基于電子鼻和GC-MS的酶解獼猴桃汁香氣成分動態(tài)解析

周 元，傅虹飛，胡亞云

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 楊凌 712100)

香氣是水果果實及其相關(guān)制品品質(zhì)的重要感官指標[1]。獼猴桃屬(Actinidia)果實香氣品質(zhì)研究始于1982年[2]，目前已從美味(A.deliciosa)、中華(A.chinensis)、軟棗(A.arguta)、毛花(A.eriantha)等不同品種獼猴桃果實中鑒別出醇類、酯類、酸類、酮類、萜烯類等香氣物質(zhì)，其中以來源于脂肪酸途徑的醛類、酸類和醇類等物質(zhì)含量較高[3]。毛花獼猴桃香味比較清淡，揮發(fā)性物質(zhì)組成與其他獼猴桃果實存在較大差異，推測其主要以結(jié)合態(tài)香氣前體物質(zhì)形式存在[4]。而目前的相關(guān)研究多關(guān)注的是獼猴桃果實成熟過程及采后儲藏期游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的變化[5-6]，對于結(jié)合態(tài)香氣前體物質(zhì)的調(diào)控釋放報道較少。

果實中結(jié)合態(tài)香氣前體物質(zhì)作為潛在的香氣物質(zhì)來源，其含量被認為是自由態(tài)的10倍[7]。結(jié)合態(tài)香氣前體物質(zhì)本身無香氣且不揮發(fā)或難揮發(fā)，為使這些潛在香氣前體分子發(fā)揮功能，就需要解開結(jié)合態(tài)糖苷鍵，從而釋放出具有揮發(fā)性的糖苷配基。糖苷配基主要包括萜烯類化合物、脂肪醇類、芳香烴類衍生物等，可在果實成熟、加工和儲藏過程中釋放出來，或者經(jīng)過酶解、酸解和熱處理釋放出來[8]。β-葡萄糖苷酶則是這些香氣分子釋放過程酶系中最重要的酶之一[9]，是水解芳香物質(zhì)前體、釋放結(jié)合態(tài)糖苷配基的關(guān)鍵酶[10]。國內(nèi)外對β-葡萄糖苷酶用于葡萄和葡萄酒芳香物質(zhì)酶解調(diào)控研究較多[11]。郭慧女等[12]比較了黑曲霉、海藻曲霉和魯氏毛霉來源的β-葡萄糖苷酶對玫瑰香葡萄結(jié)合態(tài)香氣提取物質(zhì)的酶解作用效果，認為以黑曲霉來源的β-葡萄糖苷酶的酶解效果最佳。桑葦?shù)萚13]采用黑曲霉β-葡萄糖苷酶對赤霞珠葡萄新酒進行增香調(diào)控，酶解處理后香氣物質(zhì)相對總量與對照相比增加24.59%，其中以4-萜品醇、α-松油醇和香葉醇等為代表的萜烯及C13-降異戊二烯類物質(zhì)增加最為顯著。

我國獼猴桃種植面積和產(chǎn)量均居世界第一[14]，獼猴桃深加工技術(shù)的發(fā)展有益于其產(chǎn)業(yè)的進一步提升。β-葡萄糖苷酶是風(fēng)味修飾中的關(guān)鍵酶，對果蔬制品品質(zhì)提升具有十分重要的作用，但其對獼猴桃香氣的酶解釋放作用尚未見深入探討。本研究利用電子鼻(E-nose)檢測β-葡萄糖苷酶對獼猴桃汁香氣物質(zhì)的釋放作用，并采用固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(SPME-GC-MS)分析酶解處理對獼猴桃汁香氣物質(zhì)組成和含量的影響，旨在為獼猴桃汁酶解增香技術(shù)的研究及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃：2019年購于當?shù)爻?，品種為徐香。

化學(xué)試劑：β-葡萄糖苷酶(微生物來源)，實驗室自制；對硝基苯酚、對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、檸檬酸、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、無水NaCl，均為分析純，上海國藥集團；環(huán)己酮(標品級)，上海阿拉丁公司。

1.2 儀器與設(shè)備

榨汁機(MJ-WJS1221F)，美的集團股份有限公司；手持數(shù)顯水果硬度計(GY-4)，艾普公司；電子鼻(PEN3)，德國AIRSENSE公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-QP2010，日本島津公司；DB-1MS 色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國安捷倫公司；SPME萃取頭(30/50 μm DVB/CAR/PDMS)，美國Supelco公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 β-葡萄糖苷酶酶活的確定 參考文獻[9]的方法但略有修改。將100 mg酶與5 mL的40 mmol/L對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液和4 mL的1 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 4.0)混合，在40 ℃下孵育30 min，添加2 mL的3 mol/L碳酸鈉溶液以終止反應(yīng)，在405 nm下比色讀數(shù)，酶活用U/mg表示。

1.3.2 β-葡萄糖苷酶酶解獼猴桃汁的制備 選取無機械損傷且品相良好的獼猴桃果實，測定硬度值。選擇硬度為10.0～12.0 N的果實[5]，削皮、榨汁、去渣后備用。預(yù)試驗考察了酶解溫度(25，35，45 ℃)、酶解時間(4，8，12 h)及加酶量(4，8，12 U/g)3 個因素，采用電子鼻測定酶解前后獼猴桃汁樣品的香氣成分，通過分析電子鼻傳感器響應(yīng)值的變化，確定后續(xù)酶解試驗參數(shù)為：酶解溫度35 ℃，酶解時間0～8 h，加酶量為8 U/g，進一步考察酶解獼猴桃汁香氣物質(zhì)的動態(tài)變化。

1.3.3 電子鼻分析條件 參考文獻[15]方法但略有修改。本研究采用的電子鼻傳感器陣列(含10個傳感器)的特征見表1。取酶解后的獼猴桃汁樣品1 g，用雙蒸水稀釋5倍，每組6個平行。設(shè)置電子鼻進氣流速為300 mL/min，每秒采集1個數(shù)據(jù)，分別記錄電子鼻10個傳感器的響應(yīng)值，即G/G0值(其中G為最終電阻，G0為初始電阻)，當G/G0>2.0，可認為該傳感器對待測樣品敏感。每個樣品的電子鼻采集時間為60 s，清洗時間為300 s。

表1 電子鼻傳感器陣列的特征

1.3.4 香氣物質(zhì)的SPME-GC-MS分析 (1)SPME-GC-MS條件。參考文獻[4]方法但略有修改。頂空固相微萃取條件：取5.0 g樣品放入固相微萃取瓶中，加入2.5 mL飽和氯化鈉溶液，10 μL環(huán)己酮內(nèi)標(0.5 mg/mL)，45 ℃預(yù)熱2.5 min，萃取吸附45 min，GC 解析5 min，用于GC-MS 分析。GC 條件：進樣口溫度250 ℃；色譜柱初始溫度40 ℃保持2 min后，以6 ℃/min升至120℃并保持5 min，再以8 ℃/min升至200 ℃并保持2 min，再以10 ℃/min升至250 ℃并保持8 min；載氣為高純氦氣，柱流量1.5 mL/min。MS 條件：EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描范圍30.00～500.00 m/z。

(2)香氣物質(zhì)定性與半定量方法。香氣活性成分的定性通過與NIST質(zhì)譜庫中的標準譜圖進行檢索比對，并根據(jù)各物質(zhì)保留指數(shù)(RI)進行確認[16]。半定量分析時，將待測物質(zhì)峰面積與環(huán)己酮內(nèi)標峰面積進行計算，計算公式為：

Xi=(Ai/As)×Cs。

式中：Xi為待測物質(zhì)濃度；Ai為待測物質(zhì)峰面積；As為內(nèi)標物質(zhì)峰面積；Cs為內(nèi)標物質(zhì)濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.0軟件和Excel軟件繪圖，采用Minitab 15.0軟件進行多重比較分析(P<0.05)。采用SIMCA 14.1軟件進行雙向偏最小二乘(bidirectional orthogonal partial least squares，O2PLS)分析[17-19]，得到O2PLS模型中的投影用于預(yù)測變量影響(variable influence on projection for predication，VIPpred)值，其中VIPpred值>1.0的變量被認為是重要的變量。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解獼猴桃汁香氣物質(zhì)的電子鼻分析

2.1.1 電子鼻傳感器響應(yīng)值變化 電子鼻模擬人的嗅聞方式獲得樣品整體信息，從而避免感官評價的主觀誤差，具有檢測結(jié)果重復(fù)性好等特點[15]。電子鼻常用于識別、表征和分級水果香氣在不同種類和品種之間的差異，能夠快速、一致地評估復(fù)雜的揮發(fā)性氣體混合物[20]。

電子鼻傳感器陣列的10個傳感器對酶解過程中獼猴桃汁香氣物質(zhì)的響應(yīng)值見圖1。由圖1可知，當獼猴桃汁酶解0～8 h，電子鼻傳感器陣列中S1、S3、S4、S5和S9 5個傳感器對獼猴桃汁香氣物質(zhì)變化的響應(yīng)值(G/G0)為1.0～2.0，可知其對獼猴桃汁香氣物質(zhì)的變化不敏感，而傳感器S2、S6、S7、S8和S10對獼猴桃汁香氣成分的響應(yīng)值(G/G0)>2.0，表現(xiàn)為對獼猴桃汁香氣成分的變化敏感。除S10外，其他傳感器的敏感性與文獻[21]一致；與文獻[21]相比，S9傳感器(對芳香類化合物、有機硫化物敏感)在此次分析中對獼猴桃汁香氣成分的變化不敏感，這可能與試驗原料成熟度相關(guān)，提示獼猴桃汁內(nèi)無揮發(fā)性硫化物或未達到檢出限。S2、S6、S7、S8和S10的響應(yīng)值隨著酶解時間的增加不斷變化，在0～8 h酶解過程中，響應(yīng)值在酶解6 h達到最高，隨后略有下降，提示獼猴桃汁在酶解過程中表現(xiàn)出風(fēng)味強度的變化，存在萜烯類、烷烴類、氮氧化合物、芳香化合物和醇類等傳感器敏感類物質(zhì)含量的變化，而這些物質(zhì)含量的動態(tài)變化會影響獼猴桃汁整體風(fēng)味。

圖1 電子鼻傳感器對不同酶解時間獼猴桃汁香氣物質(zhì)的響應(yīng)值

2.1.2 電子鼻傳感器響應(yīng)值變化的主成分分析 主成分分析(principal component analysis，PCA)是一種無監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析方法，常用于電子鼻檢測結(jié)果分析，用以說明傳感器識別效應(yīng)和樣品間的區(qū)分度等[16]。本研究將5個傳感器(S7，S6，S2，S8和S10)對酶解0～8 h的獼猴桃汁香氣成分的響應(yīng)值進行PCA分析，其得分圖和載荷圖如圖2所示。

A.得分圖;B.載荷圖

圖2-A表明，PC1貢獻率為57.6 %，PC2貢獻率為29.9 %，總貢獻率為87.5 %，因此這2個主成分可代表樣品的主要特征。另外，電子鼻可以很好區(qū)分酶解前(0 h)和酶解后(2～8 h)樣品，從PC1角度看，酶解后組樣本位于正向端，而酶解前組樣本位于負向端，表明酶解產(chǎn)生的部分風(fēng)味物質(zhì)引起了獼猴桃汁整體風(fēng)味的變化。對于酶解后組獼猴桃汁來說，酶解2，4，6 h組樣本空間距離不大，表明經(jīng)過酶解，獼猴桃汁風(fēng)味成分存在一定變化，具體組成還需要進一步檢測。圖2-B顯示，傳感器S6和S8發(fā)生重合，與其傳感器特征值一致，在第1主成分貢獻率中占主要部分，S7、S10的貢獻率較小。傳感器S6和S8在識別和檢測酶解獼猴桃汁樣品中起著重要作用，說明酶解過程中萜烯類和烷類物質(zhì)的動態(tài)變化對整體風(fēng)味的變化有重要影響。此外，傳感器S2在第2主成分中貢獻率最大。上述結(jié)果表明，在本研究中電子鼻對獼猴桃汁的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)感應(yīng)靈敏，能夠檢測其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化，通過電子鼻的快速檢測可以監(jiān)測獼猴桃汁的酶解進程，控制酶解果汁的品質(zhì)。

2.2 酶解獼猴桃汁中香氣物質(zhì)的GC-MS分析

依據(jù)酶解組樣品的電子鼻檢測分析結(jié)果，本研究采用SPME-GC-MS技術(shù)對獼猴桃汁酶解過程中香氣成分的動態(tài)變化做進一步分析，結(jié)果見表2。

表2 GC-MS解析酶解獼猴桃汁中香氣物質(zhì)的動態(tài)變化

由表2可知，酶解增香后，徐香獼猴桃香氣成分組成和含量十分豐富，從酶解的獼猴桃汁樣品中共分析獲得47種物質(zhì)，包括醇類8種，醛類11種，酸類4種，萜烯類6種，酯類1種，酮類8種，呋喃類2種，烷烴類7種，主要包括順-3-己烯-1-醇、反-2-己烯-1-醇、己醇、反-2-己烯醛、乙醛、1,8-桉葉素(又名桉葉油醇)和甲基庚烯酮等，上述揮發(fā)性化合物因其通常具有較低的感官閾值，可以認為是獼猴桃汁主要香氣物質(zhì)來源[22-23]。進一步分析顯示：徐香獼猴桃汁中醛類物質(zhì)總量為(3 978.23±438.04)μg/kg，醇類為(3 561.47±219.48)μg/kg，萜烯類為(1 326.56±92.75)μg/kg(其中1,8-桉葉素(1 132.7±76.4)μg/kg)。據(jù)文獻[3]報道1,8-桉葉素在海沃德獼猴桃果實中未測得，黃金果獼猴桃果實中為30.1 μg/kg。此外，趙寧等[16]研究表明，徐香獼猴酒中1,8-桉葉素含量為(122.67±3.76)μg/L，顯著高于黃金果獼猴桃酒((67.26±2.77)μg/L)和海沃德獼猴桃酒((2.40±0.39)μg/L)。與0 h相比，酶解處理4 h后，獼猴桃汁香氣物質(zhì)總量增加20.53%，其中酸類化合物含量增加1 523.10%，呋喃類化合物含量增加441.60%，酮類化合物含量增加23.84%，萜烯類化合物含量增加22.26%，烷烴類化合物增加20.75%，醇類化合物含量增加10.28%，醛類化合物含量增加6.71%。

Garcia等[24]采用柱層析純化軟棗獼猴桃糖苷鍵合態(tài)前體物質(zhì)，用rapidase酶水解的方式進行結(jié)合態(tài)物質(zhì)釋放，認為糖苷鍵結(jié)合態(tài)前體物質(zhì)經(jīng)酶解后釋放了呋喃醇(2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮)、反-2-己烯醛、己醛、1-辛烯-3-醇和苯甲酸等揮發(fā)性物質(zhì)。隨后采用相同方法對海沃德獼猴桃和黃金果獼猴桃進行了分析，結(jié)果表明，海沃德獼猴桃中的主要結(jié)合態(tài)揮發(fā)性化合物為苯甲醛、反-2-己烯醛、己醛、3-辛醇和2-甲基丁醛等，黃金果獼猴桃中則以呋喃醇(2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮)、苯乙醇、3-羥基-β-大馬酮、己醛和順-3-己烯-1-醇等為主[25]。與上述報道的其他品種獼猴桃經(jīng)酶解釋放的揮發(fā)性物質(zhì)相比，本研究中徐香獼猴桃的揮發(fā)性化合物以反-2-己烯醛、己醛、順-3-己烯-1-醇、反-2-己烯-1-醇、己醇等含量較高，與酶解前(0 h)相比較，酶解4 h上述物質(zhì)分別增加了6.83%，3.17%，4.64%，10.71%和5.64%。此外，與酶解前(0 h)相比，經(jīng)過4 h酶解后，獼猴桃汁揮發(fā)性物質(zhì)中有30種物質(zhì)含量顯著增加(P<0.05)，主要包括2-丙基庚醇、苯乙醇、2-乙基己酸、苯甲酸、β-蒎烯、2-庚酮、反-2-(2-戊烯基)呋喃等。在本研究中，僅得到一種酯類物質(zhì)，即反-2-己烯醇乙酸酯，可能與此次研究中選用獼猴桃硬果作為原料有關(guān)，其含量在酶解后顯著增加，推測與反-2-己烯醇及乙酸在酶解過程中含量增加有關(guān)。

萜烯類化合物呈現(xiàn)特殊的香氣，是水果特征香氣的主要貢獻物質(zhì)之一。萜烯類化合物多以無味的糖苷態(tài)形式存在，外源添加糖苷酶則是釋放游離態(tài)萜烯化合物的有效方法[13]。由表2可知，徐香獼猴桃汁經(jīng)過酶解后，相對含量增加最多的萜烯類化合物是β-蒎烯，在酶解過程從無到有；其次是傘花烴，其相對含量增加489.98%；另外，α-松油醇、γ-松油烯、α-畢澄茄油烯和1,8-桉葉素的相對含量也分別增加了200.89%，186.00%，171.64%和22.97%，其中1,8-桉葉素能夠釋放濃郁的薄荷香氣。由以上結(jié)果可知，β-葡萄糖苷酶可以有效地酶解結(jié)合態(tài)前體物質(zhì)，促使揮發(fā)性小分子釋放，對提高獼猴桃汁中典型性香氣具有積極影響。

與GC-MS分析方法相比，電子鼻技術(shù)具有分析速度快、靈敏度高和檢測費用低等優(yōu)點[18]，但其無法對具體物質(zhì)組成變化做出預(yù)測，GC-MS可以對物質(zhì)組成進行分析，但耗時較長，對儀器要求高。將GC-MS測得的香氣物質(zhì)(X)與電子鼻傳感器響應(yīng)值(Y)進行O2PLS建模(2+1+1)，結(jié)果如表3所示。由表3可知，模型中的累計R2Y和累計Q2分別為0.995(≈1.0)和0.762(> 0.5)，表明O2PLS擬合效果較好[17]，這說明獼猴桃汁中揮發(fā)性物質(zhì)的動態(tài)變化與電子鼻響應(yīng)值的變化之間存在較好的對應(yīng)關(guān)系。

表3 GC-MS測定的香氣物質(zhì)(X)與電子鼻傳感器響應(yīng)值(Y)的O2PLS模型

圖3表明，由O2PLS模型得到的47種揮發(fā)性物質(zhì)的VIPpred值為0.34～1.44，其中有25種物質(zhì)的VIPpred>1.0，表明這些香氣物質(zhì)的變化對電子鼻傳感器響應(yīng)值的變化貢獻較大，具體分別為β-蒎烯(C25)、反-2-己烯醇乙酯(C28)、反-2-(2-戊烯基)呋喃(C27)、反-2-癸烯(C43)、2-乙基呋喃(C8)、3,7,11-三甲基-2,6,10-十二烯-1-醇(C47)、γ-松油烯(C32)、辛酸(C39)、2-丙基庚醇(C33)、苯乙醇(C35)、癸醛(C41)、香葉基丙酮(C45)、1-戊烯-3-酮(C5)、苯甲酸(C38)、十四烷(C46)、2-乙基己酸(C36)、3-甲基-3-丁烯-2-酮(C4)、1-辛-3-酮(C22)、2-庚酮(C18)、2,5,5-三甲基-1,6-七烯(C31)、乙酸(C2)、1-己烯-3-酮(C9)、3-甲基-2-己烯(C11)、順-2-庚醛(C20)和1-戊烯-3-醇(C6)。

圖3 GC-MS測定的香氣物質(zhì)(X)與電子鼻傳感器響應(yīng)值(Y)的O2PLS模型的VIPpred值

3 結(jié) 論

獼猴桃汁酶解過程中香氣的動態(tài)變化可以采用電子鼻進行監(jiān)測，其香氣成分的電子鼻響應(yīng)值變化主要體現(xiàn)在S2、S6、S7、S8和S10這5個傳感器上。獼猴桃汁香氣成分經(jīng)電子鼻傳感器檢測的強度值隨酶解時間增加，酶解6 h達到最高后略有下降。SPME-GC-MS分析結(jié)果表明，經(jīng)酶解處理后，獼猴桃汁香氣成分中有30種發(fā)生了顯著性增加(P<0.05)，其中順-3-己烯-1-醇、反-2-己烯-1-醇、1,8-桉葉素、戊醛、己醛、反-2-己烯醛、庚醛、順-2-庚烯醛、辛醛、壬醛、癸醛、2-庚酮和甲基庚烯酮是主要的香氣物質(zhì)。與未酶解獼猴桃汁相比，酶解處理4 h獼猴桃汁的揮發(fā)性物質(zhì)總量增加20.53%。因此，酶解處理能作用于獼猴桃汁香氣前體物質(zhì)，釋放揮發(fā)性香氣物質(zhì)，提高獼猴桃汁香氣物質(zhì)總量，該結(jié)果可為酶解獼猴桃汁香氣品質(zhì)控制提供理論依據(jù)。