柴桂口服液對LPS誘導的小鼠炎癥的抑制作用

肖 琦，賈妮娜，謝小東，施 君，陳曉霞，于美玲，韋英益，胡庭俊

(廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530005)

柴胡和桂枝相關方劑具有抗炎、抗氧化、增強免疫力和改善代謝等作用[1]，以柴胡桂枝干姜湯為母本延伸出的藥劑在臨床中可用于治療胃腸型感冒、潰瘍性結腸炎、慢性膽囊炎和病毒性肝炎等疾病[2]，具有很好的抗炎效果。

本試驗采用的柴桂口服液經由《傷寒論》中柴胡桂枝干姜湯設計而來，通過小柴胡湯和桂枝湯加減而成[3]。本試驗參照文獻[4-5]小鼠體內炎癥模型構建方法，以脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)為致炎劑，建立小鼠體內炎癥模型，研究柴桂口服液對腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和一氧化氮(nitric oxide,NO)表達和分泌水平的調節(jié)作用，以期在臨床用藥時為該方劑的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 柴桂口服液(批號:20190901)，河南牧翔動物藥業(yè)有限公司中試生產，規(guī)格：1.44 g/mL ；地塞米松注射液(批號:180602)，上海同仁藥業(yè)股份有限公司上海獸藥廠產品，規(guī)格5 mg/5 mL；脂多糖(批號：320v0320)，北京索萊寶科技有限公司產品；小鼠TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β試劑盒(批號分別為M191008-102a、M190919-004a、M191008-104a、M91008-001a)，欣博盛生物有限公司產品；一氧化氮(NO)、總蛋白(Total protein，TP)試劑盒(批號分別為20191007、20190930)，南京建成生物試劑有限公司產品；Cham QTM Universal SYBR Qpcr master Mix(批號20210124)、StarScript Ⅱ First strand cDNA synthesis Mix(批號9AHO1)；RNA isolater R401-01(批號2021.05.17)，南京諾唯贊生物科技有限公司產品；氯仿、無水乙醇等為分析純。

1.1.2 實驗動物 4周齡昆明種小鼠70只，SPF級，臨床健康，體重18 g～22 g，雌雄各半，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號SCXK(湘)2016-0002。動物購買后適應性飼養(yǎng)5 d。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫25℃±2℃，相對濕度40%～75%，室內無對流風。

1.1.3 主要儀器 TECAN多功能酶標定量儀(Infinite M200 PRO)，帝肯(上海)貿易有限公司產品；Servicebio高速組織勻漿儀(kz-Ⅱ)，武漢賽維爾生物科技有限公司產品；實時熒光定量PCR儀(Roche LightCycler?96，瑞士羅氏(Roche)公司產品。

1.2 方法

1.2.1 藥物劑量使用換算 據文獻[6]，在傳統(tǒng)中藥方劑中，牛平均體重約300 kg，單味藥用量約15 g/頭～35 g/頭，一般藥物用藥劑量在25 g/頭，雞體重約1.5 kg，用藥劑量為牛劑量的1/40～1/20，即單味中藥用量約為0.625 g/只～1.25 g/只，柴桂口服液組方按照牛劑量約為144 g，換算后成年雞用量約為3.6 g～7.2 g。采用體表面積法換算小鼠用量，由于沒有雞準確的體表面積，且雞與兔體重相近，均計為1.5 kg，即采用家兔作為雞的換算方法：常見實驗動物兔(雞)標準體重為1.5 kg，按照文獻[7]中常用實驗動物及人的體表面積比例(劑量換算用)所提及1.5 kg家兔與20 g小鼠換算系數(shù)為0.040，即小鼠的用藥量應低于7.2×0.040/0.020=14.4 g/kg，所以灌胃小鼠時用藥劑量應在14.4 g/kg以內，故本試驗給藥劑量設計為2.5、5、10、15 g/kg。

1.2.2 動物分組與處理方法 動物分組方法參照文獻[8]分組方法，將70只SPF級雌雄各半的昆明小鼠采用分層隨機分組法分為7組，分別為空白對照組、LPS對照組、地塞米松組(5 mg/kg體重)、柴桂口服液Ⅰ～Ⅳ組(2.5、5、10、15 g/kg體重)。其中，地塞米松組灌胃純化水(0.4 mL)，同時腹腔注射5 mg/kg體重(0.2 mL)地塞米松溶液；柴桂口服液Ⅰ～Ⅳ組分別按各組劑量灌胃柴桂口服液(0.4 mL)，腹腔注射生理鹽水(0.2 mL)；空白對照組與LPS對照組灌胃純化水(0.4 mL)，同時腹腔注射生理鹽水(0.2 mL)；各組每日給藥1次，連續(xù)5 d，于最后一次給藥1 h后，除空白對照組腹腔注射生理鹽水，其余各組參照文獻[9]LPS小鼠體內炎癥模型構建方法，腹腔注射10 mg/kg體重的LPS溶液建立小鼠體內炎癥模型。LPS處理后6 h，CO2窒息處死小鼠并進行解剖，觀察解剖后的臟器變化情況，采集脾臟，稱重，放入滅菌的EP管中，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 脾臟組織中炎癥因子分泌水平的測定 LPS處理后6 h，處死小鼠并進行剖檢，觀察臟器變化情況，采集脾臟，稱重，放入滅菌的EP管中，置-80℃保存?zhèn)溆?。?/2脾臟組織，按照質量體積比1∶9加入生理鹽水，使用高速勻漿儀在60 Hz頻率下，勻漿2 min，1 500 r/min離心10 min，取脾臟勻漿上清液，依據試劑盒說明書檢測脾臟組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、NO和TP含量。

1.2.4 引物設計 根據GenBank中相關基因序列設計TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β等引物，引物由廣西南寧市擎科生物技術有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.2.5 RT-qPCR檢測脾臟組織中炎癥因子表達量 取小鼠脾臟組織，按試劑盒說明書提取總RNA和反轉錄，反轉錄前檢測RNA完整性；用實時定量PCR方法對目的基因和內參基因進行PCR擴增，反應條件如下：95℃預變性30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)，檢測各基因表達量。基因表達采用2-△△CT法計算基因的相對表達量。

2 結果

2.1 臨床表現(xiàn)

除空白對照組外，其余各組在腹腔注射LPS溶液建模6 h后，各組小鼠出現(xiàn)扎堆、眼睛分泌物增多、精神沉郁等現(xiàn)象，造模期間無死亡。

2.2 柴桂口服液對小鼠脾臟中炎性因子含量的影響

在連續(xù)5 d灌胃不同劑量柴桂口服液后，對小鼠腹腔注射LPS建立體內炎癥模型，LPS對照組脾臟勻漿中IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β和NO含量顯著高于空白對照組(P<0.05)；地塞米松組各炎性因子含量均顯著低于LPS組(P<0.05)；柴桂口服液Ⅰ組脾臟勻漿液中IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β含量與LPS組相比無顯著差異(P>0.05)，NO含量顯著低于LPS組(P<0.05)但與空白對照組無顯著差異(P>0.05)，柴桂口服液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組脾臟勻漿液中IL-6、IL-1β和TNF-α含量顯著低于LPS對照組(P<0.05)，柴桂口服液Ⅲ、Ⅳ組脾臟勻漿液中IL-8含量顯著低于LPS對照組(P<0.05)，柴桂口服液Ⅰ至Ⅳ組NO含量均顯著低于LPS模型組(P<0.05)(表2)。

表2 柴桂口服液對小鼠脾臟中炎性因子分泌的影響

2.3 柴桂口服液對小鼠脾臟中炎性因子表達的影響

各組在腹腔注射LPS后，脾臟組織中TNF-α、IL-1β表達均顯著高于空白對照組(P<0.05)；柴桂口服液Ⅰ、Ⅳ組與地塞米松組脾臟中TNF-α表達顯著低于LPS對照組(P<0.05)；柴桂口服液各劑量組及地塞米松組的IL-6、IL-1β、IL-8表達顯著低于LPS對照組(P<0.05)，其中，柴桂口服液Ⅰ、Ⅳ組IL-6的表達與地塞米松組無顯著差異(P>0.05)，柴桂口服液Ⅰ組IL-1β表達與地塞米松組無顯著差異(P>0.05)，柴桂口服液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組IL-1β的表達顯著低于地塞米松組(P<0.05)(表3)。

表3 柴桂口服液對小鼠脾臟中炎性因子基因表達水平的影響

3 討論

脂多糖是一種重要的炎癥誘導因子，廣泛用于體內外炎癥模型的構建，在體內注射以后可導致血液和組織中炎性因子分泌水平上升，有良好的致炎效果，它可以通過激活TLR4/NF-κB信號通路，誘導單核巨噬細胞TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子的過量表達，介導免疫應激引起的炎癥反應[10]。但在體內炎癥模型中，根據不同的試驗需求使用的劑量和作用時間不同[11]，本次試驗選用10 mg/kg體重腹腔注射LPS溶液成功建立小鼠體內炎癥模型，臨床可見各LPS腹腔注射組小鼠出現(xiàn)扎堆，眼睛分泌物增多，LPS組脾臟勻漿液中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8和NO含量顯著高于空白對照(P<0.05)，IL-1β、IL-6、TNF-α與IL-8的表達量顯著高于空白對照組(P<0.05)，與文獻[4-5]模型建立結果相似。

許多中藥及其提取物可以調節(jié)機體炎癥因子分泌，具有保護神經、抗病毒、抗炎等作用，如柴胡的主要活性成分柴胡皂苷具有較強抗炎活性，它能夠抑制促炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達從而增強抗炎性細胞因子轉化生長因子-β1 的表達[12]，NF-κB信號通路是柴胡皂苷發(fā)揮抗炎作用主要抑制的抗炎信號通路[13]。許多研究表明含有柴胡、桂枝的組方具有抗炎等作用，與本次試驗結果相似[14]。

本試驗連續(xù)5 d灌胃小鼠2.5 g/kg～15 g/kg柴桂口服液后，用LPS建立炎癥模型，并以地塞米松為陽性藥物對照，隨著藥物劑量的增加，脾臟IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β含量呈下降趨勢，且柴桂口服液Ⅰ組與Ⅳ組的IL-6 、IL-8、TNF-α、IL-1β水平皆有顯著差異，呈現(xiàn)出一定的量效關系；脾臟NO水平呈下降趨勢。與之相似，脾臟組織中IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β的表達量隨著用藥劑量的增大相比于LPS對照組呈現(xiàn)出下降趨勢。

本研究證實10 mg/kg LPS可以作為一種小鼠體內炎癥模型的建模劑量，并可以取得較好的建模效果；柴桂口服液在2.5 g/kg體重～15 g/kg體重劑量范圍內，可以降低LPS誘導小鼠的體內炎癥模型脾臟組織中炎癥因子的基因表達及分泌，具有較好的抗炎作用，對機體有一定的保護作用，其抗炎機制的臨床應用前景值得進一步研究開發(fā)。