉蝶屬Delias中，利用EF1α與其他21個類群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析(Morinaketal.，2002)，由此可見該基因的保守性和表達(dá)穩(wěn)定性。在朱紅毛斑蛾不同成蟲性別處理中，也發(fā)現(xiàn)EF1α為最適內(nèi)參基因之一，認(rèn)為EF1α可能在鱗翅目性別表達(dá)中較穩(wěn)定，適合作為成蟲性別處理中基因表達(dá)的內(nèi)參基因。最后，在朱紅毛斑蛾不同發(fā)育階段處理中，ACTIN3和TBP為最適內(nèi)參基因，但與小菜蛾和桃蛀螟等鱗翅目昆蟲的研究結(jié)果不同(Fuetal.，2013；楊苓等，2017)，表明內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性隨物種而異，同時可能也會受試驗處理方法和條件的影響。同時，不同軟件分析結(jié)果存在一定差異，可能與軟件的算法不同有關(guān)，在其他昆蟲內(nèi)參基因評價中也存在類似情況(唐培安等，2016；劉寧等，2017)。

內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析完成后，基于GeNorm計算得到Vn/(n+1)值<0.15，推算出朱紅毛斑蛾最佳內(nèi)參基因使用數(shù)目為2個。自2002年Vandesompele編寫了GeNorm軟件以來，雙內(nèi)參基因在qRT-PCR檢測中越來越廣泛使用，其原理是不管在任何試驗條件下，2個最佳內(nèi)參基因的表達(dá)水平比值均保持一致，不受基因表達(dá)差異的影響(Vandesompeleetal.，2002)。因此，在本研究中不同成蟲組織、性別和發(fā)育階段3個試驗處理下，最佳內(nèi)參基因使用數(shù)目均為2個即可。

本文研究結(jié)果表明，在朱紅毛斑蛾不同成蟲組織基因定量研究中，建議以TUB2和GAPDH作為內(nèi)參基因；在不同成蟲性別基因定量研究中，建議以TUB1和EF1α作為內(nèi)參基因；在不同發(fā)育階段基因定量研究中，建議以ACTIN3和TBP作為內(nèi)參基因。為保證qRT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性，最佳內(nèi)參基因使用數(shù)目為2個。