骨髓微環(huán)境影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞促進(jìn)血液惡性腫瘤發(fā)展的研究進(jìn)展

安田麗 李亮亮 趙 麗 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院血液科蘭州730000

骨髓微環(huán)境由多種造血細(xì)胞、非造血細(xì)胞、胞外基質(zhì)和其他信號(hào)蛋白組成,可為造血干細(xì)胞提供與分化、凋亡等刺激信號(hào)隔離的屏障,還可阻止干細(xì)胞過度增殖,防止腫瘤發(fā)生。骨髓微環(huán)境一旦發(fā)生紊亂,對(duì)血液惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展將產(chǎn)生重要影響。研究表明,白血病患者骨髓微環(huán)境免疫應(yīng)答有助于白血病干細(xì)胞擴(kuò)增,促進(jìn)白血病發(fā)展[1]。血液系統(tǒng)腫瘤患者骨髓微環(huán)境中聚集較多的免疫抑制細(xì)胞,其中以CD4+CD25+CD127low/-表型為特征的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)具有獨(dú)特的免疫抑制作用,通過抑制微環(huán)境引發(fā)腫瘤免疫逃逸,與血液腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。急性白血病、多發(fā)性骨髓瘤等血液腫瘤患者骨髓中Tregs水平增高,且與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[2-6]。抑制Tregs是腫瘤免疫療法的方向之一,因此多種化療藥物、疫苗、免疫檢查點(diǎn)抑制劑等應(yīng)用與臨床,但仍具有一定局限性。研究發(fā)現(xiàn),血液惡性腫瘤,骨髓微環(huán)境中一些因素可增加Tregs免疫抑制功能,阻礙靶向Tregs的免疫治療,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。據(jù)報(bào)道,轉(zhuǎn)錄因子(Helios)、衰老基因(miRNA、SENEX)、長非編碼(lnc)RNA胰島素受體前體長非編碼RNA胰島素受體前體(long noncoding RNA lnc-insulin receptor precursor,INSR)、T細(xì)胞共刺激分子配體(ICOSL)、增殖誘導(dǎo)配體(APRIL)、IL-33、IL-35、TGF-β、IL-2、IL-10、VEGF、IL-17、間充質(zhì)干細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、趨化因子CCL22、CXCL12等可促進(jìn)Tregs的免疫抑制功能,從誘導(dǎo)Tregs分化、擴(kuò)增、存活及遷移等方面影響Tregs功能,通過抑制或阻斷以上促進(jìn)因素可逆轉(zhuǎn)Tregs的免疫抑制功能。因此,闡明影響Tregs的多種因素及其作用機(jī)制可為血液惡性腫瘤以Tregs為靶標(biāo)的免疫療法提供新思路。

1 基因?qū)regs的影響

1.1 lnc-INSR通過增強(qiáng)Tregs分化促進(jìn)免疫抑制lncRNA于大部分人類基因組轉(zhuǎn)錄,并通過轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄中或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用在人類癌癥和先天性疾病的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。WANG等[2]采用高通量轉(zhuǎn)錄組篩選提取兒童急性T淋巴細(xì)胞白血病患者骨髓中CD4+T細(xì)胞,并分析lncRNA在與白血病相關(guān)免疫微環(huán)境中的潛在功能和機(jī)制,證明了與免疫抑制相關(guān)的lnc-INSR在急性淋巴細(xì)胞白血病患者中增加,同時(shí)定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的lnc-INSR促進(jìn)Tregs分布并降低細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞水平導(dǎo)致腫瘤生長。

通過與INSR直接結(jié)合,lnc-INSR阻斷了INSR泛素化位點(diǎn),導(dǎo)致INSR和PI3K/AKT信號(hào)通路異常激活從而誘導(dǎo)抑制性免疫微環(huán)境,在白血病微環(huán)境中誘導(dǎo)腫病侵襲。PI3K相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑缺失損傷Tregs活化,抑制PI3K/AKT信號(hào)可抑制Tregs產(chǎn)生。在T細(xì)胞調(diào)節(jié)期間,T細(xì)胞受體信號(hào)通過PI3K/AKT控制Foxp3表達(dá),表明該信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)可調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞中Foxp3表達(dá)[8]。進(jìn)一步表明lnc-INSR通過增強(qiáng)Tregs分化促進(jìn)免疫抑制。

白血病患者免疫功能存在缺陷,原因?yàn)榭扇苄砸蜃雍兔庖邫z測(cè)點(diǎn)分子激活免疫抑制通路,Tregs抑制抗腫瘤免疫細(xì)胞功能,從而促進(jìn)癌癥進(jìn)展。因此lncRNA可能成為與兒童T-ALL相關(guān)的免疫微環(huán)境有效治療靶標(biāo)。

1.2 miRNA調(diào)節(jié)Tregs增殖 miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性具有調(diào)控功能的非編碼RNA,由20～25個(gè)核苷酸組成,主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)mRNA表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),胸腺細(xì)胞中miRNA缺乏導(dǎo)致胸腺、脾、淋巴結(jié)中Tregs數(shù)減少[9]。Dicer、Drosha是miRNA產(chǎn)生過程中重要的酶,通過建立Tregs Dicer或Drosha缺失小鼠模型,發(fā)現(xiàn)小鼠均出現(xiàn)致死性早發(fā)性淋巴細(xì)胞增多癥,表明無論是去除Dicer還是Drosha,Foxp3表達(dá)均受到抑制。Tregs所釋放的抑制分子、誘導(dǎo)基因、顆粒蛋白酶B(GzmB)分泌減少,導(dǎo)致Tregs抑制功能明顯下降。因此miRNA是影響Tregs發(fā)揮正常生理功能的重要因素[10]。有多種miRNA被提出與Tregs增殖、生長及功能有關(guān),其中在Tregs中高表達(dá)的有miR-155、miR-146a、miR-10a、miR-95等,低表達(dá)的有miR-20、miR-19a/b、miR-106b、miR-24、miR-145等,這些miRNA對(duì)Tregs的影響及調(diào)節(jié)機(jī)制仍處于探索階段。在血液腫瘤及其他實(shí)體腫瘤中,深入研究miRNA對(duì)Tregs的免疫抑制功能對(duì)免疫治療開發(fā)具有重要作用。

1.3 SENEX保護(hù)Tregs發(fā)揮免疫抑制效應(yīng) 衰老基因SENEX位于4號(hào)染色體長臂(4q31.23),全長2 901 bp,編碼含663個(gè)氨基酸殘基、分子量約75 kD的蛋白,SENEX編碼的蛋白在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要作用,主要調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、遷移、黏附、吞噬和細(xì)胞生長發(fā)育等,并通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄控制細(xì)胞生長周期、衰老和凋亡[11]。pRb和p53通路是其最重要的2個(gè)中央控制節(jié)點(diǎn),決定細(xì)胞增殖還是活化衰老和凋亡。衰老基因SENEX誘導(dǎo)的應(yīng)力性衰老(stress induced premature senescence,SIPS)具有抗凋亡和免疫抑制效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),SENEX基因可能通過活化p16INK4A/Rb途徑誘導(dǎo)SIPS保護(hù)Tregs[12-13]。而Tregs又是誘導(dǎo)AML細(xì)胞逃逸機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因素[14]；采用RT-PCR檢測(cè)AML不同階段SENEX基因的表達(dá),結(jié)果顯示,在初診AML患者骨髓中SENEX基因表達(dá)顯著增高,完全緩解后表達(dá)降低,復(fù)發(fā)時(shí)再度升高,提示SENEX基因保護(hù)Tregs與AML發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。推測(cè)衰老基因SENEX是促進(jìn)AML免疫逃逸的機(jī)制之一,但SENEX信號(hào)通路在AML中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2 細(xì)胞因子對(duì)Tregs的影響

2.1 ICOSL的表達(dá)直接誘導(dǎo)Tregs擴(kuò)增 Tregs依賴于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞受體、共刺激分子和細(xì)胞因子的刺激發(fā)揮免疫抑制作用。誘導(dǎo)型T細(xì)胞共刺激分子(inducible T-cell costimulator,ICOS)為CD28共刺激分子家族 成員,與ICOS配體(inducible T-cell costimulator ligand,ICOSL)結(jié)合維持持久的免疫反應(yīng)。腫瘤組織中的Tregs在其表面表達(dá)ICOS,ICOS/ICOSL軸在Tregs功能發(fā)揮中起關(guān)鍵作用,并通過激活磷酸肌醇3-激酶/AKT途徑促進(jìn)Tregs分化[15]。ICOS共刺激CD4+T細(xì)胞有利于促進(jìn)Th2細(xì)胞因子,如IL-4、IL-10和IL-13[16]。

HAN等[3]發(fā)現(xiàn)AML患者骨髓中存在高水平的ICOS+Tregs,在腫瘤微環(huán)境中具有高度活性。AML細(xì)胞上的ICOSL Tregs增殖并刺激其產(chǎn)生可溶性細(xì)胞因子,如通過IL-10損傷抗原遞呈細(xì)胞而間接抑制T細(xì)胞應(yīng)答[17]。通過與過表達(dá)ICOSL的AML細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+ICOS+T細(xì)胞比CD4+CD25+ICOS-T細(xì)胞具有更強(qiáng)的分泌IL-10能力,進(jìn)一步促進(jìn)AML細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn),ICOSL高表達(dá)患者比ICOSL低表達(dá)的AML患者無病生存期短。采用抗ICOSL抗體阻斷ICOS信號(hào)傳導(dǎo),損害了Tregs的產(chǎn)生并且延遲了注射C1498細(xì)胞的AML小鼠疾病進(jìn)展。采用阻斷性抗ICOSL mAb阻斷ICOS信號(hào)傳導(dǎo)可影響Tregs和腫瘤細(xì)胞的相互作用并延緩疾病進(jìn)展[3]。

體內(nèi)阻斷ICOSL可減少腫瘤環(huán)境中的Tregs,需要仔細(xì)分析ICOS共刺激阻斷對(duì)Tregs與效應(yīng)T細(xì)胞的作用。AML細(xì)胞的ICOSL表達(dá)可能直接驅(qū)動(dòng)Tregs擴(kuò)增作為免疫逃避的機(jī)制,且ICOS+Tregs是AML患者更好的預(yù)后預(yù)測(cè)因子。抑制ICOS表達(dá)或阻斷ICOS共刺激信號(hào)傳導(dǎo)可能具有治療前景,可能成為AML的特異性靶向治療策略。

2.2 APRIL通過TACI刺激Tregs增殖和存活 增殖誘導(dǎo)配體(A proliferation-inducing ligand,APRIL)是惡性漿細(xì)胞生長和存活的關(guān)鍵因子,是B細(xì)胞成熟抗原(B cell maturation antigen,BCMA)和穿膜蛋白活化物(transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor,TACI)的天然高親和力配體[18-19]。APRIL/BCMA信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤(MM)進(jìn)展和誘導(dǎo)MM細(xì)胞免疫抑制因子生成[20]。最近通過新型免疫療法靶向抑制BCMA已在復(fù)發(fā)和難治性MM治療中取得重要進(jìn)展。

TAI等[5]通過上調(diào)Tregs標(biāo)記(Foxp3、CTLA-4)證實(shí)了APRIL受體TACI在Tregs中的表達(dá)顯著高于同一患者的常規(guī)T細(xì)胞(Tcons)。從47例MM患者的外周血或骨髓抽吸物中新鮮分離的T細(xì)胞中,CD4+(和CD8+)CD25highT細(xì)胞的TACI表達(dá)比CD4+(和CD8+)CD25lowT細(xì)胞高3～5倍。在CD4+(和CD8+)CD25lowT細(xì)胞上也觀察到比CD4+(和CD8+)CD25-Tcons表達(dá)更高的TACI。APRIL缺陷小鼠的MM細(xì)胞生長明顯減少,表明APRIL可加快MM進(jìn)展。破骨細(xì)胞是MM骨髓中APRIL和PD-L1產(chǎn)生的關(guān)鍵來源,在多發(fā)性骨髓瘤中,與TACI結(jié)合的APRIL信號(hào)通過Foxp3、IL-10、TGF-β、PD-L1、CD15等免疫抑制分子顯著促進(jìn)Tregs和調(diào)節(jié)B細(xì)胞(regulatory B cells,Bregs)增殖、存活和免疫抑制功能,從而增強(qiáng)Tregs對(duì)Tcons的抑制作用,使Tregs成為介導(dǎo)破骨細(xì)胞抑制免疫的關(guān)鍵細(xì)胞[6]。相反,單獨(dú)采用拮抗性抗APRIL mAb或與PD1/PD-L1檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)用阻斷APRIL-TACI軸可下調(diào)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞表達(dá),減輕骨髓微環(huán)境抑制。

采用抗APRIL(單獨(dú)或與抑制劑PD1/PD-L1)靶向APRIL/TACI軸進(jìn)一步調(diào)節(jié)Tregs和Bregs可改善免疫抑制,恢復(fù)免疫,并改善MM患者預(yù)后,提供了靶向APRIL以克服免疫抑制、改善患者治療結(jié)果的新方法。

2.3 IL-33誘導(dǎo)Tregs分化或擴(kuò)增 IL-33調(diào)節(jié)各種免疫細(xì)胞群,不僅誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生2型細(xì)胞因子,也可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、Th1、NK,包括某些病理生理?xiàng)l件下的NK T和CD8 T細(xì)胞、髓源抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)和Tregs。

MDSCs是異質(zhì)免疫細(xì)胞群,包括骨髓祖細(xì)胞和未成熟的骨髓細(xì)胞,具有強(qiáng)大的免疫抑制作用,未成熟的骨髓細(xì)胞在骨髓中產(chǎn)生并迅速分化成巨噬細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞或粒細(xì)胞。而病理環(huán)境阻止未成熟骨髓的正常分化,促進(jìn)其積累和誘導(dǎo)其抑制功能。小鼠MDSCs的特征在于共表達(dá)CD11b和GR1,分為2個(gè)亞組:粒細(xì)胞MDSCs(G-MDSCs)具有CD11b+Ly6G+Ly6C～表型和單核細(xì)胞MDSC(MMDSCs)具有CD11b+Ly6G Ly6Chigh表型通過不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制T細(xì)胞增殖和活化[21]。

HUI等[21]將IL-33處理或未處理的MDSCs與不同比例(1∶2、1∶4和1∶8)且同時(shí)存在抗CD3/CD28抗體的CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)3天,通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞,以缺乏MDSCs但含有抗CD3/CD28抗體培養(yǎng)的T細(xì)胞作為陽性對(duì)照。與對(duì)照組相比,IL-33處理的MDSCs在所有實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)較少的Tregs增長,表明IL-33降低MDSCs的抑制T細(xì)胞能力,誘導(dǎo)Tregs分化或擴(kuò)增。靶向IL-33有望降低腫瘤微環(huán)境中Tregs的抑制功能。

2.4 IL-35促進(jìn)Treg細(xì)胞免疫抑制作用 Tregs誘導(dǎo)AML細(xì)胞免疫逃逸的機(jī)制較為復(fù)雜,除已知的細(xì)胞因子IL-10和TGF-β外,IL-35與Tregs關(guān)系密切。IL-35是抑制性細(xì)胞因子,主要由活化的Tregs分泌。此外胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也可產(chǎn)生IL-35。IL-35可誘導(dǎo)初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂忻庖咭种谱饔玫恼{(diào)節(jié)性T細(xì)胞(iTr35),形成“傳染性耐受”,將抑制活性最大化。由于IL-35的免疫抑制作用,可以認(rèn)為其能夠促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。研究表明,IL-35在多種實(shí)體腫瘤(如胰腺癌、大腸癌、非小細(xì)胞肺癌)和血液系統(tǒng)惡性腫瘤(如急性髓系白血病)患者的腫瘤組織或外周血中表達(dá)水平增高[22]。

通過檢測(cè)AML不同階段IL-35蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)在初診AML患者骨髓中IL-35蛋白的表達(dá)顯著增高,完全緩解后表達(dá)降低,復(fù)發(fā)時(shí)再度升高,提示IL-35與AML發(fā)展密切相關(guān)。再次對(duì)FCM分選的患者骨髓中AML原始細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和干預(yù),通過對(duì)IL-35刺激的AML細(xì)胞增殖情況進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)IL-35顯著上調(diào)AML細(xì)胞中IL-35R表達(dá),同時(shí)顯著促進(jìn)AML細(xì)胞增殖,而凋亡實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)IL-35預(yù)刺激的AML細(xì)胞可顯著抵抗阿糖胞苷(Ara-C)誘導(dǎo)的凋亡。表明IL-35可通過與其受體結(jié)合作用于AML細(xì)胞,并顯著促進(jìn)AML細(xì)胞增殖,抑制AML細(xì)胞凋亡[23]。因此IL-35有望成為影響Tregs的重要靶點(diǎn)。進(jìn)一步研究IL-35與Tregs關(guān)系對(duì)血液腫瘤具有重要意義,有望成為靶向治療新方法。

2.5 TGF-β、IL-2促進(jìn)Tregs分化 Tregs分化依賴于特定細(xì)胞因子刺激,其中對(duì)細(xì)胞因子TGF-β和IL-2的研究最為透徹。TGF-β與Tregs分化和功能密切相關(guān),TGF-β通過其受體復(fù)合物將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至果蠅抗生物皮膚生長因子蛋白2(srosophila mothers against deeapentaplegie protein2,Smad2)和Smad3,Smad2和Smad3磷酸化后結(jié)合Smad4,并共同移位入核,結(jié)合于DNA上的Smad結(jié)合位點(diǎn)(啟動(dòng)子區(qū)),調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄[24]。此外,TGF-β也通過表觀遺傳學(xué)方式促進(jìn)Foxp3基因調(diào)控區(qū)去甲基化,使Foxp3更易于表達(dá)。LI等[25]研究發(fā)現(xiàn),甲硫氨酸腦啡肽(methionine enkephalin,MENK)通過影響TGFβ生成有效抑制Foxp3表達(dá),最終抑制初始CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+Tregs。此外Tregs可產(chǎn)生高水平TGF-β,削弱CD8+T細(xì)胞和NK對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。MM患者體內(nèi)的樹突狀細(xì)胞功能異常,在體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生多種高水平細(xì)胞因子,如VEGF、IL-10等,與TGF-β和Tregs存在一定聯(lián)系,經(jīng)相互協(xié)調(diào)發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)[25]。

IL-2是人體免疫調(diào)節(jié)體系中最重要的淋巴因子,可刺激局部或全身的免疫應(yīng)答,是惡性腫瘤生物免疫治療的常用制劑之一。IL-2也是輔助性T細(xì)胞中Th1細(xì)胞因子之一,主要參與細(xì)胞免疫。Tregs的體內(nèi)平衡主要依賴于IL-2介導(dǎo)的信號(hào)通路。當(dāng)人或動(dòng)物體內(nèi)缺乏IL-2或其受體α鏈/CD25及β鏈/CD122時(shí),Tregs數(shù)減少。nTreg由于本身不分泌IL-2,主要依靠旁分泌IL-2,通過IL-2Rαβγ三聚體發(fā)揮對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 的調(diào)節(jié)功能[26]。敲除小鼠IL-2受體可影響其體內(nèi)Tregs功能,使其數(shù)量減少。IL-2也能通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子5(signal transduction and activator of transcription5,STATS)磷酸化誘導(dǎo)成熟Tregs分化,STAT5持續(xù)激活對(duì)Tregs胸腺分化具有促進(jìn)作用[27-28]。IL-2異常表達(dá)與急性髓性白血病患者的腫瘤細(xì)胞逃避密切相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)AML初診患者外周血IL-2顯著降低,治療后IL-2明顯升高。通過 阻斷IL-2R有效遏制移植排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病,同時(shí)可用于HIV患者、癌癥患者、急性骨髓性淋巴瘤患者治療[29]。IL-2還可為Tregs代謝提供能量,發(fā)揮免疫抑制功能。臨床上通過靶向IL-2/IL-2R相互作用可重新評(píng)估Tregs在人類疾病治療上的戰(zhàn)略意義。

2.6 IL-10介導(dǎo)Tregs參與免疫逃逸 IL-10主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞分泌,故其在淋巴結(jié)及扁桃體相關(guān)部位均有表達(dá)。IL-10具有多效性生物學(xué)活性,對(duì)機(jī)體免疫活性和炎癥過程具有重要調(diào)節(jié)作用。IL-10可抑制T淋巴細(xì)胞激活及其細(xì)胞因子尤其是Th1細(xì)胞因子(如IL-2、IFN-γ)分泌,誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞免疫耐受,抑制抗體依賴性T淋巴細(xì)胞增生。IL-10既是腫瘤生長因子又是免疫抑制因子,不同時(shí)期的研究表明,Tregs可在IL-10介導(dǎo)下阻止樹突狀細(xì)胞成熟及抗原遞呈作用和抑制殺傷性T細(xì)胞增殖與活化,起到免疫耐受與逃逸的作用[30]。通過檢測(cè)骨髓微環(huán)境中化療前后Tregs、IL-10變化,表明在AML患者的骨髓微環(huán)境中累積的Tregs通過IL-10介導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫抑制作用,化療后骨髓微環(huán)境中血漿IL-10水平明顯降低,表明IL-10可能是一種負(fù)面影響因素[30]。

2.7 VEGF趨化Tregs參與免疫逃逸 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種糖基化多肽性分泌因子,為生長因子的家族,包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子。由于mRNA剪切方式不同,可產(chǎn)生VEGF121、VEGF145、VEGF148、VEGF165、VEGF1 83、VEGF189和VEGF206等蛋白形式。VEGF不僅是重要的促血管生長因子,還可影響多種免疫抑制細(xì)胞功能,參與腫瘤免疫逃逸。多項(xiàng)研究證實(shí)VEGF對(duì)Tregs有趨化作用。在小鼠黑色素瘤模型中,神經(jīng)纖毛蛋白-1(NRP1)在Tregs中高表達(dá),腫瘤細(xì)胞自分泌的VEGF作為趨化因子,可引導(dǎo)Tregs浸潤腫瘤組織,從而負(fù)向調(diào)控抗腫瘤免疫效應(yīng)[32]。敲除Tregs表面的NRP1后,腫瘤生長速度下降。研究發(fā)現(xiàn),晚期黑色素瘤患者血清VEGF水平和外周血Tregs擴(kuò)增具有一定相關(guān)性[33]。VEGF過度表達(dá)導(dǎo)致Tregs數(shù)增多,而抑制VEGF與其受體VEGFR結(jié)合可導(dǎo)致Tregs數(shù)減少,從而導(dǎo)致抗腫瘤活性增強(qiáng)。

VEGF與血液系統(tǒng)惡性腫瘤緊密相關(guān),白血病細(xì)胞不僅高表達(dá)VEGF,且不同程度表達(dá)VEGF受體,影響白血病患者預(yù)后。采用ELISA方法檢測(cè)白血病患者血清VEGF,難治/復(fù)發(fā)組與初發(fā)組VEGF水平較緩解組及正常對(duì)照組高(P＜0.05)[33]。白血病患者骨髓血管含量較高,骨髓和血清VEGF水平超過正常標(biāo)準(zhǔn),在新血管幫助下促使病情進(jìn)一步惡化。而Tregs可通過VEGF增強(qiáng)炎癥T細(xì)胞分化功能,抑制樹突狀細(xì)胞成熟,減弱對(duì)腫瘤的殺傷能力而誘導(dǎo)免疫逃逸。

2.8 IL-17協(xié)同Tregs促進(jìn)腫瘤進(jìn)展 Th17細(xì)胞是新的CD4 T細(xì)胞亞群,分泌即IL-17A,還可分泌IL-17F、IL-21、IL-22、IL-26等細(xì)胞因子,研究表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可被重編程為新的亞群即IL-17+FOXP3+T細(xì)胞,是Th17細(xì)胞和Tregs的中間分化階段。Tregs和Th17細(xì)胞來源于初始T細(xì)胞,而IL-17+FOXP3+T細(xì)胞起源于Tregs。研究表明,在抗原遞呈細(xì)胞和適量促炎因子激活下Tregs可轉(zhuǎn)換為Th17細(xì)胞,產(chǎn)生少量IL-17[36]。

IL-17作為一種促炎細(xì)胞因子,主要表達(dá)惡性腫瘤患者的腫瘤原位血液和腹水中。胰腺癌、子宮頸癌、白血病的臨床研究表明,腫瘤組織和外周血中Th17細(xì)胞比例、細(xì)胞因子IL-17在血清中的水平明顯高于正常對(duì)照組；IL-17在腫瘤組織中的浸潤程度與微血管密度呈正相關(guān)[36-37]。IL-17作用于結(jié)腸癌細(xì)胞6 h后,VEGF mRNA含量明顯升高,48 h后,培養(yǎng)上清中VEGF表達(dá)顯著高于對(duì)照組,提示IL-17促進(jìn)癌細(xì)胞合成和分泌促血管生成因子[38]。

研究發(fā)現(xiàn),初診CLL組患者細(xì)胞因子IL-17高于對(duì)照組(P＜0.05)[39]。治療后CLL患者血清中IL-17低于初診CLL組(P＜0.05)。在CLL微環(huán)境中,Tregs及Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子TGF-β及Th17可互相轉(zhuǎn)化或互相抑制,保持機(jī)體對(duì)腫瘤抗原的免疫效應(yīng)和免疫抑制平衡。MM腫瘤微環(huán)境中,機(jī)體受腫瘤某種抗原刺激,導(dǎo)致Tregs顯著升高,同時(shí)打破Tregs/Th17均衡,促使Th17細(xì)胞產(chǎn)生一定水平的IL-17并連同其他相關(guān)細(xì)胞因子,共同促進(jìn)MM患者瘤細(xì)胞惡性增殖,形成惡性循環(huán),使機(jī)體大部分免疫反應(yīng)破壞。深入了解Tregs與TGF-β和IL-17的相互關(guān)系及作用機(jī)制可能為CLL免疫治療提供新的思路。

3 免疫細(xì)胞對(duì)Tregs的影響

3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)介導(dǎo)Tregs擴(kuò)增 MSCs是多能祖細(xì)胞,具有分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的潛力。除再生特性外,MSCs還具有顯著的免疫抑制潛力[40]。MSCs不是天然的免疫抑制劑,必須受到刺激或誘導(dǎo)才能發(fā)揮免疫抑制作用,如低氧和炎癥微環(huán)境[41]。KADLE等[42]研究指出,在低氧張力和炎癥微環(huán)境中誘導(dǎo)MSCs將增強(qiáng)免疫抑制潛力,促進(jìn)干細(xì)胞樣特征維持,典型的MSCs表面標(biāo)志物表達(dá)和增殖,維持MSCs分化潛能。向CD4+/同種異體內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)物中添加自體MSCs使Tregs增殖增加,當(dāng)MSCs在缺氧條件下時(shí),Tregs增殖進(jìn)一步增強(qiáng)。MSCs介導(dǎo)的Tregs擴(kuò)增不需要直接接觸。吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)是缺氧和IFN-γ刺激的免疫抑制的關(guān)鍵介質(zhì),當(dāng)MSCs在缺氧條件下時(shí),IDO(MSCs免疫調(diào)節(jié)的介質(zhì))表達(dá)增加,介導(dǎo)Tregs增殖,并抑制IDO顯著降低Tregs擴(kuò)增。同時(shí)采用炎癥細(xì)胞因子IFNγ和TNF-α誘導(dǎo)也增加MSC免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)的標(biāo)志物表達(dá),IDO表達(dá)增加。表明MSCs在缺氧或炎癥條件下可有效發(fā)揮免疫抑制功能并介導(dǎo)Tregs擴(kuò)增,因此靶向MSCs對(duì)Tregs的作用在臨床應(yīng)用中具有重要意義。

3.2 樹突狀細(xì)胞通過白三烯B4誘導(dǎo)Tregs增殖樹突狀細(xì)胞是引發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因素,可感知外周信息并將其傳輸至幼稚T細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞的激活/成熟可以是微生物模式,也可以由危險(xiǎn)信號(hào)和炎癥等信號(hào)觸發(fā)細(xì)胞因子和介質(zhì)提高其遷移能力,用于抗原呈遞和激活T細(xì)胞。T細(xì)胞分化不僅取決于抗原呈遞本身,且取決于通過激活樹突狀細(xì)胞時(shí)分泌的可溶信號(hào),因此激活期間的微環(huán)境對(duì)于樹突狀細(xì)胞激活T細(xì)胞應(yīng)答至關(guān)重要[43]。

研究發(fā)現(xiàn)白三烯B4是一種有效的刺激物,是在5-脂氧合酶(5-LO)作用下產(chǎn)生的花生四烯酸的代謝產(chǎn)物,作用于G蛋白偶聯(lián)受體,包括高親和力受體BLT-1和低親和力受體BLT-2[44]。研究發(fā)現(xiàn),10 mmol/L白三烯B4刺激樹突狀細(xì)胞增加高親和力受體BLT-1的基因表達(dá),同時(shí)還增加了共刺激分子CD86表達(dá),但不影響CD80和CD40表達(dá)[45]。白三烯B4刺激的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)Tregs增殖并增加共培養(yǎng)的Th2細(xì)胞因子IL-13表達(dá),同時(shí)增加轉(zhuǎn)錄因子基因Gata3和Foxp3(Th2和Tregs)表達(dá)。表明白三烯B4影響樹突狀細(xì)胞并調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的類型。用白三烯B4刺激樹突狀細(xì)胞促進(jìn)Tregs分化或增殖,共培養(yǎng)物中FOXP3+Tregs的增加可能與用白三烯B4刺激樹突狀細(xì)胞后CD86上調(diào)有關(guān)。因此,進(jìn)一步研究抑制白三烯B4合成或在疾病模型中阻斷其受體進(jìn)而調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞可能成為新的治療方法。

4 趨化因子對(duì)Tregs的影響

4.1 CCL22募集Helios+Treg促進(jìn)白血病骨髓微環(huán)境血管生成 Helios是Ikaros家族成員,在淋巴細(xì)胞增殖和分化調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[46]。Helios過表達(dá)增強(qiáng)Tregs對(duì)Th細(xì)胞的免疫抑制功能[47]。LI等[48]通過注入Helios+FOXP3+Tregs至裸鼠體內(nèi),建立了免疫抑制內(nèi)部環(huán)境模型,提高骨髓中白血病細(xì)胞浸潤程度,證實(shí)Helios+Tregs在血管生成中的關(guān)鍵作用,與白血病發(fā)生密切相關(guān)。相反,腫瘤內(nèi)的Helios缺陷型Tregs則有助于抗腫瘤免疫反應(yīng)[49]。

Helios+Treg可通過CCL22和VEGFA-VEGFR2途徑促進(jìn)白血病骨髓微環(huán)境血管生成。LI等Helios在Tregs中高表達(dá)刺激巨噬細(xì)胞,DCs或白血病細(xì)胞分泌CCL22,CCL22通過CCR4募集Tregs至骨髓中,通過VEGFR2激活VEGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)腫瘤部位血管生成,在體外可通過抑制CCR4抑制Tregs遷移[50]。

VEGFR2是血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGFR的主要信號(hào)傳導(dǎo)因子。VEGF通過VEGFR2刺激腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生成、增殖和存活,還可通過增加血管通透性和從骨髓募集血管前體細(xì)胞促進(jìn)血管生成[51]。抑制VEGFA/VEGFR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可減少惡性腫瘤環(huán)境中的Tregs[52]。特異性抗體阻斷VEGFA可減少Tregs數(shù),針對(duì)VEGFRs的藥物舒尼替尼可減少荷瘤小鼠和轉(zhuǎn)移性腎癌患者的Tregs數(shù)量[53]。

總之,Tregs可促進(jìn)趨化因子CCL22分泌,將更多的Tregs募集骨髓。增加的Helios+Tregs通過VEGFA/VEGFR2途徑促進(jìn)ALL小鼠骨髓血管生成。因此,Helios可能是在臨床中調(diào)控Tregs發(fā)揮作用的關(guān)鍵因子,解釋了Treg細(xì)胞參與ALL發(fā)病的機(jī)制,且有助于通過抑制表達(dá)Helios Tregs開發(fā)ALL的分子治療策略。

4.2 CXCL12/CXCR4介導(dǎo)Tregs遷移 骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)功能性趨化因子CXCL12,也稱為基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1),可與其同源配體CXCR4特異性結(jié)合,介導(dǎo)多種免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。骨髓是Tregs重要的儲(chǔ)存庫,CXCL12/CXCR4信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)Tregs在骨髓和外周血之間的運(yùn)輸至關(guān)重要[50]。CXCL12在骨髓中表達(dá)并誘導(dǎo)Tregs黏附和遷移,Tregs通過CXCR4/CXCL12信號(hào)途徑保留骨髓。

ZOU等[54]通過給予非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷患者靜脈內(nèi)輸注人Tregs 40～60 h后,可見Tregs主要集中于骨髓,而在外周血中能檢測(cè)到Tregs＜100個(gè)/ml。體內(nèi)給予特定抗人CXCR4單克隆抗體可顯著減少Tregs遷移至骨髓。將人血CD4+CD25+T細(xì)胞以100μl注射至雌性小鼠尾靜脈,腹腔注射抗人CXCR4(500 ng/200μl)2次,收集骨髓、血液和脾臟,結(jié)果顯示小鼠骨髓在體外可有效介導(dǎo)人單核細(xì)胞衍生的樹突狀細(xì)胞(monocyte-derived dendritic cells,MDCs)激活的Tregs以劑量依賴遷移,可顯著被小鼠抗人CXCR4單克隆抗體阻斷。CXCL12/CXCR4信號(hào)對(duì)Tregs運(yùn)輸至骨髓至關(guān)重要。最近報(bào)道提出,在卵巢癌、間皮瘤及白血病患者中,拮抗CXCR4可減少Tregs,還可促使Tregs向T輔助細(xì)胞轉(zhuǎn)化[55-57]。

CXCL12通過募集Tregs進(jìn)入骨髓代表了Tregs穩(wěn)態(tài)的一種新穎且重要的機(jī)制,通過抑制CXCL12/CXCR4信號(hào)可阻斷Tregs遷移,可能是逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制微環(huán)境并增強(qiáng)抗腫瘤免疫的一種有前景的治療策略。

5 總結(jié)

近年來,血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療雖然取得了一定進(jìn)展,但多數(shù)患者最終仍會(huì)復(fù)發(fā)并化療或放療引起的嚴(yán)重副作用,研究免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用備受關(guān)注。免疫細(xì)胞是血液腫瘤的重要組成部分,Tregs擴(kuò)增導(dǎo)致抗腫瘤免疫反應(yīng)受損從而導(dǎo)致免疫逃逸和血液腫瘤及實(shí)體腫瘤進(jìn)展,而骨髓微環(huán)境對(duì)Tregs至關(guān)重要,影響Tregs在腫瘤進(jìn)展中的作用,加速腫瘤進(jìn)展。近年對(duì)Tregs研究正步入新階段,在腫瘤免疫治療過程中如何提高腫瘤治療特異性以達(dá)到最佳治療效果,如何消除Tregs的影響達(dá)到最佳治療效果,隨著研究的深入,Tregs在腫瘤免疫治療中最終會(huì)得到明確結(jié)論。在精準(zhǔn)醫(yī)療背景下,任何與疾病預(yù)后相關(guān)的可控性危險(xiǎn)因素都應(yīng)進(jìn)行預(yù)防性干預(yù),深入研究Tregs與骨髓微環(huán)境進(jìn)行的具體分子調(diào)控機(jī)制在免疫治療中具有廣闊前景,有助于探索新的免疫療法,延長患者生存期甚至治愈。