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    表達(dá)重組包涵體蛋白的變性溶解及復(fù)性研究

    2021-03-28 16:25:02高應(yīng)瑞劉珂飛
    今日畜牧獸醫(yī) 2021年7期
    關(guān)鍵詞:復(fù)性緩沖液鹽酸

    高應(yīng)瑞,劉珂飛

    (天津生機(jī)集團(tuán)股份有限公司 300384)

    1 包涵體蛋白溶解

    尿素,鹽酸胍和強(qiáng)離子洗滌劑如N-月桂酰肌氨酸是最常用的溶解劑。在變性劑溶液中溶解包涵體可能是一種已經(jīng)很明確的方法,但是可能聚合可溶性低聚物。鮮為人知的是,在變性溶液中可能會形成聚合物。在變性劑溶液中,由于離子變性的作用,在蛋白復(fù)合物之間產(chǎn)生強(qiáng)大的靜電斥力,進(jìn)而將包涵體分散為單分子結(jié)構(gòu)[1]。

    通常情況下,濃度為6~8M的尿素和6~7M的鹽酸胍可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的溶解。然而,即使在濃度最高的情況下,蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間發(fā)生的相互作用往往也可導(dǎo)致非天然結(jié)構(gòu)的形成,在變性劑含量降為中等濃度時,其(尿素和鹽酸胍)與蛋白質(zhì)的結(jié)合力也降低,因此,蛋白質(zhì)分子開始重新折疊。因此,它有可能通過調(diào)節(jié)鹽酸胍和尿素的濃度來調(diào)節(jié)其與蛋白的結(jié)合力,以至于使復(fù)性過程更加有效。這種情況不包括洗滌劑在內(nèi)。洗滌劑與蛋白的結(jié)合力決定于其臨界膠團(tuán)濃度(CMC)的大小。這種膠團(tuán)結(jié)合往往在臨界膠團(tuán)濃度之上,即變性非折疊蛋白溶解性好的條件下發(fā)生,而這種膠團(tuán)結(jié)合不能或者很少能在臨界膠團(tuán)濃度之下,即蛋白溶解性差的條件下發(fā)生[2]。

    這表明,只有在洗滌劑存在的條件下,蛋白復(fù)性過程才能發(fā)生,否則,去除洗滌劑后,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和溶解度又將形成原包涵體。

    2 蛋白復(fù)性

    復(fù)性過程是蛋白質(zhì)構(gòu)象從展開狀態(tài)到折疊狀態(tài)的變化過程。包涵體只能由強(qiáng)變性劑溶解,使其蛋白質(zhì)呈展開狀態(tài),其溶解程度主要取決于蛋白質(zhì)本身及其所使用的變性劑類型。包涵體經(jīng)過變性劑溶解后的蛋白質(zhì)為高度可溶性。與純化的蛋白復(fù)性研究不同,包涵體溶解蛋白含有蛋白表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的雜質(zhì),其可能干擾蛋白質(zhì)的復(fù)性。因此,為了減少雜質(zhì)對復(fù)性過程的干擾,可以先對該蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。

    以下,我們分別描述了這兩個參數(shù),但在復(fù)性過程中,應(yīng)結(jié)合這兩個參數(shù)尋求最佳優(yōu)化條件。首先,我們討論減少變性濃度的各種方式。

    2.1 分步透析復(fù)性

    該透析方法來降低變性劑濃度已成功應(yīng)用于抗體蛋白的復(fù)性[3,4]。首先將展開蛋白樣品置于高濃度變性劑溶液中,然后置于中等濃度的變性劑緩沖液中,最后置于低濃度變性劑緩沖液中。其與一步透析的區(qū)別在于每個變性劑濃度平衡的建立。然而,如果錯誤折疊或聚集率(kmis/agg)高于復(fù)性速率(kref)。那么這種方法將不起作用。

    2.2 遞減變性劑濃度透析

    為變性劑濃度遞減的一步透析法[5]。在高濃度變性劑中的變性蛋白裝入透析袋后置于變性劑溶液中,將透析液逐漸抽出,同時逐漸抽入復(fù)性緩沖液,透析過程中溶劑的泵出速率和復(fù)性液的泵入速率決定了變性劑濃度梯度減少。如果速度太快,它將類似于一步透析法,如果速度緩慢,它又類似于多步透析法。

    2.3 凝膠過濾交換法

    凝膠過濾柱在復(fù)性緩沖液中平衡。在變性液中的展開的蛋白質(zhì)上柱,用復(fù)性緩沖液進(jìn)行洗脫。使用脫鹽柱將使蛋白質(zhì)與變性劑分離,而使用按蛋白質(zhì)大小分離柱將分離得到不同片段大小的蛋白質(zhì)。在一次透析復(fù)性過程中,變性劑濃度逐漸遞減,同樣,在凝膠過濾法中變性劑濃度也逐漸減少。如果展開結(jié)構(gòu)或中間折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為天然結(jié)構(gòu)的速率慢于轉(zhuǎn)換為錯誤折疊或聚集體的速率,那么隨著變性劑濃度的逐漸降低錯誤折疊構(gòu)象將沒有足夠的時間轉(zhuǎn)換為天然結(jié)構(gòu)。另外,長時間暴露在中間變性濃度可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集或錯誤折疊。與透析的區(qū)別在于在其蛋白在折疊過程中柱模型所處的環(huán)境不同。在能夠防止蛋白錯誤折疊與聚集的中間變性劑濃度下的蛋白折疊過程中,凝膠柱可能通過氫鍵和疏水作用與蛋白相互作用。而且柱模型可以使蛋白分散,有效減少了蛋白聚集。該方法已經(jīng)成功應(yīng)用于鹽酸胍溶解的人白介素-6(IL-6)的復(fù)性[6]。

    2.4 稀釋

    高變性劑濃度蛋白質(zhì)樣品加入到大量的復(fù)性緩沖液中。稀釋法沒有經(jīng)過中間變性劑濃度,因此展開蛋白在稀釋過程中會迅速崩潰。所以,在稀釋復(fù)性過程中有幾個參數(shù)需要考慮。首先,在正常稀釋法中,將在變性劑中的展開蛋白加入到復(fù)性液中時,蛋白質(zhì)濃度與變性劑濃度都在增加,例如將6M鹽酸胍溶解的蛋白質(zhì)溶液加入到復(fù)性緩沖液中稀釋6倍后,復(fù)性緩沖液鹽酸胍濃度從0M變?yōu)?M。如果沒有低濃度變性劑濃度的存在,稀釋至緩沖溶液后將迅速崩潰形成一些剛性結(jié)構(gòu),而不再能進(jìn)行結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變以及不能轉(zhuǎn)換為天然結(jié)構(gòu)。因此,我們建議在最終應(yīng)該含有一定濃度的變性劑,濃度的大小主要取決于蛋白復(fù)性后的穩(wěn)定性。

    2.5 反稀釋

    反向稀釋是將復(fù)性緩沖液加入到含有一定濃度變性劑的展開蛋白質(zhì)溶液中,該情況下無論是變性劑和蛋白的濃度,都同時降低。與稀釋法不同,在中間濃度變性劑中蛋白質(zhì)濃度較高。這樣的條件下會導(dǎo)致蛋白的聚集和沉淀。然而,如果在中間的變性劑濃度的條件下,中間結(jié)構(gòu)為可溶和復(fù)性需要緩慢的結(jié)構(gòu)重排,這個方法可能比較適用。

    2.6 固相復(fù)性

    在變性劑存在的情況下,變性蛋白首先與固體基質(zhì)(如鎳樹脂或離子交換樹脂)以非共價結(jié)合。然后變性劑濃度減少為初始復(fù)性液濃度。由于蛋白質(zhì)分子與樹脂結(jié)合,該過程中減少了展開蛋白的聚集和折疊中間體的形成。

    2.7 小分子物質(zhì)助溶

    小分子物質(zhì)(溶質(zhì))通常被添加到復(fù)性溶劑中,以協(xié)助蛋白折疊。在一般情況下,特別是通過稀釋復(fù)性,復(fù)性溶劑中均含有低濃度的尿素或鹽酸胍。這個濃度是足夠低,以能保持高效復(fù)性,但高到足以維持折疊中間體的溶解度和靈活性。然而,僅有尿素或鹽酸胍是不夠的,共同的溶質(zhì)往往是必不可少的。沒有該小分子的存在,復(fù)性會產(chǎn)生不同程度的聚合或錯誤折疊。這種小分子物質(zhì)可分為兩種,一種為增強(qiáng)折疊,另一種為抑制聚集。

    折疊和聚集這兩種作用可能具有相互的排斥性,因?yàn)檎郫B的增強(qiáng)原則上增強(qiáng)了蛋白質(zhì)之間的相互作用,而聚集的抑制則降低了蛋白之間的的相互作用。聚集的抑制減少了折疊中間體的結(jié)合而不影響復(fù)性過程的進(jìn)行。它包括聚乙二醇[6],環(huán)糊精[7],精氨酸鹽酸[8,9],脯氨酸[10-11]。與聚乙二醇和環(huán)糊精結(jié)合的折疊中間體為疏水區(qū)域。在這些小分子物質(zhì)中,精氨酸鹽酸是最常用的。然而,目前尚不清楚,精氨酸鹽酸如何降低折疊中間體的聚集。但它對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響已經(jīng)很明確,精氨酸鹽酸是一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定,也不折疊增強(qiáng)。精氨酸鹽酸既不是一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑,也不增強(qiáng)蛋白的折疊。有許多極性小分子添加劑,提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[12-13],并能在體內(nèi)增強(qiáng)蛋白質(zhì)的折疊[14]。這些包括糖,多元醇,某些鹽類,如硫酸銨和氯化鎂,和某些氨基酸,如甘氨酸和丙氨酸。雖然這將提高蛋白質(zhì)折疊成一個緊湊的結(jié)構(gòu),他們也可增強(qiáng)錯誤折疊和聚合。這些倒塌的結(jié)構(gòu)可能是過于緊湊和剛性,無法使錯誤折疊的結(jié)構(gòu)重新折疊為天然結(jié)構(gòu)。

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