2019冠狀病毒病相關血栓形成的研究進展*

沈國民， 沈 滟， 楊海平

（1河南科技大學基礎醫(yī)學院，河南省血栓與止血國際聯(lián)合實驗室，河南洛陽471023；2河南科技大學第一附屬醫(yī)院血液科，河南洛陽471023）

新型冠狀病毒肺炎（2019 冠狀病毒病，coronavirus disease 2019，COVID-19）是由新型冠狀病毒（嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2，severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2；簡稱新冠病毒）引起的一種呼吸系統(tǒng)傳染病，是目前人類面臨的最大的公共衛(wèi)生問題。起初，COVID-19 被認為主要引起肺炎和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）等呼吸道相關臨床特征［1-2］，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn) COVID-19 與靜脈、動脈和微血管血栓形成的血栓前狀態(tài)密切相關，這些血栓前狀態(tài)也預示病人的不良預后［3-4］。而目前關于新冠病毒感染、血栓形成和臨床結局之間的精確聯(lián)系尚不清楚。因此，有關新冠病毒感染如何引起血栓前狀態(tài)和血栓并發(fā)癥、如何影響COVID-19 發(fā)病進程，以及如何進行有效防治等，均為基礎與臨床亟待解決的重大問題。本文將結合COVID-19 患者的血凝異常，探討COVID-19 相關血栓形成的潛在機制，探索預防和治療與COVID-19 相關血栓形成的有效方法，使大家認識到對COVID-19 患者進行抗凝治療的重要性。

1 冠狀病毒簡介

自進入21 世紀以來，已發(fā)現(xiàn)3 種冠狀病毒引起人類嚴重的呼吸系統(tǒng)傳染病，包括SARS 冠狀病毒、中東呼吸綜合征（Middle Eastern respiratory syndrome，MERS）冠狀病毒及新冠病毒。冠狀病毒以多種動物為宿主，并且可以傳播至人類及多種動物。目前認為SARS 冠狀病毒和新冠病毒可能起源于蝙蝠［1］，而 MERS 冠狀病毒的宿主可能是單峰駱駝［5］。研究表明，冠狀病毒在人畜共患傳播之前，必須在中間宿主中進行自然選擇，以使其具有感染人類的能力［5］。目前，在馬來亞穿山甲中已鑒定出與新冠病毒密切相關的冠狀病毒［6］。

冠狀病毒通過其跨膜刺突蛋白（spike protein，S蛋白）感染宿主細胞。S蛋白包含S1和S2亞基，其中S1 亞基負責與宿主細胞表面受體結合，S2 亞基輔助病毒和宿主細胞融合［7］。MERS冠狀病毒的S蛋白結合人上皮細胞表達的二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）［5］，新冠病毒和 SARS 冠狀病毒的 S 蛋白以血管緊張素轉換酶2（angiotensin-converting enzyme-2，ACE-2）為受體感染人內皮細胞［7-8］。與SARS 冠狀病毒相比，新冠病毒S 蛋白的受體結合結構域具有全新的結構特征，即在S1和S2亞基的連接處存在多個弗林蛋白酶切割位點［7］。S 蛋白的切割可能對病毒的感染性及感染宿主的范圍起著重要作用，其結構特征可能與COVID-19 相關血栓形成的臨床特征相關［4，7］。

2 COVID-19相關血栓形成和凝血異常

研究表明，COVID-19 患者發(fā)生靜脈、動脈和微血管血栓形成風險顯著增加［3-4，7］。在 COVID-19 重癥患者中，纖維蛋白原、D-二聚體和C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）等急性期反應蛋白的升高可能與COVID-19 相關血栓前狀態(tài)有關［9-10］。這些急性期反應蛋白也與患者的不良臨床預后相關。與普通患者相比，重癥患者血漿中D-二聚體升高，而血漿D-二聚體正在作為COVID-19的預后標志物［11-13］。

2.1 COVID-19與靜脈血栓形成 研究顯示，COVID-19 患者發(fā)生靜脈血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）的概率明顯增加［14-15］。與其他病毒相關ARDS患者相比，新冠病毒相關ARDS患者發(fā)生肺栓塞的概率顯著升高；且在具有肺栓塞并發(fā)癥的COVID-19 重癥患者中，VTE 的累積發(fā)生率約為 25%～49%［15-16］。尸檢研究表明，VTE 可能是導致COVID-19 重癥患者死亡的主要原因［17-18］。在生前未被診斷為VTE 的COVID-19 患者中，尸檢卻觀察到大量深靜脈血栓或肺栓塞，且大面積肺栓塞可能是導致超過30%患者死亡的直接原因［18］。以上研究證實了COVID-19 與靜脈血栓形成之間的關系。

2.2 COVID-19 與動脈血栓形成 除VTE 發(fā)生率明顯升高外，COVID-19 患者發(fā)生動脈血栓栓塞的概率也增加了［16-17］。有研究報告COVID-19住院患者發(fā)生急性缺血性卒中的概率介于3%～5%，值得關注的是COVID-19 增加了年輕人發(fā)生急性缺血性卒中的風險［19］。此外，急性心肌損傷也是 COVID-19 患者常見的并發(fā)癥，影響高達20%到醫(yī)院就診的患者［20-21］。由于心肌損傷增加了COVID-19 的嚴重程度，因此，在COVID-19 患者中要優(yōu)先控制潛在的心血管危險因素。

2.3 COVID-19 與微血管血栓形成 尸檢研究報告顯示，肺部微血管血栓形成是COVID-19 重癥患者的并發(fā)癥［22-23］。這個特征在其他冠狀病毒疾病中也有報道，不過該特征在COVID-19 重癥患者中尤為明顯［24］。與流感患者相比，COVID-19 相關 ARDS 患者發(fā)生肺部微血管血栓的概率增加了9 倍［24］。除了可以預見的彌漫性肺泡損傷外，對COVID-19 相關ARDS 患者的尸檢研究還觀察到血小板-纖維蛋白血栓分布在小型肺血管中，其在尸檢肺中的發(fā)生率大約為80%～100%［22-23］。在COVID-19 患者中，微血管血栓形成可能與彌散性血管內凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）并 發(fā) 癥 相 關 ，因 為71.4%的COVID-19 死亡患者在生前具有DIC 并發(fā)癥，而在COVID-19 生存患者中DIC 并發(fā)癥的發(fā)生率只有 0.6%［12］。

3 COVID-19相關血栓形成的可能機制

雖然新冠病毒導致血栓形成的具體機制還未闡明，但結合COVID-19 患者的臨床數(shù)據(jù)，目前認為新冠病毒可能通過誘導免疫血栓形成（immunothrombosis）增加 COVID-19 患者血栓并發(fā)癥的發(fā)病風險［4］。當新冠病毒感染內皮細胞后，誘導感染的細胞發(fā)生焦亡，導致其釋放病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），并觸發(fā)鄰近細胞釋放促炎細胞因子和趨化因子，上調表達血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）和一些黏附分子［4］。上述因素通過固有免疫途徑促進血小板和白細胞活化，并使其募集在炎癥內皮細胞周圍。COVID-19 重癥患者具有較強的炎癥反應，提示機體可能激活固有免疫反應［25］。目前已明確固有免疫反應與血栓形成密切相關，提示COVID-19 患者的血栓并發(fā)癥與免疫血栓形成相關［4］。在免疫血栓形成過程中，病原入侵機體誘導的炎癥反應使血小板和白細胞活化，而活化的血小板和中性粒細胞分別釋放無機多聚磷酸（polyphosphate，PolyP）和中性粒細胞胞外殺菌網絡（neutrophil extracellular traps，NETs）協(xié)同參與激活內源性凝血途徑；與此同時，病原體激活的補體通過募集白細胞、活化血小板、上調表達組織因子和促炎細胞因子等而增強內源性凝血途徑的激活。這些因素最終導致不受限制的凝血酶生成和血栓形成。下面我們將結合COVID-19 患者的臨床發(fā)現(xiàn)，進一步探討內皮細胞、白細胞、血小板和補體系統(tǒng)在COVID-19 相關免疫血栓形成中的可能作用。

3.1 內皮細胞損傷 由于新冠病毒S 蛋白的受體ACE-2 廣泛表達于肺、血管、心臟、腎臟和小腸等多種組織器官的內皮細胞，所以新冠病毒可以感染人體多種組織［7］。新冠病毒感染內皮細胞誘導其發(fā)生焦亡，導致細胞內容物的釋放；而鄰近的內皮細胞通過模式識別受體，如Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR），識別釋放的PAMPs 和DAMPs，引起強烈的炎癥反應，并釋放促炎趨化因子和細胞因子，這些炎癥因子將激活固有免疫途徑［26］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)新冠病毒的多個單鏈 RNA 片段可被 TLR-7 和 TLR-8 識別［27］。此外，臨床數(shù)據(jù)還發(fā)現(xiàn)COVID-19 患者體內促炎因子水平升高，如白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、單核細胞趨化蛋白 1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、巨噬細胞炎癥蛋白（macrophage inflammatory protein，MIP）等［25，28］。 這些促炎因子可以破壞內皮細胞的功能和完整性，導致內皮下VWF 的釋放、黏附分子的上調表達及內皮細胞來源的細胞因子和趨化因子的生成，進而通過固有免疫途徑促進血小板和白細胞的活化和募集［4，29］。尸檢研究顯示，COVID-19 患者的肺、腎和腸等器官的內皮細胞存在炎癥和細胞死亡的組織學證據(jù)，這也證實了新冠病毒感染引起內皮細胞損傷［30］。此外，嚴重缺氧是COVID-19 患者的一個重要特征，缺氧會激活低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF），活化的HIF 可上調內皮細胞組織因子的表達，并下調天然抗凝蛋白——蛋白S（protein S，PS）和組織因子途徑抑制劑（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）的表達［31］。以上結果表明新冠病毒在系統(tǒng)性促進血管內皮細胞功能障礙中發(fā)揮直接作用，是導致血栓前狀態(tài)進而誘導血栓形成的重要機制之一。

3.2 血小板活化 血小板除參與止血作用外，還具有重要的免疫功能［32］，血小板上許多受體和粒狀蛋白在固有免疫反應中發(fā)揮著重要作用。實際上，活化的血小板從其α 顆粒和致密顆粒中釋放出許多趨化因子，包括C-X-C 基序趨化因子配體1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）、CXCL5、C-C 基序趨化因子配體3（C-C motif chemokine ligand 3，CCL3）、CCL7、血小板因子4（platelet factor 4，PF-4）、中性粒細胞活化肽 2（neutrophil-activating peptide 2，NAP-2）和RANTES（regulated on activation，normal T-cell expressed and secreted）等，這些趨化因子促進白細胞募集到血管內皮損傷或發(fā)炎部位［33］?；罨难“灞砻姹磉_的P-選擇素與白細胞表達的P-選擇素糖蛋白配體1（P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1）結合而束縛白細胞［34］。同時，血小板表達的糖蛋白Ib（glycoprotein Ib，GP-Ib）通過與白細胞表達的整合素Mac-1（macrophage antigen 1）結合［35］，協(xié)助白細胞與活化的血小板黏附，繼而形成血小板-白細胞異聚體。該異聚體除了改變血小板和單核細胞的生物學功能外，還可促進微血管栓塞的形成［36］。此外，活化的血小板還通過釋放PolyP 而促進血凝，后者通過活化XII 因子（factor XII，F(xiàn)XII）而驅動內源性凝血途徑的凝血酶生成和血栓形成［37］。

目前有關新冠病毒與血小板的相關研究較深入的是對血小板數(shù)量的影響，而對于如何影響COVID-19 相關血栓形成的機制相對較少。在COVID-19 的重癥患者中常見血小板減少癥，但血小板減少的程度通常較輕，而在普通COVID-19 患者中，血小板減少癥不常見［38］。

3.3 白細胞活化 炎癥標志物（例如CRP、鐵蛋白和IL-6）的升高是COVID-19 重癥患者的顯著特征之一［9］。與普通患者相比，COVID-19 重癥患者產生IL-6的CD14+/CD16+單核細胞顯著擴增［39］。促炎細胞因子（主要是IL-6）通過活化白細胞（主要是單核細胞和中性粒細胞）上調表達組織因子，增強凝血作用［40］。另一方面，活化的血小板促進中性粒細胞釋放NETs?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，COVID-19 患者血清中NETs 水平升高，且NETs 水平升高與D-二聚體升高相關，二者與疾病的嚴重程度相關［41］?；罨陌准毎尫臢ETs 是一種固有免疫應答，是機體干擾病原體入侵的主要防御機制。研究表明，NETs 除可以隔離病毒外，還能捕獲和殺死細菌和真菌［42］。在血栓形成的條件下，帶負電荷的NETs 可以捕獲紅細胞并激活血小板；NETs 還可以作為凝血的支架和強力激活劑，通過活化FXII 激活內源性凝血途徑［43］。現(xiàn)有結果表明NETs 通過激活血小板和FXII 可能在介導COVID-19相關血栓形成中發(fā)揮重要作用。

3.4 補體系統(tǒng)的活化 補體系統(tǒng)是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分。在COVID-19 重癥患者的活檢組織中發(fā)現(xiàn)補體成分C5b-9 和C4d 在微血管中廣泛沉積，且這些血管主要表現(xiàn)為微血管血栓［44］。另外，COVID-19 重癥患者的肺切片均表現(xiàn)出很強的補體染色，同時重癥患者的血清中C5a 水平升高，在一些病例中還發(fā)現(xiàn)新冠病毒的S 蛋白與C5b-9 和C4d 共定位［4，44］。從機制上講，新冠病毒的核衣殼蛋白與甘露糖相關絲氨酸蛋白酶2（mannose-associated serine protease-2，MASP-2）結合可能觸發(fā)補體系統(tǒng)激活并放大組織損傷［4］。激活補體途徑將增強內皮細胞促炎因子的表達，并上調表達一些內皮黏附分子。其中，C5a 和C3a 能促進單核細胞和中性粒細胞的募集和活化。通過C5a 誘導中性粒細胞組織因子的表達、C5b-7 誘導單核細胞組織因子的表達和C5b-8/C5b-9介導的血小板激活，補體系統(tǒng)的活化也可以直接誘導促血栓表型［45］。此外，CRP 是補體途徑的激活劑，血漿CRP水平升高與COVID-19嚴重程度的相關性也說明了免疫系統(tǒng)和補體系統(tǒng)之間的聯(lián)系［9］。

4 靶向血栓形成——中西醫(yī)防治COVID-19 的探索

由于COVID-19 患者血栓并發(fā)癥發(fā)生率較高，所以臨床上正在探索抗血栓治療對COVID-19 患者的防治效果。目前，一些具有抗炎和（或）抗病毒特性的抗血栓藥物已經進入臨床試驗。此外，血栓形成可以歸屬中醫(yī)“血瘀”病機范疇，一些具有活血化瘀功效的方劑也納入了我國COVID-19 防治指南。本文主要從以下幾個方面討論中西醫(yī)通過靶向血栓形成而防治COVID-19的探索。

4.1 抗凝治療 針對COVID-19 患者的血栓并發(fā)癥，目前臨床上一般采用低分子肝素或普通肝素對VTE 進行預防治療［13，46］。在 D-二聚體升高或膿毒癥誘導的凝血功能評分升高的COVID-19 患者中，使用低分子肝素治療可降低死亡率［47］。除了具有直接抗凝作用外，肝素還可能通過結合DAMPs、促炎細胞因子甚至病毒顆粒而發(fā)揮抗炎和抗血栓作用［48］。早期的體外實驗顯示，肝素可抑制SARS冠狀病毒與細胞的結合，其機制可能是通過肝素抑制FXa 的活性從而抑制病毒感染細胞，因為研究發(fā)現(xiàn)FXa 可通過切割SARS 冠狀病毒的S 蛋白使病毒更有效地感染細胞［49-50］；近期發(fā)現(xiàn)肝素可以直接與新冠病毒的S 蛋白結合［51］。這些結果提示肝素可能具有抗新冠病毒特性。需要注意的是肝素治療可能導致肝素誘導的血小板減少癥，不過，目前觀察到肝素誘導的血小板減少癥僅限于個別病例報告［4］。

4.2 靶向接觸因子FXII FXII 可以被攜帶負電荷的NETs 或血小板來源的PolyP 激活而導致血栓形成。FXIIa 通過釋放緩激肽、上調中性粒細胞功能和生成單核細胞來源的促炎細胞因子，發(fā)揮促炎功能，進而促進血栓前狀態(tài)。在血栓形成動物模型中，抑制FXIIa可以防止閉塞性血栓形成，且不妨礙止血功能［52］。在系統(tǒng)炎癥反應綜合征動物模型中，使用致命的大腸桿菌進行挑戰(zhàn)實驗，顯示抑制FXIIa可提高動物的生存率，并減少補體激活、中性粒細胞脫顆粒和包括IL-6 在內的許多炎癥標志物的產生［53］。由于FXII 活性缺乏的個體未見出血表型，其抑制劑用于治療血栓是相對安全的，所以FXII 是一個有吸引力的、治療COVID-19的靶點［4，54］。

4.3 纖溶治療 組織型纖溶酶原激活劑（tissuetype plasminogen activator，t-PA）將無活性的纖溶酶原轉化為有活性的纖溶酶，后者通過分解交聯(lián)的纖維蛋白，達到溶栓的效果。目前一些研究正在探索t-PA 在治療COVID-19 中的潛在價值，因為COVID-19重癥患者常出現(xiàn)ARDS，進而導致大量纖維蛋白形成和微血管血栓形成。在一項針對ARDS 的臨床研究中，1 例COVID-19 重癥患者在t-PA 輸注期間改善了氧合功能，但這種效果在t-PA 治療停止后消失［55］。由于t-PA 可能增加嚴重出血風險，這使人們考慮采用霧化療法以增加其局部濃度，并減少其對全身凝血的效應。在嚴重的ARDS 患者中，使用霧化纖溶療法可以改善患者氧合作用和通氣參數(shù)［56］，因此該療法可能是治療COVID-19的一種可行方案。

4.4 抗血小板治療 研究表明，抗血小板治療可以降低膿毒癥的死亡率，但數(shù)據(jù)大多來自藥物阿司匹林［57］。在一種細菌性敗血癥的小鼠模型中，阿司匹林可預防DIC 和中性粒細胞介導的微血管血栓形成［58］。不過，阿司匹林在治療 COVID-19 中的作用尚待研究。目前有研究正在評估具有抗血小板作用的藥物在降低COVID-19 嚴重性方面的潛在作用，包括雙嘧達莫和萘莫司他。有研究報道，雙嘧達莫可在體外抑制新冠病毒的復制，臨床數(shù)據(jù)也表明雙嘧達莫可改善COVID-19 重型患者的臨床過程［59］。萘莫司他是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，用于治療DIC 和胰腺炎，研究顯示萘莫司他具有阻斷MERS 冠狀病毒和新冠病毒在體外感染肺細胞的能力［60］，其用于治療COVID-19的作用正在評估［61-62］。

4.5 中醫(yī)活血化瘀治療 國家衛(wèi)健委COVID-19 診療方案（試行第五至七版）推薦應用血必清注射液用于COVID-19 重型和危重型的臨床治療［63］。血必清注射液是以古方血府逐瘀湯為基礎精煉出的靜脈制劑，有效成分包括紅花黃素A、阿魏酸、丹參素、芍藥苷、原兒茶醛、川芎嗪等，具有活血化瘀、疏通經絡、清熱解毒等功效［63-64］。血必凈注射液可以從內源或（和）外源性凝血途徑、促纖溶系統(tǒng)等方面有效糾正凝血系統(tǒng)紊亂，降低D-二聚體水平［63-64］。另一方面，血必清還可抑制內源性IL-6 的釋放，保護微血管內皮細胞，抑制免疫血栓形成，從而改善凝血功能異常［63］。此外，諸多中醫(yī)專家認為活血化瘀療法是SARS 的重要治法，并強調SARS 早期使用活血化瘀藥干預的積極作用［65］。在臨床實踐中，SARS 患者在接受了含丹參酚酸B 的復方丹參注射液或以單味丹參為主藥的方劑治療后，胸悶、憋氣癥狀有所緩解［65］。因此，在SARS中靈活運用活血化瘀的用藥思想，可以為COVID-19診療方案提供新的方向。

5 結語

新冠病毒的出現(xiàn)以及隨之而來的全球大流行，給醫(yī)療衛(wèi)生和經濟帶來了前所未有的挑戰(zhàn)。血栓前狀態(tài)是COVID-19 重癥患者的關鍵臨床特征，它與動脈、靜脈和微血管血栓的高發(fā)生率，以及不良的臨床預后有關。數(shù)據(jù)表明，新冠病毒可能通過誘導免疫血栓形成增加患者血栓并發(fā)癥的發(fā)病風險。免疫血栓形成理論認為：新冠病毒感染內皮細胞，誘導炎癥反應，激活機體固有免疫途徑，導致血小板和白細胞活化、NETs 生成、補體系統(tǒng)活化等結果，這些因素促使了COVID-19 重癥患者的血栓前狀態(tài)，并可能導致嚴重的血栓并發(fā)癥。本文通過分析炎癥、免疫和血栓形成之間的相互關系，旨在提高人們對COVID-19患者血栓并發(fā)癥的認識和了解，有助于更早地診斷和發(fā)現(xiàn)血栓事件，以便及早采用抗血栓治療（中醫(yī)活血化瘀治療）而改善COVID-19患者的預后。