不明原因復發(fā)性流產中Th17/ Treg免疫平衡機制研究進展①

方紫璇 余 楠 （華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院婦產科，武漢430030）

胚胎相對于母體而言是半同種異體移植體，在正常妊娠過程中母體對胎兒不產生排斥反應，其中母胎免疫耐受起至關重要的作用。母胎免疫失衡易導致妊娠紊亂，誘發(fā)子癇前期、復發(fā)性流產（recur?rent spontaneous abortion，RSA）等病理妊娠現象。RSA 是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3 次或3 次以上在妊娠28周之前的胎兒丟失［1-2］。RSA病因較多，包括親代和胚胎染色體、解剖結構、內分泌、感染、遺傳因素和血栓前狀態(tài)等［3］。但約50%患者發(fā)病成因尚不明確，稱為不明原因復發(fā)性流產（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）［4］。

CD4+T 細胞是人體免疫系統(tǒng)中一類重要的免疫細胞，在母胎免疫耐受機制中發(fā)揮重要作用。CD4+T 細胞可調節(jié)先天性和適應性免疫系統(tǒng)，在不同細胞因子介導下分化形成Th1、Th2、Th17、Treg 等不同亞群［5］。以往研究者以Th1/Th2 偏倚解釋諸多免疫所致的組織損傷和慢性炎癥等疾病，但近年來研究發(fā)現Th17/Treg 偏倚對解釋母胎免疫耐受現象更為重要［5-6］。本文就Th17/Treg 平衡異常導致的URSA 可能的發(fā)病機制及其相應治療方法的最新研究進展進行綜述，以期為臨床揭示URSA 發(fā)生、發(fā)展及治療提供參考。

1 Th17：促炎細胞

1.2 Th17 的調節(jié) 不同細胞因子介導CD4+T 細胞分化為不同的細胞亞群。在初始CD4+T細胞的分化過程中，TGF-β 作用可促進 Treg 的分化和增殖，而TGF-β 和 IL-6 共同作用促使 CD4+T 細胞分化形成Th17［9］。也有研究認為，在小鼠中 TGF-β 和 IL-6 的共同誘導下形成Th17，而人體中則由IL-1β 和IL-6或IL-23共同促進Th17分化形成［10］。TGF-β 在Th17分化和增殖中發(fā)揮重要作用：一方面TGF-β 通過對Th1 和 Th2 分泌 的 IFN-γ 和 IL-4 的 抑制 作 用實 現Th17 的增殖，另一方面TGF-β 直接刺激原始CD4+T細胞分化，同時TGF-β 和IL-6 能誘導激活維甲酸孤核受體γt（retinoid-related orphan receptor γt，RORγt）和RORα，該受體是介導Th17 分化方向的重要轉錄因子［5，9］，其活性可受配體依賴性的方式調節(jié)，例如乙?；头核鼗芭c各種輔因子的相互作用，能改變其活性進而實現對Th17分化的調節(jié)［8］。IL-6可有效抑制Treg 分化，促進CD4+T 細胞向Th17 分化方向進行。但 Th1 和 Th2 的效應因子 IFN-γ 和 IL-4 能抑制 Th17 的分化，IFN-γ 通過調節(jié) STAT1 通路活性來抑制 Th17 的分化［5，9］。IL-27 對 Th17 的調節(jié)作用與IFN-γ 類似，并通過 STAT1 通路抑制 Th17 轉錄因子RORγt 來減少IL-17A 的產生，而對誘導產生的適應性Treg（iTreg）的抑制作用是并非通過STAT1 通路進行［9，11-12］。相較于 STAT1 表達水平降低，Th17 中STAT3 途徑表達水平持穩(wěn)。STAT3 通路在Th17 的分化中有重要作用，能調節(jié)RORγt和RORα 及IL-17的表達水平，同時在極化條件下，Th17 誘導RORγt需依賴STAT3 通路，并在IL-6、IL-23 等細胞因子的刺激下協(xié)同作用促進Th17的分化［8-9］。

除細胞因子對Th17 分化和增殖直接調控外，Treg 可通過特定因子作用間接調控Th17 的增殖，體外Treg 能分泌TGF-β 因子進行調控，小鼠體內Treg通過上調IL-2 受體α 鏈（CD25）含量或激活STAT5通路來調節(jié)IL-2 mRNA 表達，IL-2 信號因子促進Th17的分化和增殖［13］。

1.3 妊娠期Th17及相關因子變化 與健康狀態(tài)相比，在 URSA 中，Th17 及 Th17 相關細胞因子含量呈現不同變化趨勢。健康未孕婦女（有至少1 次成功孕產史）的血清中IL-17水平明顯較低，而Th17相關細胞因子 IL-21、IL-22、IL-17A 在 URSA 患者血清中呈現增高趨勢，在URSA 患者的外周血中ROR-γt mRNA 表達增多［14］。在 Th17 的調節(jié)機制中，PD-1/PD-L1 能改變Th17 細胞的含量，胃癌患者中主要通過減少 ROR-γt的 mRNA 表達，使得 Th17 分化減少。而在體外，PD1抑制劑（Ad-sh-PD1）可通過增加miR-21表達，增加Th17的數量［15］。

人體中Th17 相關細胞因子含量的變化提示病理妊娠的發(fā)生。在正常的妊娠過程中，胚胎相當于同種異體移植，其中胎兒自身抗原會刺激母體產生多種免疫炎癥反應，導致相關因子增多，例如IL-6、IL-12、IL-18和TNF-α 等。在相應細胞因子中，IL-22的增加在正常妊娠時與Th2相關的細胞因子IL-4有關，兩者在血清中呈現正相關的表達趨勢，而在URSA中IL-22 的含量變化與Th17 相關細胞因子（IL-17A、IL-17F）呈正相關。IL-22 在建立母胎聯系時，參與半同種異體移植的免疫調節(jié)過程，對于胚胎正常種植，實現妊娠具有重要意義［16］。在URSA 患者中，表現出外周血及蛻膜中Th17相關因子及IL-23含量的升高，以及與Th17 相關的維甲酸孤核受體RORC 的升高，提示URSA 的影響因素可能與Th17 的增多及細胞因子變化相關［17］。

2 Treg：免疫耐受

2.1 Treg 的來源及分泌 Treg 是 CD4+T 細胞的一個亞群，能表達IL-2 受體，通過細胞之間接觸和分泌的 IL-10、TGF-β 發(fā)揮免疫調控作用。Treg 種類較多，包括天然產生的自然 Treg（nTreg）、iTreg 等。其中nTreg 在胸腺中產生，受轉錄因子Foxp3 調節(jié)，iTreg 則由原始T 細胞在外周血或體外受到抗原和TGF-β 的誘導后分化形成［9］。Treg 在抑制自身免疫和同種異體移植的耐受中有重要作用，主要機制包括：Treg 組成性高表達細胞毒性T 淋巴細胞相關蛋白4（CTLA-4），能競爭性地結合效應T 細胞活化所需的共刺激信號B7 分子，抑制T 細胞活化，同時可競爭性地抑制T 淋巴細胞表面共刺激分子CD28，從而阻礙第二信號的傳遞，使效應T 細胞進入失能狀態(tài)［18］。其次，Treg可分泌產生IL-10、TGF-β、IL-35等細胞因子發(fā)揮免疫調節(jié)功能，可誘導T 細胞向Th2轉化，下調自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）的殺傷功能［18-19］。Treg 具有抑制抗原特異性免疫的作用，對于免疫平衡的維持十分重要，Treg的過度激活易導致免疫耐受的失衡，從而誘發(fā)多種自身免疫性疾病的產生。

2.2 Treg 的調節(jié) Treg 的分化與增殖受到相應細胞因子的調節(jié)。Foxp3 是人體中CD4+CD25+T 細胞表達的轉錄調節(jié)因子，是維持Treg 穩(wěn)定和生長的重要基因［20］。在URSA 中，Foxp3伴隨Treg在外周血和蛻膜中呈現低表達趨勢，而Foxp3啟動子在URSA中甲基化，進而導致Foxp3 蛋白低表達，Treg 功能退化，最終導致 URSA 的發(fā)生［21］。IL-4 或 IL-13 通過共受體IL-4Rα 激活JAK1/JAK3，進而磷酸二聚化STAT6，介導 Foxp3 表達，進而影響 Treg 的功能。信號轉導和轉錄激活因子6（STAT6）的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）與免疫反應有關，其中SNPs 為STAT6 rs324011 與 Treg 相關基因的低表達有關［22］。STAT3是胞質內信號轉導和轉錄激活因子家族（STAT）中的另一員，也影響Treg 表達。在急性冠心癥（CAS）患者中，磷酸化STAT3+T（pSTAT3+T）細胞比例增加，通過影響JAK2/STAT3 通路，即減少JAK2 磷酸化和STAT3 表達，來降低 Treg 數量和功能表達［23］。IL-27作用機制尚不明確，相關研究發(fā)現，腺相關病毒AAV-IL-27 能夠有效抑制腫瘤生長，其機制主要為通過 IL-27R-STAT1 信號通路來抑制 Treg、IL-2R 和IL-2 表達，同時，AAV-IL-27 可抵消 anti-PD-1 的抗性［24］。然而有研究者卻認為特異性IL-27 受體并不影響Treg 的生長和存活，甚至IL-27 能增強Treg 的穩(wěn)定性［25］。

2.3 妊娠期Treg 及相關因子變化 在正常妊娠過程中，Treg數量和比例呈現增高趨勢。有研究發(fā)現，同種異體妊娠的子宮引流盆腔淋巴結中Treg 組成比例有明顯的升高。母體IL-6 能減少Treg 在子宮中的累積，但在同基因妊娠的子宮頸中，Treg呈現增加趨勢，同時胎兒抗原的含量與子宮胎盤界面Treg的積累量相關聯［26］。Treg缺失的淋巴細胞會導致流產發(fā)生，而同種異體妊娠小鼠體內的CD4+CD25+Treg能有效防止妊娠前4.5 d的胎兒排斥反應，說明Treg對于維持特異性的同種異性抗原耐受和小鼠的孕早期胚胎移植有重要作用［27］。QIAN 等［3］研究顯示，健康妊娠婦女與健康未妊娠婦女相比，Treg 在CD4+T 細胞中的占比明顯增高，但URSA 妊娠和未妊娠患者則差異不大。與健康妊娠婦女相比，UR?SA 妊娠患者蛻膜組織中 IL-6、TNF-α mRNA 的表達明顯增高，而 Foxp3、CTLA-4 和 TGF-β1 mRNA 的表達則明顯降低。說明Treg 及Treg 相關因子含量改變可能是導致URSA 患者母胎免疫失衡的重要因素。也有研究顯示，Treg 在URSA 患者外周血和蛻膜中含量均減少［17］，Foxp3 mRNA 的表達在外周血中呈下降趨勢，外周血中Foxp3 水平下降，血清中IL-10 水平降低［14，21］。Treg 及其相關細胞因子在妊娠過程中可調控免疫反應，因此含量水平的偏倚提示病理妊娠的形成。

3 Th17/ Treg平衡

3.1 Th17/Treg 及其他細胞因子失衡和不明原因復發(fā)性流產

淺談鋼纖維環(huán)氧樹脂混凝土在維修橋梁伸縮縫中的應用……………………………………………………… 陳聯川（9-89）

3.1.1 細胞數量異常與不明原因復發(fā)性流產Th17 與Treg 雖起源于同種細胞，但在免疫系統(tǒng)中的作用卻是相互拮抗的。Th17 的促炎性與Treg 對免疫的調節(jié)性相互作用構成平衡，在免疫耐受與免疫防御中具有重要作用。健康的免疫系統(tǒng)可調節(jié)對自身抗原和外源生物的免疫功能，正常妊娠中胚胎的抗原會對母體的免疫系統(tǒng)產生影響，其中Treg 能調節(jié)Th17含量變化并保護胚胎免受母體的攻擊［19］。在母胎免疫耐受系統(tǒng)中Th17和Treg具有重要影響，其含量變化可能會導致病理妊娠的發(fā)生，例如子癇前期、URSA 等［10，19］。

一般而言，正常妊娠人體中特殊Treg 類細胞，如CD4+CD25+Treg，在孕早期呈現增高趨勢，之后在孕中期達到頂峰后開始下降，產后下降至較低水平，但與孕前相比，Treg 水平仍然較高［28-29］。孕晚期胎兒Treg水平降低有利于分娩的開始。相反，CD4dimCD25highFoxp3+Treg 在妊娠人體孕中期開始下降。同時，Foxp3+Treg 的持續(xù)表達能抑制母體免疫反應對胎兒的傷害［29］。URSA 患者和正常妊娠的蛻膜免疫細胞中CD4+T 細胞比例變化不大，但在URSA 患者中Foxp3+、Treg細胞數量降低，IL-17+、Th17細胞數量升高，且 Th17/Treg呈增高趨勢［3，30］，提示URSA 的發(fā)生可能與Th17/Treg平衡偏倚相關聯。

3.1.2 細胞因子異常與URSA 在URSA 患者中，血清中 IL-17、IL-21 和 IL-22 含量升高，而 IL-10、TGF-β 含量降低［16］，外周血中 Foxp3+、TGF-β 基因表達水平降低，IL-6、IL-17、IL-23 基因表達水平升高［30］，提示基因表達及相關細胞因子含量變化與URSA蛻膜和外周血中Th17、Treg變化相關聯。

3.2 細胞參與調節(jié)Th17/Treg平衡

3.2.1 滋養(yǎng)層細胞 滋養(yǎng)層細胞與母體免疫細胞有雙向調節(jié)機制，在正常妊娠周期中，人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞（HTR8/Svneo）能促進 CD4+Foxp3+Treg 的增長及相關細胞因子TGF-β1 的表達，促進Th17 的增殖和凋亡基因表達。而Th17/Treg 細胞環(huán)境控制性地調節(jié)滋養(yǎng)層細胞的生長增殖［31］。有研究顯示，Toll 樣受體4（TLR4）通過直接或間接誘導滋養(yǎng)細胞異常凋亡，誘發(fā)母-胎免疫失衡導致URSA［32］。此外，TLR4誘導獲得性免疫影響Treg分化、活化、增殖和功能，從而導致Th17/Treg 平衡失調，引起URSA，但其中的影響機制尚不明確［33］。在先兆子癇患者中，滋養(yǎng)層細胞蛋白CD81 在體內表達上調，顯示母體基膜層和外周血中的Treg 含量降低，Th17 含量增加［34］。提示在其他病理妊娠情況下，滋養(yǎng)層細胞對母體Th17/Treg 平衡的調節(jié)是導致疾病的重要因素之一。

3.2.2 樹突狀細胞（dendritic cells，DCs） DCs 在調節(jié)免疫耐受中發(fā)揮重要作用，促進妊娠期正常的免疫應答反應，有助于妊娠。妊娠周期中分泌妊娠特異性糖蛋白1a（PSG1a），能介導 DCs 的分化，分化后的 DCs 可促進 TGF-β 或 IL-10 的分泌以及程序性死亡配體（PD-L1）的應答反應，增加小鼠中Treg 的數量［34］。半乳糖 Gal-1 調節(jié) DCs 誘導產生的 Treg/Th17 時，抑制 Th17 分化，促進 Treg 的產生，在介導Treg的產生機制中主要是通過影響IL-27的含量，抑制Th17，促進Treg增殖［35］。

3.3 細胞因子參與調節(jié)Th17/Treg平衡

3.3.1 IL-6 Treg 和Th17 相關因子通過共同調節(jié)兩種細胞數量變化對母胎免疫耐受產生影響。IL-6是一類調節(jié)Th17/Treg平衡的重要細胞因子，在UR?SA患者血清中，IL-6的水平明顯增高［14］，促進CD4+T細胞向Th17 方向進行分化。有研究認為IL-6 含量水平與 Th17、ROR-γt 呈正相關，而與 Treg、Foxp3 呈負相關［14］，IL-6 可能通過阻斷 Foxp3 基因的表達抑制Treg產生，刺激ROR-γt的表達促進Th17增殖。

3.3.2 IL-27 IL-27是IL-12/IL-6家族的一類異丁烯細胞因子，在許多細胞，尤其是T細胞中對先天性免疫和適應性免疫都發(fā)揮重要調節(jié)作用。在URSA患者的蛻膜中，IL-27 表達減少，同時IL-27 可抑制IL-17，促進IL-10表達［36］，因此URSA中IL-17的水平升高，IL-10 下降可能與IL-27 的調節(jié)有關。IL-27 對Th17/Treg 的調節(jié)機制尚不明確，有研究認為IL-27因子對Treg 和Th17 分化均有抑制作用，其中通過STAT1通路抑制Th17，而對iTreg細胞的抑制作用與STAT1 通路無關［11］。另一研究得出不同結論，認為IL-27能增強Treg的穩(wěn)定性，減輕炎癥反應［25］。在其他免疫類疾病中，IL-27 對Treg/Th17 的影響也會導致疾病的發(fā)生，在膠原誘導性關節(jié)炎中，IL-27 因子通過影響 IL-17、RORt、STAT3 的基因表達，影響Th17 含量。IL-27 可能主要通過增加CTLA4+含量，增強對Treg的抑制作用［37］。

3.3.3 其他細胞因子 除上述細胞因子之外，其他因子對Th17/Treg 平衡的影響也會導致病理妊娠的發(fā)生。CTLA-4 和免疫檢查點蛋白Tim-3 的阻礙作用不利于正常妊娠，易導致胚胎的吸收，受孕數下降，正常妊娠中會阻礙Treg 相關的調節(jié)保護作用。與正常妊娠相比，在URSA 中，dCD4+T 細胞中CTLA-4和Tim-3呈現出低表達趨勢，同時，dCTLA-4+Tim-3+CD4+T細胞低表達Treg相關細胞因子，提示流產的發(fā)生［38］。在小鼠模型中，NLRP3（NACHT、LPR and PYD domains-containing protein 3）呈現出高表達特征，Th17 釋放促炎因子IL-17，對于炎癥體NLRP3的表達呈相關，而Treg 的表達會抑制NLRP3 表達，在正常妊娠過程中起到免疫耐受作用［1］。促性腺激素釋放激素激動劑（GnRHa）能調節(jié)Th17/Treg 平衡，在不明原因胚胎種植障礙的患者中，GnRHa 能有效減少Th17含量而增加Treg含量，改善內皮容受性［39］。IL-10作為免疫系統(tǒng)重要的抗炎因子，是Treg調節(jié)妊娠過程免疫耐受的重要部分，IL-17A 則是由Th17 產生的，介導眾多炎癥發(fā)生的促炎因子，在URSA 患者的蛻膜和外周血中，IL-10 水平隨Treg 水平下降，而IL-17A水平隨Th17水平而上升［14］。

3.4 免疫抑制分子參與調節(jié)Th17/Treg 平衡 程序性死亡受體1/程序性死亡配體1（programmed cell death-1/programmed cell death-ligand 1，PD-1/PD-L1）在調節(jié)Th17/Treg 平衡中具有重要作用。在淋巴細胞減少誘導的新近胸腺遷出患者中，PD-1 的表達缺失并不會阻滯Treg 磷酸化過程，相反磷酸化的Treg 細胞數量增多，提示Treg 免疫功能障礙可能是通過PD-L1 表達進行調控，而PD-1 并不影響Treg產生［40］。在正常妊娠中，PD-L1 的缺失增加胚胎的吸收率，增加了濾泡調節(jié)性細胞（T follicular regula?tory，Tfr）的比例，同時提高了 PD-1 的表達水平［41］。PD-1 對于妊娠而言是重要的免疫調節(jié)因子，阻斷PD-1時，不僅會使小鼠流產率增加，還會加重CD8+T細胞的功能障礙［42］。妊娠期高血壓患者中，Treg 相關因子Foxp3 含量減少，PD-1/PD-L1 通路的激活因子PD-L1-Fc 能促進Treg 的分化，增加Treg 細胞因子含量［43］。先兆子癇患者中 Treg 表達減少，Th17 和PD-1 表達增加。PD-L1-Fc 通過PI3K/AKT/mTOR通路影響 Treg/Th17 及 Foxp3 和 RORt 含量［44-45］。與病理妊娠類似，PD-1/PD-L1 對Th17/Treg 的調節(jié)也可能影響其他免疫性疾病的發(fā)生，在早期RSA 和新近胸腺轉移模型中，PD-1 抑制劑（PD-1 blockade）能抑制吞噬細胞的活性，提高促炎因子表達，CD4+T 細胞比例上升，但CD4+CD25+Treg 比例變化不大，提示PD-1 主要抑制T 細胞的生長，而非促進Treg 的繁殖［40，46-47］。在腸梗阻患者中，PD-1 表達的升高與肝Th17增多有關，對提高肝Treg細胞數量意義不大［48］。

4 URSA中Th17/Treg免疫調節(jié)的相關治療

4.1 淋巴細胞免疫治療 臨床上對于URSA 的治療往往以恢復Th17/Treg 平衡，進而恢復母體和胎兒的正常免疫功能為主要方向。淋巴細胞免疫治療，通過父方或第三方的淋巴細胞來抑制母體免疫系統(tǒng)對胎兒的反應，實現妊娠。其中，淋巴細胞免疫療法能顯著減少Th17 和細胞因子水平，導致Foxp3 和 Treg 細胞因子增加，例如 IL-10、TGF-β 等，有助于成功妊娠［49］。在妊娠過程中，不同部位的淋巴細胞呈現不同特點，其中與子宮內膜和外周血相比，足月壁蛻膜中分化的Treg 數量明顯增加，提示Treg對妊娠過程中的耐受環(huán)境的促進作用［50］。

4.2 人絨毛膜促性腺激素和免疫球蛋白治療 人絨毛膜促性腺激素和免疫球蛋白治療URSA 中，治療后患者外周血中Th17 數量減少，Treg 數量增加，同時 Th17 相關細胞因子 IL-17、IL-6 等減少，Treg 相關細胞因子IL-10、TGF-β 等增加，利于妊娠狀態(tài)的維持，說明URSA 與Th17/Treg 的失衡相關，恢復Th17/Treg 平衡對于重建母胎免疫耐受，治療URSA至關重要［51］。

4.3 其他 在正常妊娠過程中，褪黑激素具有免疫調節(jié)的重要作用。血清中的褪黑激素在孕晚期會上升，伴隨Treg 及細胞因子TGF-β 含量的上升和Th17 數量的下降［52］。也有研究通過特異的組蛋白去乙?；敢种苿┻M行體外CD4+CD25+T 細胞表觀Foxp3 基因的遺傳修飾，在動物模型中進行RSA 的免疫調節(jié)治療，結果顯示CD4+CD25+Foxp3+iTreg 及PD-1 和CTLA-4 基因高表達，相關細胞因子TGF-β和IL-10 水平提高，進而提升易流產體質鼠脾中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞含量，減少胚胎吸收率［53］。

5 總結

妊娠是一個較為復雜的過程，胚胎的植入伴隨著母胎免疫耐受中諸多免疫細胞和免疫因子表達水平和含量的變化，以維持正常健康的妊娠環(huán)境。T 淋巴細胞、NK 細胞等具有調節(jié)妊娠微環(huán)境的作用，Th17/Treg等平衡的改變對母胎免疫耐受的影響至關重要，基因的過表達或低表達、平衡偏倚、細胞數量的變化都會導致妊娠環(huán)境的改變，是誘導UR?SA 等病理妊娠的重要因素［19］。在研究 URSA 的過程中，Th17/Treg 平衡并不是唯一影響因素，同樣不僅有唯一機制對平衡造成改變而導致疾病的發(fā)生，多因素影響下所見的只是宏觀的變化，微觀之下的調節(jié)會更為精細而復雜。在研究URSA 的道路上，仍有很多的工作尚未完成。