支氣管肺泡灌洗液腫瘤標志物檢測用于肺癌早期診斷的研究進展

王 莉谷秀娟

(1.延安大學醫(yī)學院，陜西 延安 716000；2.延安大學附屬醫(yī)院東關分院檢驗科，陜西 延安 716000)

近年來，肺癌的發(fā)病率和病死率呈迅速增長趨勢[1]，大多數患者確診的時候一般都是晚期，預后差，五年生存率為10%~20%[2]，給社會和家庭帶來巨大的經濟和社會負擔。早診斷、早治療可明顯改變肺癌患者的生存率。肺癌的確診主要依靠組織病理學及病理細胞學檢查，但組織標本的獲取存在一定的難度[3]，特別是對起源于支氣管遠端的肺癌，想要獲取其病理組織更難。檢測肺癌腫瘤標志物是實現肺癌早期診斷的重要途經，利用血液、尿液和唾液等體液進行生物標志物檢測已成為一種重要的癌癥診斷方法[4]。支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)是通過電子支氣管鏡向支氣管肺泡內反復以無菌0.9%氯化鈉注射液灌洗收集的肺表面襯液，生化成分主要由磷脂和蛋白質組成，核酸(DNA、miRNA、mRNA)較少，這些成分的變化反映了機體的病理生理狀態(tài)，可能含有更高濃度的肺癌分泌蛋白，因此被視為腫瘤標志物的豐富來源[5]。由于腫瘤細胞合成和分泌的物質首先釋放到病灶處的支氣管肺泡內，所以通過檢測BALF中特異性的腫瘤標志物對于肺癌的早期診斷、疾病進展監(jiān)測、預后等有重要意義。

1 常見的支氣管肺泡灌洗液腫瘤標志物

1.1 癌胚抗原

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是Gold等[6]在1965年從結腸癌中提取的一種細胞膜表面的酸性糖蛋白，分子量為(180~200)×103，BALF中正常范圍是0~5 ng/mL，通常在胎兒發(fā)育過程中產生，在出生前即停止分泌。CEA可介導細胞與細胞外基質間的黏附反應，在腫瘤的發(fā)生和侵襲轉移過程中起關鍵作用。作為一種具有人類胚胎抗原決定簇的多糖蛋白復合物，CEA常被用于檢測結直腸癌，但是隨著濃度的升高，也可以預測小細胞肺癌和非小細胞肺癌[7]，也是最早在臨床上應用于診斷肺癌的標志物。肺癌患者BALF中的CEA水平明顯高于良性病變者，103例肺癌及非肺癌患者支氣管肺泡灌洗液、胸水、血清的CEA測定結果呈支氣管肺泡灌洗液CEA>胸水CEA>血清CEA的趨勢，提示用支氣管肺泡灌洗液檢測CEA濃度比通常用胸水及血清測定CEA濃度鑒別診斷肺部疾病更為敏感[8]。有報道稱肺癌患者BALF中CEA水平比血清中高出30多倍，這可能由于循環(huán)中的CEA經肝臟降解，導致其在BALF中濃度聚集[9]。事實上對于無法經支氣管鏡確診的腫瘤患者，測定BALF中的CEA是一種有效的輔助診斷方法[10]。而肺腺癌細胞能直接產生CEA的研究結果，進一步突出了CEA是腺癌的特異性腫瘤標志物[11]。

不同病理類型腫瘤中的CEA水平會有不同，表達水平由高到低依次是:腺癌>小細胞癌>鱗癌。丁娜等[12]檢測了3種不同病理分型肺癌BALF中CEA的濃度，結果顯示腺癌中的濃度遠高于小細胞肺癌和鱗癌中的濃度，提示可將CEA作為肺腺癌病情進展及判定臨床分期的指標。丁慧強[13]的研究認為，肺癌組支氣管肺泡液中CEA的診斷臨界點為7.9 ng/mL，此時的敏感性和特異性能達到90%和86.7%。但是需要注意的是，CEA在多種腫瘤組織中如宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌等均會出現異常升高，所以其對肺癌診斷的特異度較低，實際應用中需和其他指標聯合檢測。

1.2 糖類抗原125

糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)也被稱為粘蛋白16或MUC16，在人中由MUC16基因編碼，最早是Bast等[14]通過漿液上皮性卵巢癌細胞系OVCA433生產出單克隆抗體OC125，該抗體所特異識別的抗原即是CA125。CA125是在胚胎發(fā)育期由體腔上皮細胞產生的一類高分子糖蛋白抗原，與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，屬于混合型腫瘤標志物。CA125在細胞內合成并儲存，因被細胞間連接和基底膜阻擋而無法入血，故正常人血清中濃度很低，健康人群的含量≤35 U/mL，當組織發(fā)生病變時釋放入血而升高[15]。

由于CA125在體液中的半衰期僅為4.8 d左右，且代謝快。因此，其水平的變化可以很好的反應腫瘤組織的近期狀態(tài)。Li等[16]研究表明肺癌組織中有CA125的表達，以肺腺癌中最高，其表達水平與腫瘤的分化程度密切相關。Cedrés等[17]研究發(fā)現，在277例Ⅲ~Ⅳ期NSCLC患者中有46.6%的患者血清CA-125水平升高，且其無進展生存期(PFS)更差(4.6月vs7.5月，P<0.05；8.7月vs14.0月，P<0.05)，多因素分析也顯示CA125水平升高與預后差有明確相關性。但是對于女性肺癌患者而言，在評估CA125的臨床意義時要考慮其激素狀況，因為正常的卵巢活動會影響CA125的水平。此外，子宮內膜異位癥和妊娠也會提升CA125的水平。Ghosh等[18]研究認為，支氣管肺泡灌洗液中CA125的診斷臨界點為36.5 U/mL，此時的靈敏度為89.13%，特異度為75%，陽性預測值為80.39%，陰性預測值為85.71%。

1.3 神經元特異性烯醇化酶

神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)是一種糖酵解烯醇酶，分子量為78×103，催化2-磷酸甘油酸裂解生成烯醇式丙酮酸，由α、β、γ三種亞基以二聚體的形式組成αα、ββ、γγ、αγ、βγ五種形式的同工酶，是糖酵解途徑中甘油分解的最后環(huán)節(jié)的酶，優(yōu)先表達于神經和內分泌組織。因此，NSE可以作為神經元發(fā)育成熟的標志，其含量能反映神經元分化的程度[19]。小細胞肺癌屬于神經內分泌起源腫瘤，具有神經內分泌細胞和APUD(amine precursor uptake and decarboxylation)細胞的特征。因此NSE是小細胞肺癌最敏感、最特異的腫瘤標志物[20]，其對小細胞肺癌的診斷特異性為40%~70%[21]，對于明確小細胞肺癌的臨床分期、鑒別診斷和疾病進展有指導作用。

Carney等[22]首次報道了94例新診斷的和未經治療的SCLC患者血清NSE水平會升高，且NSE水平與化療的臨床反應之間有很好的相關性。NSE水平高的小細胞肺癌患者術后的生存率低，復發(fā)風險也較高。研究表明，NSE是預測小細胞肺癌患者預后的最有效因子，其敏感性優(yōu)于腫瘤分期、患者臨床表現、年齡、性別、CEA和堿性磷酸酶[23]。有研究表明NSE的診斷閾值為2.06 ng/mL，其敏感性和特異性分別為72.0%和69.2%，提示NSE可以作為肺癌惡性程度的指示指標[24]。

1.4 鱗狀上皮細胞癌抗原

鱗狀上皮細胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag)是一種細胞骨架蛋白，分子量為48×103，由1170個核苷酸組成，編碼390個氨基酸，屬于絲氨酸蛋白酶抑制物家族。BALF中正常范圍是0.8 ng/mL，由于SCC-Ag最初是在子宮癌中發(fā)現的，所以早期的研究主要集中于子宮鱗狀細胞癌。

SCC作為鱗癌細胞的一種特殊蛋白質，在肺癌患者中SCC-Ag的陽性率依次為鱗癌、腺癌、SCLC，并且假陽性率低[25]。羅玲等[26]的檢測結果顯示肺癌組的SCC-Ag水平明顯高于肺部良性病變組，在肺癌Ⅲ~Ⅳ均高于Ⅰ~Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學意義，提示SCC-Ag有助于肺癌病理類型的判斷，并能間接反映患者的病情進展情況。王磊[27]的研究表明，BALF中SCC-Ag水平高于血清，提示BALF中SCCAg對診斷肺鱗狀細胞癌參考價值優(yōu)于血清，且隨著BALF中SCC-Ag的水平升高，臨床分期越高。有研究顯示肺癌組BALF中SCC的總陽性率可達到95.8%，敏感性為95.8%，特異性為54.3%[28]。

1.5 細胞角蛋白19片段

細胞角蛋白19(cytokeratin，CK19)為主要表達于單層上皮細胞的I型角蛋白，細胞角蛋白19片段(cytokeratin-19-fragment antigen 21-1，CYFRA21-1)是水溶性CK19片段，廣泛分布于正常組織表面如復層上皮和鱗狀上皮。CK19是一種結構蛋白，屬于酸性多肽之一，腫瘤細胞凋亡引起蛋白酶大量激活，導致角蛋白19的某些片段降解并被識別，該片段即為可溶性細胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)[29]。CYFRA21-1的分子量為(40~68)×103，主要存在于肺癌、食道癌等上皮起源的腫瘤細胞的胞漿中，其診斷肺癌的靈敏度隨著疾病的不同發(fā)展階段而不同，最高可達到69.6%[30]。

BALF中CYFRA21-1的正常范圍是0~2.08 ng/mL，Pujol等[31]首次在165名肺癌患者中檢測了CYFRA21-1的水平，發(fā)現靈敏度和特異度分別是52%和87%，敏感性在鱗狀細胞癌中最高，在SCLC中最低。CYFRA21-1的水平變化能反映非小細胞肺癌的病情波動，當肺部存在不清晰圓形焦點，而CYFRA21-1水平又大于30 ng/mL時，提示很可能是原發(fā)性支氣管肺癌[32]。楊國彪等[33]人的檢測結果表明肺癌組患者血清和BLAF中CYFRA21-1水平均高于肺良性病變組(P<0.05)，表明CYFRA21-1水平的變化與肺癌的發(fā)生發(fā)展有一定的關系。也有研究稱CYFRA21-1在鱗狀細胞癌患者中的表達高于腺癌和SCLC患者，提示CYFRA21-1可以作為診斷鱗狀細胞癌的有效標志物[16]。鄔勇堅等[28]測定BALF中CYFRA21-1陽性率為83.3%，敏感性為38.3%，特異度為51.4%。

1.6 胃泌素釋放肽前體

胃泌素釋放肽(pro-gastrin-releasing peptide，GRP)最初是從豬胃黏膜中分離的，屬于胃腸激素，廣泛分布于哺乳動物的神經系統(tǒng)、胃腸道和呼吸道。GRP是參與腫瘤細胞生長的重要因子，其通過腫瘤細胞的自分泌或細胞間的旁分泌發(fā)揮作用[34]。但GRP的半衰期很短，只有2 min，不穩(wěn)定，難以檢測。而其前體pro-GRP的水平比GRP高400倍，因此通常檢測GRP的前體pro-GRP來反映其水平。pro-GRP在肺部良性病變和上皮來源的腫瘤中呈低水平表達，在BALF中的正常范圍是28.30~74.40 pg/mL，但在SCLC細胞系和SCLC組織中均高表達[35]，有助于SCLC的診斷。王艷海等[36]研究表明pro-GRP對SCLC的靈敏度和特異度可達到77.2%和91.1%，優(yōu)于NSE和CYFRA21-1，但是pro-GRP的表達水平與腫瘤的臨床分期無明顯相關性。

2 BALF腫瘤標志物的臨床應用

盡管已經發(fā)現了很多與肺癌密切相關的標志物，但是還沒有一種標志物是肺癌的特異性抗原。由于肺癌的多態(tài)性及復雜性，腫瘤細胞組織來源不同，各項腫瘤標志物單獨檢測具有一定的局限性，單一指標檢測往往難有理想的靈敏度和特異度。高濃度標志物往往預示著患者很可能是肺癌，而不是肺部良性病變，容易導致誤診或漏診的發(fā)生，因此在實際臨床應用中多開展聯合檢測。

一種是多項指標聯合檢測。有研究者回顧分析了655例肺癌患者和237例肺良性疾病患者CEA和CYFRA21-1濃度對區(qū)分原發(fā)性肺癌和肺良性疾病的診斷價值，結果顯示單用兩個指標診斷肺癌的敏感性和特異性分別是69%和68%、43%和89%，而兩個指標聯合診斷的是95%和33%，特異性大大提高[37]。CEA、CA199與CA125聯合檢測肺癌的靈敏度與特異度能達到72%和83.5%，均高于單一檢測，可使早期肺癌檢出率得到明顯提高[38]。

另一種是將BALF和血清兩種組織聯合檢測。Cremades等[39]將BALF和血清CYFRA21-1水平聯合檢測可使肺癌診斷的靈敏度由36%提高到69%。鄧麗平等[40]研究發(fā)現，單一檢測BLAF或血清中的CEA、CYFRA21-1、NSE對肺癌的特異性尚可，但敏感性均偏低，假陰性較多，易造成漏診，若聯合BALF和血清可使診斷肺癌的敏感性和準確率提高，優(yōu)于單獨進行BALF或血清的腫瘤標志物檢測。

3 展望

支氣管肺泡灌洗術(bronchoalveolar Lavage，BAL)作為依托纖維支氣管鏡而發(fā)展起來的新技術，是診斷間質性肺疾病的基礎技術，也是臨床上被逐漸廣泛應用的新方法。通過BAL可取得BALF，在某種程度上被喻為“液相活檢”[41]。肺癌的早發(fā)現、早診斷、早治療是改善肺癌患者預后、延緩病死率的有效手段[42]。腫瘤標志物是癌細胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移過程中分泌的一些活性物質，存在于血液、痰液等體液中[43]。腫瘤標志物在疾病的篩查、診斷、監(jiān)測進展、復發(fā)和預后方面都有重要作用。有研究認為，從腫瘤所在位置獲取檢測腫瘤標志物的標本優(yōu)于血液標本，肺癌作為生長在支氣管粘膜或肺泡組織上的惡性腫瘤，脫落的腫瘤細胞及其代謝產物可直接進入肺泡腔內，對BALF中的腫瘤標志物進行檢測較其它標本更有特異性。在腫瘤早期血清中標志物含量較低，不易檢測，而BALF是取自病變部位的支氣管肺泡內，濃度較高，能提前預警異常指標，更有助于肺癌的早期診斷，并且對患者機體的損傷也較小。因此，通過對電子纖維支氣管鏡獲取的肺泡灌洗液進行腫瘤標志物的檢測，有望成為臨床上肺癌早期診斷的重要途經。同時，檢測BALF中的腫瘤標志物水平對預測腫瘤患者有無轉移、肺部疾病的良惡性鑒別也具有較高的臨床價值[44]。但也有研究指出通過檢測BALF中腫瘤標志物來進行肺癌診斷的特異或敏感性很低，無法區(qū)分良、惡性病變[45]。BALF中腫瘤標志物濃度會受到腫瘤細胞的大小和數目、腫瘤細胞自身產生腫瘤標志物的速度、腫瘤標志物在體內降解和排泄的速度及體液稀釋等因素影響。因此，如何規(guī)范支氣管肺泡灌洗液的取材和處理流程，提升支氣管肺泡灌洗液腫瘤標志物檢測的診斷價值，同時，在不同組合檢測方案中，如何確保既能提高靈敏度又能提升特異度，是今后一個重要的研究方向。