β-葡聚糖引起的訓(xùn)練免疫和LPS引起的免疫耐受在表觀遺傳和代謝水平的異同①

花 晴 申雪芳 許平波（復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，上海 200032）

膿毒癥是機(jī)體對炎癥反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的嚴(yán)重威脅生命的多器官功能損害，其本質(zhì)在于免疫調(diào)節(jié)紊亂。一方面，過度的免疫反應(yīng)可引起臟器功能損傷；另一方面，全身性免疫抑制可導(dǎo)致細(xì)胞因子缺乏，使機(jī)體存活的免疫細(xì)胞不能進(jìn)行有效的克隆增殖，進(jìn)而對病原體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答而形成免疫耐受［1］。目前，早期膿毒癥的死亡率逐漸降低，而因過度炎癥反應(yīng)或免疫耐受所致的二次感染是膿毒癥患者死亡的主要原因，使研究聚焦在膿毒癥導(dǎo)致的免疫改變上［2］。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，免疫反應(yīng)可分為固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，與前者相比，后者反應(yīng)慢但更具特異性，且可產(chǎn)生免疫記憶。現(xiàn)有研究證實(shí)，在炎癥感染或接種疫苗后，固有免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞可因表觀遺傳改變而產(chǎn)生固有免疫記憶，當(dāng)病原體再次入侵時(shí)產(chǎn)生一種更加強(qiáng)烈的固有免疫反應(yīng)，稱為固有免疫記憶或訓(xùn)練免疫（trained immunity，TI）［3］。臨床試驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)研究表明，膿毒癥后免疫耐受的形成并不可簡單歸納為某一特定通路受模式識別受體（pattern recogni?tion receptor，PRR）的影響無法激活下游基因，而是其自身染色質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生改變進(jìn)而導(dǎo)致耐受基因形成，使其在表觀遺傳和代謝水平均發(fā)生改變［4］。

單核細(xì)胞是骨髓細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞的中間體，是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分［5］。當(dāng)機(jī)體受病原體入侵時(shí)，單核細(xì)胞迅速趨向病原體，并分化為巨噬細(xì)胞來清除病原體，恢復(fù)組織完整性［6］。單核細(xì)胞及由單核細(xì)胞分化而來的巨噬細(xì)胞的功能表型取決于感染后免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)，即免疫耐受或TI［7］。在膿毒癥最初發(fā)生的數(shù)小時(shí)內(nèi)，固有細(xì)胞免疫耐受可保護(hù)機(jī)體免受過激的炎癥反應(yīng)影響［8］。而持續(xù)的免疫耐受可使機(jī)體進(jìn)入一種“免疫麻痹”狀態(tài)，單核/巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為促炎癥因子分泌減少或基本不分泌，人體白細(xì)胞抗原DR（human leu?kocyte antigen DR，HLA-DR）表達(dá)下降，單核細(xì)胞誘導(dǎo)的抗原特異性T淋巴細(xì)胞活性降低，單核細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子能力的改變，多形核白細(xì)胞無反應(yīng)性［9-11］。而特定感染如卡介苗注射等可延長單核細(xì)胞的作用時(shí)間并在病原體二次入侵時(shí)產(chǎn)生更加強(qiáng)烈的固有免疫反應(yīng)，即TI［12-15］。本文將圍繞脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）引起的免疫耐受和β-葡聚糖引起的TI在表觀遺傳學(xué)和代謝方面的異同展開，以期為臨床治療膿毒癥后免疫耐受提供幫助。

1 引起TI或免疫耐受的表觀遺傳學(xué)改變

1.1 LPS或BG介導(dǎo)的組蛋白表觀遺傳修飾 表觀遺傳學(xué)是指在基因的DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下，基因功能發(fā)生了可遺傳的變化，并最終導(dǎo)致表型的變化。LPS產(chǎn)生的免疫耐受與β-葡聚糖（βglucan，BG）引起的TI均與特定的表觀遺傳狀態(tài)密切相關(guān)［16-17］。近期研究表明，在真核細(xì)胞染色質(zhì)中，組蛋白第三亞基4號賴氨酸的表觀遺傳修飾在免疫記憶和免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用，其三甲基化水平（histone 3 lysine 4 methylation3，H3K4me3）能夠有效調(diào)控基因沉默和發(fā)育；而組蛋白第三亞基27號賴氨酸的乙?；剑╤istone 3 lysine 27 acetyla?tion，H3K27ac）則通過調(diào)控增強(qiáng)子和啟動子的激活進(jìn)一步調(diào)控真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄［18］。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控的實(shí)現(xiàn)，主要依賴于轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs）和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（transcription fac?tor binding sites，TFBSs）的相互作用。二者結(jié)合后可構(gòu)成轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合模體（transcription factor bind?ing motifs，TFBMs），進(jìn)而調(diào)控真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄［19-20］。

有研究表明，缺乏T細(xì)胞和B細(xì)胞的小鼠在受到白色念珠菌二次感染時(shí)，BG會通過C型凝集素受體（dectin-1）和Raf-1-依賴性通路引起單核細(xì)胞的功能重塑，促進(jìn)其釋放細(xì)胞因子增多，成為抵御病原體的主體［21］。單核細(xì)胞的上述功能改變與穩(wěn)定的組蛋白H3K4三甲基化改變有關(guān)，說明TI的形成與表觀遺傳改變，特別是組蛋白的改變密切相關(guān)。SAEED［16］等將從健康志愿者外周血中提取的單核細(xì)胞分別給予BG和LPS刺激以形成TI和免疫耐受。對組蛋白標(biāo)記H3K4me3、H3K4me1、H3K27ac和脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonucleaseⅠ，DNaseⅠ）進(jìn)行表觀基因分析發(fā)現(xiàn)，在單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞的過程中，TI細(xì)胞中表達(dá)代謝相關(guān)酶及炎癥因子的基因增多，而免疫耐受細(xì)胞中這些基因表達(dá)減少；約12%的TFs參與調(diào)節(jié)免疫耐受和TI的形成，且在特定動態(tài)表觀區(qū)的DNaseⅠ超敏位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了TFBMs，說明免疫耐受和訓(xùn)練記憶的表觀遺傳改變需要特定的TFs。有研究將單核細(xì)胞分別暴露于LPS和BG中24 h，再培養(yǎng)5 d后進(jìn)行表觀遺傳學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在3 200多個(gè)與脂質(zhì)代謝、白細(xì)胞分化及溶酶體相關(guān)的增強(qiáng)子組成的區(qū)域中，與對照組相比，暴露于BG的單核細(xì)胞H3K27ac沉積較多，H3K4me1沉積也較多，并抑制了H3K27me3的沉積，H3K27ac的聚集與H3K4me1一致；而暴露于LPS的單核細(xì)胞幾乎無H3K27ac沉積，但H3K27me3沉積較多，且相應(yīng)的H3K4me1沉積較少［22］。該研究表明，BG可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用和細(xì)胞因子釋放，而LPS則阻斷這一過程。上述研究均表明，LPS介導(dǎo)的免疫耐受和BG介導(dǎo)的TI均與特定的表觀遺傳修飾改變有關(guān)，且發(fā)生了相反的改變。

1.2 LPS或BG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)改變 通過對單核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)約5 700個(gè)mRNA在LPS和BG暴露下發(fā)生了動態(tài)變化［22］。與對照組相比，BG刺激后可促進(jìn)與脂質(zhì)合成、代謝和溶酶體途徑有關(guān)的mRNA表達(dá)，如早期生長反應(yīng)蛋白2（early growth response protein 2，EGR2）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子1（CSF1）、溶酶體相關(guān)膜蛋白-1（LAMP1）、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）等，單核細(xì)胞表達(dá)分化基因增快。與之相反，LPS刺激后，上述mRNA表達(dá)下調(diào)，單核細(xì)胞表達(dá)分化基因減慢，因而較少分化為巨噬細(xì)胞。提示BG刺激后可促進(jìn)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)吞噬清除病原體的能力；而LPS刺激后，單核細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受，進(jìn)而較少分化為巨噬細(xì)胞，抑制其吞噬功能。

2 調(diào)節(jié)免疫耐受和TI的代謝改變

2.1 EGR2免疫細(xì)胞代謝的改變可對早期細(xì)胞因子的釋放、免疫耐受的形成及最終形成免疫麻痹產(chǎn)生重要影響［23-26］。EGR2是BG受體dictin-1的下游分子，其修飾的增強(qiáng)子主要與脂質(zhì)代謝有關(guān)［27］。將人體外周血單核細(xì)胞（peripheral blood monocytes，PBMC）分別暴露于BG和LPS中24 h，靜置5 d后發(fā)現(xiàn)，暴露于BG的單核細(xì)胞可短暫激活EGR2，EGR2的表達(dá)量升高，H3K27ac在相關(guān)增強(qiáng)子中沉積增多，相應(yīng)的下游脂質(zhì)代謝基因表達(dá)升高；而暴露于LPS的單核細(xì)胞并未發(fā)現(xiàn)有類似的作用，其下游代謝基因表達(dá)較低［22］。提示BG/dectin-1引起的EGR2激活可促進(jìn)下游轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá)，上調(diào)與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的啟動子和增強(qiáng)子表達(dá)。而這些轉(zhuǎn)錄因子在LPS暴露的單核細(xì)胞中不表達(dá)，說明暴露于LPS的單核細(xì)胞無法激活與脂質(zhì)代謝相關(guān)的特異性下游通路。綜上，dictin-1-EGR2通路在免疫訓(xùn)練和免疫耐受的單核細(xì)胞中的表達(dá)截然相反，說明其可能與TI或免疫耐受的形成有關(guān)，且在其中發(fā)揮完全相反的作用。

2.2 mTOR通過對BG引起的TI細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，在基因組蛋白修飾過程中，除了脂質(zhì)代謝通路改變，其他重要細(xì)胞代謝通路如葡萄糖也發(fā)生了重要改變［28-30］。BG誘導(dǎo)的TI細(xì)胞有氧糖酵解增強(qiáng)，基礎(chǔ)呼吸效率降低，葡萄糖消耗增多，乳酸形成增多。提高的糖酵解水平可調(diào)控組蛋白的甲基化和乙?；?，作為BG引起TI的代謝學(xué)基礎(chǔ)。

雷帕霉素靶向基因（mammalian target of rapa?mycin，mTOR）的表達(dá)在BG或LPS引起的免疫改變過程中均發(fā)揮巨大的作用。有研究表明，mTOR-缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α，mTOR-HIF-1α）通路對BG引起的TI細(xì)胞糖代謝改變至關(guān)重要。阻斷mTOR-HIF-1α通路可抑制TI形成。給予小鼠mTOR抑制劑或敲除小鼠的HIF-1α，則無法產(chǎn)生TI以應(yīng)對病原體的二次入侵［17］。還有研究表明，LPS引起的免疫耐受中也發(fā)現(xiàn)了mTOR表達(dá)的改變。mTOR對巨噬細(xì)胞的吞噬作用和極化均有重要作用［31-32］。M1型巨噬細(xì)胞可分泌大量細(xì)胞因子，激活機(jī)體免疫反應(yīng)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)；而M2型巨噬細(xì)胞具有抗炎、抑制細(xì)胞因子釋放、抑制免疫應(yīng)答的作用［33］。激活mTOR可促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化為M2型。給予mTOR抑制劑雷帕霉素后，巨噬細(xì)胞主要極化為M1型。由此說明，在TI和免疫耐受中，這些看似無特殊作用的代謝產(chǎn)物可通過改變基因相關(guān)酶的活性來修飾表觀遺傳。

2.3 衣康酸鹽 衣康酸鹽是三羧酸循環(huán)（tricarbox?ylic acid cycle，TCA）中順烏頭酸在免疫反應(yīng)基因1（immune-responsive gene 1，IRG1）的調(diào)節(jié)下由烏頭酸脫氫酶1（aconitate decarboxylase 1，Acod1）催化產(chǎn)生。膿毒癥時(shí)，髓樣細(xì)胞急劇激活可導(dǎo)致衣康酸鹽大量產(chǎn)生，進(jìn)而介導(dǎo)人單核細(xì)胞產(chǎn)生固有免疫耐受［34-36］。

大量研究成果表明，衣康酸鹽作為主要代謝產(chǎn)物，通過調(diào)節(jié)琥珀酸脫氫酶（succinate dehydroge?nase，SDH）的表達(dá)以及TCA循環(huán)體在LPS或BG介導(dǎo)的免疫改變過程中發(fā)揮巨大作用［37-39］。LPS刺激后，衣康酸鹽是巨噬細(xì)胞中上調(diào)最明顯的代謝產(chǎn)物。巨噬細(xì)胞內(nèi)急劇升高的衣康酸鹽一方面可抑制SDH，調(diào)節(jié)琥珀酸和延胡索酸水平，抵消琥珀酸的促炎作用；另一方面可激活Nrf2，上調(diào)抗炎抗氧化基因表達(dá)，抑制炎癥基因表達(dá)，抑制細(xì)胞因子IL-1β、IL-18、IL-6、IL-12、NO和HIF-1α表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生抗炎作用，介導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受［40］。而BG引起的TI可通過下調(diào)IRG1表達(dá)，上調(diào)SD的表達(dá)，進(jìn)而抑制衣康酸鹽的產(chǎn)生，恢復(fù)TCA循環(huán)，使機(jī)體面對二次感染時(shí)產(chǎn)生更強(qiáng)的固有免疫反應(yīng)。為進(jìn)一步探究其表觀遺傳改變，將PBMC分別給予LPS或BG刺激后，研究者們通過檢測H3K27ac水平發(fā)現(xiàn)，LPS可引起IRG1周圍大量的H3K27乙?；?。且H3K27ac的動態(tài)變化與IRG1的高表達(dá)曲線一致。當(dāng)受到LPS和BG混合刺激或在LPS刺激前暴露于BG，巨噬細(xì)胞IRG1含量僅輕度升高，說明BG可抑制LPS引起的IRG1高表達(dá)，進(jìn)而阻斷衣康酸鹽的形成。LPS刺激后4 h細(xì)胞處于耐受狀態(tài)，SDH表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而影響琥珀酸和延胡索酸間的代謝轉(zhuǎn)換，阻斷琥珀酸激活的促炎通路，影響體外單核細(xì)胞分化。而在LPS刺激后給予BG可恢復(fù)SDH表達(dá)的上調(diào)。即BG可逆轉(zhuǎn)LPS導(dǎo)致的單核細(xì)胞SDH表達(dá)下調(diào)，恢復(fù)SDH表達(dá)［41］。由此可知，IRG1-衣康酸鹽-SDH軸在LPS引起的單核細(xì)胞免疫耐受中發(fā)揮重要作用，BG或可逆轉(zhuǎn)LPS造成的免疫耐受。

3 BG可逆轉(zhuǎn)膿毒癥后免疫耐受

BG和LPS暴露對組蛋白標(biāo)記H3K4me3、H3K4me1、H3K27ac在目標(biāo)啟動子和增強(qiáng)子的沉積、轉(zhuǎn)錄組的變化、EGR2及下游轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)、mTORHIF-1α通路的激活、TCA中衣康酸鹽的產(chǎn)生有完全相反的影響，進(jìn)而對與單核/巨噬細(xì)胞功能有關(guān)的基因的表達(dá)、代謝通路如糖代謝及細(xì)胞因子的產(chǎn)生發(fā)生截然不同的調(diào)節(jié)，提示BG或可逆轉(zhuǎn)免疫耐受。將單核細(xì)胞暴露于LPS 24 h誘發(fā)免疫耐受后再暴露于BG 24 h，經(jīng)歷一段不打擾時(shí)間后再次暴露于LPS，探索BG對LPS誘發(fā)的免疫耐受的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS耐受后給予BG可恢復(fù)約60%的耐受基因表達(dá)，包括一些促炎的TFs，部分恢復(fù)單核細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的水平［16］。為進(jìn)一步確定其療效，在人體實(shí)驗(yàn)中，健康志愿者注射LPS后4 h，關(guān)鍵細(xì)胞因子如IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)增多，細(xì)胞因子釋放增多。抽取志愿者外周血，再次暴露于LPS，則無細(xì)胞因子釋放［22］。說明單核細(xì)胞產(chǎn)生了耐受。而事先給予BG，可恢復(fù)炎癥因子IL-6和TNF-α的釋放，解除單核細(xì)胞的耐受。上述研究在細(xì)胞和人體水平證明了，LPS在體內(nèi)外引起耐受的機(jī)制相同，BG逆轉(zhuǎn)LPS引起的免疫耐受的潛能或可被推廣到臨床。

4 展望

膿毒癥的死亡率在30%～50%，且因耐藥性嚴(yán)重、老年人口增多和免疫抑制的發(fā)生率升高，膿毒癥的死亡率也逐年升高［42］。如何逆轉(zhuǎn)膿毒癥后的免疫耐受成了國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

表觀遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，早期暴露于病原體時(shí)，免疫耐受和TI可對常見通路如IRG1-衣康酸鹽-SDH軸產(chǎn)生完全相反的調(diào)節(jié)，產(chǎn)生不同的表觀遺傳改變，形成不同的巨噬細(xì)胞表型和免疫功能狀態(tài)。免疫耐受表現(xiàn)為低免疫反應(yīng)狀態(tài)，而TI表現(xiàn)為高免疫反應(yīng)，產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子。鑒于二者存在相反的表觀遺傳改變和單核/巨噬細(xì)胞功能狀態(tài)，研究者或許可將BG引起的TI作為治療免疫耐受靶點(diǎn)。近年來，DNA剪切技術(shù)的飛速發(fā)展也為研究者明確對BG反應(yīng)最明顯的轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳因子和DNA甲基化片段提供了幫助。為研究者確定治療靶點(diǎn)，盡快將BG應(yīng)用于臨床提供助力。除了免疫耐受的研究，也可將BG引起的TI用于其他臨床疾病，如腫瘤、自身免疫疾病和自身炎癥反應(yīng)等。

免疫領(lǐng)域還有很多問題值得深思。研究者需要進(jìn)一步闡述影響TI和免疫耐受的代謝和表觀遺傳過程，探討TI和免疫耐受之間的復(fù)雜關(guān)系。隨著科學(xué)的進(jìn)展，BG引起的訓(xùn)練免疫和LPS引起的免疫耐受的具體機(jī)制正在被逐步明確，單核細(xì)胞作為固有免疫的重要組成部分，與免疫耐受和TI密切相關(guān)，但其他固有免疫成分，如補(bǔ)體系統(tǒng)、溶菌酶是否也會在TI和免疫耐受的代謝和表觀遺傳過程中發(fā)揮作用，TI和免疫耐受之間依靠哪些機(jī)制相互調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換等問題都需要進(jìn)一步探究。