不結球白菜花青苷合成轉錄因子基因BcEGL3的克隆及沉默分析

劉丹,周倩,孔祥雨,胡春梅*,侯喜林,王建軍,2

(1.南京農業(yè)大學作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室/農業(yè)農村部華東地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室/園藝作物種質創(chuàng)新與利用教育部工程研究中心,江蘇 南京 210095;2.南京農業(yè)大學連云港新農村發(fā)展研究院,江蘇 連云港 222002)

不結球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)富含對人體有利的維生素C、粗纖維和花青苷,紫色不結球白菜中的花青苷含量尤為豐富?；ㄇ嘬帐翘腔亩喾宇惢衔?易溶于水,是蔬菜和水果重要的呈色物質?；ㄇ嘬漳軌虮Ｗo植物抵抗各種生物和非生物脅迫[1],花青苷在人體中還具有抗氧化[2]、抗癌[3],降低血壓[4]和血脂[5],減緩阿爾茲海默癥[6]等功效。

EGL3(EnhancerofGlabra3)基因屬于Ⅲf亞類bHLH轉錄因子,可以通過調控花青苷合成途徑中某個結構基因,實現對植物體內花青苷含量的調控作用。EGL3蛋白具有典型堿性螺旋環(huán)螺旋結構域,bHLH結構域具有2個不同的功能區(qū)域:HLH和BASIC[7],其中HLH可以促進蛋白互作,形成同源二聚體或異源二聚體[8];BASIC位于bHLH結構域的N末端,與DNA順式元件E-box(5′-CANNTG-3′)和G-box(5′-CACGTG-3′)結合調控基因的表達[9]。DFR基因是花青苷合成途徑中結構基因。二氫黃酮醇-4-還原酶(dihydrofavonol 4-reductase,DFR)是花青苷生物合成代謝中的關鍵酶,影響花青苷的組成和色素沉著,是植物呈色的關鍵酶,也是花色形成的重要調控點。Danilo等[10]對缺失DFR基因的番茄純合子的胚軸和愈傷組織進行體外培養(yǎng),之后對再生綠色小植株的胚軸和愈傷組織靶向插入DFR基因,結果再生小植株由綠色轉為紫色。于婷婷[11]在龍膽試驗中檢測發(fā)現,DFR基因過表達的轉基因橙花龍膽與野生型相比紅色更深,花青苷含量更高。Nesi等[12]發(fā)現在過表達EGL3的轉基因擬南芥植株中,DFR的表達量增加,葉片由綠色轉為紫色,證明EGL3通過調控花青苷合成途徑中DFR基因實現對花青苷的調控。EGL3基因還可與其他調控因子PAP1/2、TTG1一起形成復合體,共同調控DFR基因的表達調控[13]。

本研究采用同源克隆方式以不結球白菜紫色自交系NJZX1-3及其綠色突變體NJZX1-0為材料克隆獲得BcEGL3基因,利用生物信息學方法分析其結構及保守域,并預測其蛋白結構;構建pRI101-BcEGL3載體,對BcEGL3進行亞細胞定位分析;構建pTY-BcEGL3沉默載體,對BcEGL3基因進行功能驗證;對NJZX1-3進行遮光處理,檢測葉片花青苷含量以及BcEGL3基因的轉錄水平,旨在為紫色不結球白菜中花青苷合成的分子調控機制奠定生物學基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為不結球白菜紫色材料NJZX1-3及其經過秋水仙素誘導所產生的非加倍綠色突變體NJZX1-0(圖1),由南京農業(yè)大學白菜系統(tǒng)生物學實驗室提供。將不結球白菜種子先用體積分數為70%的乙醇殺菌消毒后,再用超凈水沖洗,室溫催芽2 d左右,移至穴盤,放置在氣候室(光/暗時間為16 h/8 h,光/暗溫度為22 ℃/18 ℃)。另外,取7葉期健壯NJZX1-3材料用遮陽網進行遮光處理,分別在處理后0、3、7、11和14 d時取樣,每個處理設3次重復。以同期自然條件下生長的健壯幼苗為對照組。

圖1 不結球白菜的表型Fig.1 The phenotype of non-heading Chinese cabbage

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

取0.1 g試驗材料7葉期的葉片,置于加入鋯珠的2 mL磨樣管中,液氮速凍。用磨樣機(程序為45 Hz 90 s)磨樣完成后,用RNA提取試劑盒(TaKaRa)提取RNA。使用Prime Script RT Reagent Kit(TaKaRa)合成cDNA,用于BcEGL3基因的克隆。

1.3 BcEGL3基因的克隆

在大白菜數據庫(BRAD,http://brassicadb.org/brad/index.php)中,查詢BcEGL3同源基因BraEGL3(Bra027796)設計特異引物(表1),并以反轉錄得到的第1鏈cDNA為模板,進行cDNA克隆。PCR總體系為20 μL:模板1 μL,正、反引物各1 μL,I-5TtMn 2×High-Fidelity Master Mix酶(南京擎科生物科技有限公司)10 μL,ddH2O 7 μL。設3個重復。反應程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,59.6 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產物經15 g·L-1凝膠電泳檢測后,回收目的片段,經大腸桿菌轉化后,挑取單菌落送南京擎科生物科技有限公司進行測序。

表1 本文所用引物序列Table 1 Primer sequences in this study

1.4 EGL3基因序列及其蛋白的生物信息學分析

利用BioXM 2.6對EGL3進行ORF查找、翻譯;利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的分析工具對EGL3蛋白質理化性質進行分析;利用DNAMAN 7程序進行多重序列比對;利用TMpred在線軟件(https://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)預測EGL3的跨膜結構;利用MEGA 5程序構建系統(tǒng)進化樹;利用在線的SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)進行結構域分析;利用WebLogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)在線程序分析EGL3轉錄因子蛋白結構域的保守位點。

1.5 BcEGL3的亞細胞定位檢測

設計2條特異性引物BcEGL3.1-R和BcEGL3.1-F,以pEASY-BcEGL3.1載體質粒為模板,采用高保真酶擴增目標片段,電泳檢測后切膠回收。用限制性內切酶對表達載體pRI101進行雙酶切。反應產物經凝膠(15 g·L-1)電泳檢測后,膠回收酶切目的片段。用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit(南京諾唯贊生物科技有限公司)同源重組上述膠回收片段,經大腸桿菌轉化后,挑取單菌落送南京擎科生物科技有限公司進行測序,返樣后提取質粒,于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將上述提取的質粒采用凍融法轉化到農桿菌GV3101中,均勻涂在含有卡那霉素(50 mg·L-1)和利福平(50 mg·L-1)的LB固體培養(yǎng)基上,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。2 d后挑取單菌落于400 μL含卡那霉素和利福平的LB液體培養(yǎng)基的滅菌管中;在28 ℃過夜搖菌,將搖好的菌液轉移到50 mL管中搖至菌液D600=1.0;6 000 r·min-1離心5 min,棄上清液,用含10 mmol·L-1MES、10 mmol·L-1MgCl2和150 mol·L-1的乙酰丁香酮注射緩沖液重懸菌液;將菌液調至D600=0.8,室溫靜置 4 h;將P19、RFP、EGL3基因按0.5∶1∶1的體積比混勻,用1 mL滅菌的去掉針頭的注射器,注射種植時間為1個月的煙草葉片背面。將注射后的煙草置于氣候室,氣候室條件為:光/暗時間為16 h/8 h,光/暗溫度為22 ℃/18 ℃。3 d后利用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.6 病毒誘導的基因沉默表達載體的構建

pTY-BcEGL3的載體構建主要采用楊學東等[14]的方法。BcEGL3選取的40 bp序列為:5′-TAAAGAAACACCTCGCAGTTTCAGTTCGAAACATTCAATG-3′,在南京金斯瑞生物科技有限公司分別合成反向互補序列80 bp。pTY載體用NdeⅠ酶切后,用T4連接酶與合成好的DNA片段過夜連接,轉化大腸桿菌,挑取陽性單克隆,測序驗證。提取pTY-BcEGL3質粒,用金粉包埋后,用基因槍(1 000 psi)導入到7葉期的NJZX1-3中,以pTY空載質粒的NJZX1-3(pTY-S)作為對照,20 d后,觀察植株表型變化。選取pTY載體中的CP(coat protein)基因片段設計特異引物(CP-F:5′-TCCACCCTCACCACCTTC-3′和CP-R:5′-GGGACAGACCTCGCTAACT-3′),PCR檢測轉基因植株[15]。

1.7 不結球白菜總花青苷含量的測定

采用董慧杰[2]的方法并稍加改動。取冷凍干燥葉片 0.1 g,用液氮研磨后,加入1.5 mL酸化乙醇(用體積分數為5%的HCl進行酸化),在適當搖晃、避光條件下浸提24 h。

1.8 實時熒光定量PCR表達分析

根據克隆所得EGL3基因的cDNA全長序列,采用在線軟件Primer-BLAST設計正、反引物(表1),Actin基因作為內參。試驗步驟及用量參考SYBRPremixExTaqTMNJZX1-0Ⅱ(TaKaRa)試劑盒說明書。反應總體系20 μL:模板1 μL,正、反引物各0.5 μL,SYBRPremixExTaq10 μL,ddH2O 8 μL。采用2-ΔΔCT法[16]計算基因的相對表達量。每個反應設3次生物學重復。程序為標準的兩步法,在7500實時熒光定量PCR儀(美國AppliedBiosystems)上進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 不結球白菜EGL3基因的克隆及序列分析

分別從NJZX1-3和NJZX1-0中分離出2個cDNA克隆片段,測序結果(圖2)顯示,這2個片段的基因序列完全一致,長1 821 bp,將其命名為BcEGL3。核苷酸序列比對結果顯示,BcEGL3含有1個長為1 818 bp的開放閱讀框(ORF),編碼606個氨基酸,其中含酸性氨基酸63個,堿性氨基酸84個。

圖2 不結球白菜EGL3基因的核苷酸序列及其對應的氨基酸序列Fig.2 The nucleotide and deduced amino acids sequence of EGL3 gene in Brassica campestris ssp. chinensis

2.2 BcEGL3蛋白的特征分析

對BcEGL3蛋白結構分析顯示,該蛋白的等電點為4.98,分子結構式為C5469H9119N1821O2289S354,相對分子質量為6.795×104,為親水性蛋白。氨基酸組成中Ala(a)丙氨酸所占比例最大。保守域分析結果表明,EGL3蛋白屬于bHLH-MYC-N超家族。利用在線軟件SOPMA預測EGL3編碼蛋白二級結構,結果表明(圖3),EGL3含有α-螺旋236個(38.94%),無規(guī)則卷曲281個(46.37%),含有β-轉角23個(3.80%)和延伸鏈66個(10.89%)。EGL3蛋白的三級結構(圖4)的預測結果與二級結構的基本相符。

圖3 BcEGL3蛋白的二級結構Fig.3 The predicted secondary structure of BcEGL3 protein圖中藍色為α-螺旋,紅色為β-折疊,綠色為β-轉角,紫色為無規(guī)則卷曲。In figure,blue represents alpha helix,red represents beta folding,green represents beta corner and purple represents irregular curling.

圖4 BcEGL3蛋白質三級結構Fig.4 The predicted tertiary structure of BcEGL3 proteina. α-螺旋α-helix;b.延伸鏈 Extended strand;c.隨機卷曲 Random coils.

2.3 BcEGL3蛋白的同源性比較及進化樹分析

利用BLASTp對BcEGL3蛋白序列進行同源檢索,并進行多重序列比對。結果(圖5)顯示:在7個物種的EGL3蛋白序列中,BcEGL3蛋白與大白菜中的EGL3同源性高達99.90%,其次是油菜和甘藍,同源性分別為98.68%和98.46%。

圖5 BcEGL3蛋白和其他物種EGL3蛋白的同源性比較Fig.5 Homologous alignment of amino acid sequences of BcEGL3 and EGL3 in other species 1.不結球白菜Brassica campestris ssp. chinensis;2.大白菜Brassica rapa ssp. pekinensis(XM_009114683.2);3.甘藍Brassica oleracea(XM_013751484.1);4.蘿卜Raphanus sativus(XM_018597840.1);5.琴葉擬南芥Arabidopsis lyrata subsp. lyrata(XM_021010124.1);6.亞麻芥Camelina sativa(XM_010475309.2);7.擬南芥Arabidopsis thaliana(NM_001198373.2).

根據蛋白質的序列構建分子進化樹,結果(圖6)表明,EGL3蛋白的進化關系與植物學分類一致,不同物種之間有明顯的種屬關系。十字花科植物歸為一大類,包括蕓薹屬這一小支,屬于其他科屬的植物也各自分別歸類。BcEGL3蛋白與歐洲油菜、大白菜、甘藍和蘿卜中的EGL3蛋白聚為同一組,彼此親緣關系較近,表明BcEGL3蛋白可能具有相似的編碼和調控功能。

圖6 BcEGL3蛋白與其他物種中EGL3蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of BcEGL3 protein and EGL3 proteins in other species

2.4 BcEGL3亞細胞定位分析

由圖7可見:pRI101-BcEGL3熒光表達載體在GFP通道下可以被激發(fā),發(fā)出明顯的綠色熒光信號。細胞核marker用來標識細胞核的位置,在RFP通道下發(fā)出明顯的紅色熒光信號。利用激光共聚焦顯微鏡觀察注射3 d后的煙草葉片,發(fā)現綠色熒光信號和紅色熒光信號在細胞核位置重疊。表明BcEGL3蛋白定位于細胞核中。

圖7 BcEGL3在本氏煙葉片細胞中的定位Fig.7 Subcellular localization of BcEGL3 in leaves of Nicotiana benthamiana

2.5 BcEGL3基因沉默后不結球白菜紫色材料的表型變化

由圖8可見:與NJZX1-3植株相比,轉pTY-BcEGL3或轉pTY-S的植株葉片表現為紫色變淺,并伴有斑駁的癥狀;同時轉pTY-BcEGL3與轉pTY-S植株相比葉片顏色由紫色轉為綠色。表明BcEGL3基因會影響紫色材料葉片顏色變化。

圖8 BcEGL3基因沉默后不結球白菜植株表型對比Fig.8 Phenotypic comparison of plants after BcEGL3 gene silencing in Brassica campestris ssp. chinensispTY-S和 pTY-BcEGL3分別表示轉pTY-S和pTY-BcEGL3的植株。下同。pTY-S and pTY-BcEGL3 indicate transgenic pTY-S and pTY-BcEGL3 plants,respectively. The same as follows.

2.6 BcEGL3基因沉默對不結球白菜紫色材料中色素含量變化的影響

由圖9可知:在病毒侵染20 d后,不同植株中總花青苷含量從大到小依次為NJZX1-3、轉pTY-S植株、轉pTY-BcEGL3植株、NJZX1-0,且轉pTY-BcEGL3與轉pTY-S植株相比總花青苷含量降低77.83%。NJZX1-0植株總葉綠素含量最高;與NJZX1-3植株相比,轉pTY-BcEGL3和轉pTY-S植株葉片的總葉綠素含量和類胡蘿卜素含量分別降低21.10%、28.44%和18.44%、25.84%,轉pTY-S植株和轉pTY-BcEGL3植株相比總葉綠素含量和類胡蘿卜素含量無明顯變化。

圖9 BcEGL3基因沉默后不結球白菜葉片中色素含量的變化Fig.9 The changes of pigment content after BcEGL3 gene silencing in Brassica campestris ssp. chinensis

2.7 BcEGL3基因沉默后不結球白菜BcEGL3和BcDFR基因的表達分析

由圖10可見:轉pTY-BcEGL3植株中BcEGL3基因的相對表達量比轉pTY-S降低75.64%,且與NJZX1-0植株中表達量相接近,表明BcEGL3基因已被沉默,且會對葉片顏色產生影響。

圖10 BcEGL3基因沉默后不結球白菜BcEGL3和BcDFR基因的相對表達量Fig.10 Relative expression level of BcEGL3 and BcDFR genes in Brassica campestris ssp. chinensis after BcEGL3 gene silencing

BcDFR基因相對表達量由大到小依次為:NJZX1-3、轉pTY-S植株、轉pTY-BcEGL3植株、NJZX1-0,其中轉pTY-BcEGL3植株比轉pTY-S植株降低61.62%,說明BcEGL3基因的沉默會使BcDFR基因表達量下降,進而影響不結球白菜花青苷的含量及葉片的顏色變化。

2.8 遮光后不結球白菜花青苷含量及BcEGL3基因表達分析

由圖11可見:遮光3 d后不結球白菜葉片中花青苷含量開始下降,5 d時比對照降低68.39%;在11 d時葉片中花青苷含量下降幅度最大,比對照降低76.04%。另外,遮光后BcEGL3基因相對表達量呈下降—上升—下降的變化趨勢,與對照相比在3和14 d時下降幅度最為明顯,分別下降75.62%和79.24%。

圖11 不結球白菜花青苷含量和BcEGL3基因的相對表達量Fig.11 The anthocyanin content and relative expression level of BcEGL3 gene in Brassica campestris ssp. chinensis

3 討論

bHLH轉錄因子是真核生物中存在最廣泛的一大類轉錄因子[17],在植物激素響應、光形態(tài)發(fā)生和花器官發(fā)育等多種生理過程中具有重要的調控作用[18]。它可以與MYB轉錄因子和WD40蛋白形成三元復合體,協(xié)同調控花青苷生物合成途徑結構基因的表達,進而調控花青苷的積累[19]。在擬南芥中bHLH類轉錄因子EGL3、GL3、TT8通過和TTG1以及MYB類轉錄因子TT2或PAP1互作來實現對花青苷結構基因的調控[20]。本研究中在NJZX1-3和NJZX1-0中克隆獲得序列一致的BcEGL3基因,序列長1 821 bp,編碼606個氨基酸。蛋白結構分析表明,EGL3蛋白屬于bHLH-MYC-N超家族。進化樹結果表明,BcEGL3蛋白與大白菜BraEGL3關系最近,同源性高達99.9%。亞細胞定位結果顯示,BcEGL3蛋白定位在細胞核內,說明該蛋白在細胞核中發(fā)揮功能。據報道,花青苷的生物合成易受光照條件的影響,在光照條件下MS培養(yǎng)基上的擬南芥幼苗中花青苷的合成增加[2]。在本研究中,遮光處理5 d后的NJZX1-3葉片中花青苷含量明顯低于對照,而BcEGL3基因在遮光處理后表達量都低于對照組。由此推斷,遮光在一定程度上抑制BcEGL3基因的表達從而抑制花青苷的合成。

調節(jié)花青苷生物合成的bHLH轉錄因子大多屬于Ⅲf亞類,通過抑制或者過表達花青苷合成相關的bHLH基因來影響植物體內花青苷的積累[21-22]。病毒誘導的基因沉默(VIGS)技術是轉錄后的基因沉默方法,常用作對特定基因功能的研究,現已廣泛應用于反向遺傳學研究[23]。目前VIGS技術已經應用到許多植物中,例如用VIGS技術沉默小麥淀粉合成的調控轉錄因子基因WSR1后,籽粒內支鏈淀粉、總淀粉和抗性淀粉含量顯著增加,表明WSR1基因負向調控小麥的淀粉合成[24]。用VIGS技術對‘澳洲青蘋’果實Homeobox 1轉錄因子基因MdHB-1沉默后,果實的呼吸強度和乙烯釋放速率受到顯著抑制,果實硬度、可溶性固形物和可滴定酸質量分數的下降延緩,證明MdHB-1基因參與果實的成熟衰老過程[25]。本試驗結果顯示,在沉默轉基因植株中BcEGL3基因表達量較轉pTY-S植株降低75.64%,沉默效果與楊學東等[14]沉默白菜八氫番茄紅素脫氫酶基因(BcPDS)的效果基本一致。這表明在NJZX1-3材料中BcEGL3基因的表達得到有效抑制,沉默轉基因植株中花青苷的積累降低,葉片顏色由紫色變?yōu)榫G色。與NJZX1-3相比，轉pTY-S植株花青苷含量降低 38.11%,由此推斷,病毒會使天然色素發(fā)生少量降解;葉片顏色可能與花青苷和葉綠素含量的比值有關;BcEGL3基因能正向調控總花青苷的積累,但對總葉綠素和類胡蘿卜素的積累無影響。本研究還發(fā)現,在沉默轉基因植株中BcDFR基因表達量與BcEGL3基因的表達量正相關,表明BcEGL3可能是通過調控BcDFR基因的轉錄水平進而影響花青苷的積累。

綜上所述,本試驗通過熒光定量PCR、亞細胞定位、遮光處理及基因沉默等方法對BcEGL3基因的功能進行探索和驗證,結果表明BcEGL3位于細胞核,遮光會抑制BcEGL3基因的轉錄水平。另外,BcEGL3基因沉默可以降低BcDFR基因的表達,進而影響不結球白菜紫色材料中花青苷的積累及植株葉片紫色的呈現。下一步我們將從分子水平進一步解析花青苷的合成機制,為改善紫色不結球白菜優(yōu)良性狀,提高其品質提供理論基礎。