豬Ⅲ型干擾素結構及抗病毒研究進展

劉延亭 ，張美美 ，代發(fā)文，趙寶凱

（1. 北京大偉嘉生物技術股份有限公司 100091；2.滄州偉嘉畜牧有限公司 061199；3.樂山師范學院 614099；4.沈陽偉嘉牧業(yè)技術有限公司 110144 ）

干擾素（Interferon，IFN）是機體正常細胞在受誘生劑（包括病毒、細菌和某些化學合成物質）激發(fā)后產生的一類低分子量糖蛋白，它具有抗病毒、抑制細胞增殖、調節(jié)免疫及抗腫瘤作用[1-2]。干擾素根據(jù)其來源、功能和表面受體等的不同，可分為三大類：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型[3-4]。Ⅰ型干擾素由白細胞產生，抗病毒作用為主，免疫增強為輔。主要包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω；Ⅱ型干擾素由活化的T細胞和NK細胞產生，免疫增強為主，抗病毒作用為輔，只有IFN-γ；Ⅲ型干擾素是由上皮細胞和黏膜細胞產生，功能作用與Ⅰ型干擾素類似，抗病毒為主，主要是IFN-λ。目前，Ⅰ型和Ⅱ型干擾素的研究，特別是Ⅰ型，較為成熟與廣泛，包括抗病毒機理和抗病毒效果等，自從1987年開始，科學家用基因工程方法生產的Ⅰ型干擾素進入了工業(yè)化生產后，已有幾十個Ⅰ型干擾素產品投放到市場，廣泛應用到惡性腫瘤、亞急性重癥肝炎、肝纖維化（早期肝硬化）、感染與損傷性疾病、骨髓增生異常綜合癥、病毒性疾病、系統(tǒng)性硬皮病、異位性皮炎、風濕性關節(jié)炎等癥狀的治療當中。

干擾素具有高度的種屬特異性，故人的干擾素對動物無效，并且不同病毒、不同細胞對干擾素敏感性不同。Ⅲ型干擾素相對于Ⅰ和Ⅱ型而言發(fā)現(xiàn)的較晚，2003年，Sheppard等[5]人利用反向生物學原理鑒定出一組新型的白細胞介素IL-28A、IL-28B和IL-29，2004年，Dumoutier L等[6]在對其生物學功能進行進一步的研究后，將他們正式定名為Ⅲ型干擾素家族。人Ⅲ型干擾素基因結構與IL-10家族相似，但氨基酸水平上與干擾素更相似，分為3個亞型，Kotonko等[7]將其分別稱為IFN-λ1 （IL-29）、IFN-λ2（IL-28A）和IFN-λ3（IL-28B），IFN-λ4是在2013年才被Prokunina等[8]發(fā)現(xiàn)和定義。豬Ⅲ型干擾素的亞型不同于人，到目前為止，在豬身上只分離到IFN-λ1 和IFN-λ3兩種亞型[9]。Ⅲ型干擾素雖然發(fā)現(xiàn)較晚，但在人疾病治療中的應用研究速度較快，如在治療登革熱、慢病毒等方面取得了顯著進展，反觀動物Ⅲ型干擾素，近些年，相關研究雖已開展，但其研究的深度和廣度仍相當有限，且難以廣泛應用于臨床治療，包括豬Ⅲ型干擾素。鑒于現(xiàn)今非洲豬瘟等病毒在豬場的廣泛存在和嚴重威脅，Ⅲ型干擾素具有的在上皮細胞抗病毒及免疫調節(jié)上的特殊作用，以及對靶細胞的選擇性[10]和副作用小等優(yōu)勢就顯得尤為重要，因此探索豬Ⅲ型干擾素的抗病毒和免疫調節(jié)作用機制及其對豬病毒性疫病在實際治療上的深入研究至關重要。本文結合Ⅲ型干擾素的相關研究成果對豬Ⅲ型干擾素的結構特征、誘導和調節(jié)機制及抗病毒應用方面進行綜述，以期為后期豬病毒病的干擾素治療提供參考。

1 結構特征

IFN-λ細胞受體是異二聚體IL28R，由IFN-λ-1（IFNLR1）和IL-10亞單位β（IL-10RB/IL-10Rβ）構成[11-12]，豬IFN-λ位于豬14號染色體上[13]，豬IFN-λ1和IFN-λ3開放閱讀框分別有576和588個核苷酸，編碼191和195個氨基酸，N端分別含有19和23個氨基酸的信號肽。與Ⅰ型干擾素類似，成熟的IFN-λ具有4～5個短環(huán)連接螺旋構成的α螺旋結構。豬IFN-λ1和IFN-λ3分別有4和6個保守性半胱氨酸殘基，分子內形成2和3個二硫鍵，氨基酸潛在有1和2個糖基化位點，豬IFN-λ1預測是在56-68位上，豬IFN-λ3預測是在71-74和111-114位上，猜測N端糖基化位點可能與干擾素肽的成熟有關[9]。蛋白質水平上，豬IFN-λ1和IFN-λ3氨基酸同源性不到60%?；蚪Y構上，豬IFN-λs含有5個外顯子，1、3、5外顯子可能與螺旋結構的形成有關，在啟動子區(qū)域，存在幾個IFN調節(jié)因子結合區(qū)[14]。

2 病毒誘導和信號傳導途徑

IFN各型之間通過各自的信號傳導通路，產生干擾素誘導基因，抑制病毒復制與擴散、干擾腫瘤生長并調動機體的免疫調節(jié)功能發(fā)揮生物學作用。IFN-λ在細胞介導的信號傳導途徑與IFN-α等Ⅰ型干擾素類似，目前認為主要是JAKSTAT途徑。非受體性蛋白質酪氨酸激酶超家族中的Janus激酶（JAK）家族及信號轉導子和轉錄活化子（STAT）家族是細胞對Ⅰ型和Ⅲ型干擾素等細胞因子反應的一些基本蛋白質分子[15]。病毒感染動物機體后，被病原模式識別受體（PRRs），包括TIG-1樣受體（RLR）、Toll樣受體（TLR）及DNA識別受體Ku70識別，產生一系列活化物質，RLR通過定位于過氧化酶體和線粒體的線粒酶體抗病毒信號蛋白（MAVs），與TLR等共同刺激生產干擾素調節(jié)因子 （ IFRs） 和細胞核因子（NF-κB）等，進而激活產生IFN-λs。這其中，Ku70是一種新型的細胞內DNA識別受體，在人胚腎293細胞中，Ku70主要借助IRF1和IRF2來誘導IFN-λ的產生，對IFN-α等Ⅰ型干擾素無明顯影響[16]。產生的IFN-λs與細胞內受體IFNFR結合，包括IFN-λR1和IL-10Rβ，形成的復合物進而激活JAK1、JAK2和TYK2激酶，從而使STAT1和STAT2磷酸化，STAT1與STAT2磷酸化后再與第三個蛋白IFR9結合形成一個轉錄復合物，即干擾素刺激基因因子3（ISGF3），ISGF3促使ISG和其它能抑制病毒感染的效應因子表達，如Mx1、PKR，以及干擾素轉錄調節(jié)因子IFR1和IFR7，反過來，IFR1和IFR7又調節(jié)IFN-λs的表達。這其中，JAK2是STAT1磷酸化過程中必不可少的，JAK2在細胞中介導的抗病毒信號傳導只產生IFN-λs[17-20]。

3 分布和調節(jié)機制

與Ⅰ型干擾素受體在機體內廣泛分布有所不同，作為能夠特異性結合Ⅲ型干擾素的受體，IFN-λR1只在特定的細胞和組織中表達，尤其是上皮細胞豐富的組織，如胃腸道、泌尿生殖道等，一些免疫細胞也可以產生，如B細胞、巨噬細胞，而在造血系統(tǒng)（B細胞除外）和神經(jīng)系統(tǒng)則很少能檢測到[21-22]，IFN-λ具有的特有組織特異性生物學功能，可使IFN-λ應用于臨床治療中可能不會產生與IFN-α相似的造血系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)方面的副作用。上皮細胞中IFN-λ表達量高是因為其含有較多MAVs的過氧化物酶體。雖然上皮細胞產生較多的IFN-λ，但骨髓細胞仍然是受雙鏈RNA（Poly I:C）和病毒刺激產生IFN-λ最為豐富的組織[23]，除腸上皮細胞外，腸免疫細胞在受到Poly I:C刺激后，也能產生一定量IFN-λ。除了在表達量上的區(qū)別外，產生的干擾素種類也有差異，腸上皮細胞受到Poly I:C刺激，只能產生IFN-λ2和IFN-λ3，而腸免疫細胞還能產生IFN-α5和IFN-β[24]。

由于IFN-λ和IL-10共用IL-10Rβ受體，因此IFN-λ與IL-10家族中的細胞因子之間的相互關系就變得比較復雜。Jordan等[25]通過實驗證實，IL-10的阻斷抗體能夠增強IFN-λ的活性，相反，IL-10的存在能抑制IFN-λ活性，暗示兩者之間對IL-10Rβ可能存在一定的競爭關系。相應地，IL-22（通過IL-10Rβ和IL22Rα信號傳導）能夠增強IFN-λ的信號傳導和抗病毒活性[26]。盡管IFNAR和IL-10Rβ廣泛存在于許多細胞和組織，但IFNLR1多表達于上皮細胞[24]，這也就解釋為何IFN-λ能在上皮細胞中發(fā)揮重要的抗病毒作用。

Ⅰ型和Ⅲ型干擾素在轉錄水平上的調節(jié)機制并不相同，不同于Ⅰ型干擾素，如IFN-β，誘導需要AP1、IFR3、IFR7、NFκB等多因子的結合才能啟動，Ⅲ型干擾素只需要IFR3、IFR7和NFκB三者即可啟動誘導反應，且IFRs和NFκB獨自發(fā)揮作用也可以誘導IFN-λs產生，該發(fā)現(xiàn)能夠直接或間接說明，動物機體受到病原感染后，更容易啟動IFN-λs應答，不易受到其他因素的干擾；同時由于需要較少的轉錄因子參與，IFN-λs比其他類型干擾素也更容易被誘導產生；二是作為IFR家族中第一個被鑒定出來的IFR1，是所有類型干擾素必需的結合位點。IFR1被認為在抗病毒應答中具有極其重要的作用，同干擾素發(fā)揮功能不可分割。最新的研究證明IFR1并不能誘導產生IFN-β，但的確可以在對RNA病毒應答過程中控制Ⅲ型IFN的表達[19,27-31]。

4 抗病毒應用

IFN-λ可以在胃腸道、呼吸道、生殖道等上皮細胞豐富的組織誘導多種抗病毒蛋白的表達，因此關于IFN-λ的抗病毒研究也主要著重在此。對豬而言，研究人員研究的對象主要集中在豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）、豬輪狀病毒（Porcine Rotavirus，PoRV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV）、豬口蹄疫（Food and Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV）等，這其中對PEDV的研究最為深入和廣泛，研究表明豬Ⅲ型干擾素在粘膜表面發(fā)揮著Ⅰ型干擾素不可替代的作用。

4.1 豬流行性腹瀉病毒

PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，能引起仔豬和育肥豬急性腸道傳染病，即流行性腹瀉病。該病可發(fā)生于任何年齡的豬，年齡越小，癥狀越重，死亡率高。病毒存在于腸絨毛上皮細胞和腸系膜淋巴結，隨糞便排出后，污染環(huán)境、飼料、飲水、交通工具及用具等而傳染。隨著我國豬瘟、偽狂犬等重大疫病的免疫穩(wěn)定，豬流行性腹瀉病、豬繁殖與呼吸綜合征與非洲豬瘟逐漸成為威脅豬場健康的最主要的三個疫病。以PEDV為模型，在研究豬Ⅲ型干擾素的抗病毒活性及抗病毒機制方面，我國科學家已走在世界前列。

Haiyan等[32]研究人員首先驗證了豬IFN-λ3對PEDV的抗病毒效果。他們通過基因重組的方式獲得表達豬IFN-λ3的原核重組融合蛋白，經(jīng)鎳柱純化后，與Vero E6細胞作用，發(fā)現(xiàn)：在PEDV CV777株感染前用重組蛋白處理的細胞組，抗病毒效果最好，其次為病毒與重組蛋白同時作用細胞組，病毒感染后再用重組蛋白處理細胞，對病毒的抑制效果最差。同時，試驗人員用不同含量的重組蛋白前處理細胞，結果顯示，當重組蛋白濃度為100ng/mL時，幾乎能完全抑制PEDV的復制。

Lin L等[33]通過免疫熒光和熒光定量PCR試驗證明，重組的豬IFN-λ1和IFN-λ3均能在Vero E6細胞和豬腸上皮細胞系J2（IPEC-J2）上對PEDV病毒表現(xiàn)出較強的抗病毒活性，包括PEDV的G1型（CV777毒株）和G2型（LNCT2毒株）。但兩種亞型的IFN-λ在抗病毒特性上存在一定的差異，IFN-λ1的抗病毒活性主要體現(xiàn)在感染早期的抗病毒感染，它在IPEC-J2細胞上對PEDV的抗病毒活性要比IFN-λ3弱的多，特別是對G2型LNCT2病毒。相對于IFN-α，IFN-λ的兩個亞型在抑制PEDV病毒感染增殖方面表現(xiàn)理想，具體表現(xiàn)在IFN-λ在IPEC-J2細胞上能夠比IFN-α誘導產生更多的ISGs（特別是ISG15、OASL和MxA），IFN-λ3還能夠誘導產生較高含量的IFITM3。

Mingzhi Z等[34]證明，在腸道上皮細胞（IPEC-J2），無論是mRNA水平還是蛋白質水平，IFN-λ1比IFN-α能誘導產生更強烈和持續(xù)的ISG上調。在mRNA水平上，IFN-λ1能刺激產生132個ISG基因，而IFN-α只產生42個；在蛋白質水平，IFN-λ1能刺激產生47個ISG蛋白，而IFN-α只產生8個。特別是ISG15，USP18，OASL和 RSAD2，研究人員通過RTPCR試驗證明，在IFN-λ1誘導后3～24h，就能產生持續(xù)性表達上調，而通過功能分析表明，ISG15和RSAD2對PEDV的感染抑制具有劑量依賴性。

在IFN-λ在動物機體內抑制PEDV增殖的過程中，PEDV也在形成自己的逃逸機制?？茖W家在進行PEDV如何逃避先天免疫的研究中，發(fā)現(xiàn)PEDV NSP1蛋白阻斷了IRF1的核異位、降低過氧化物酶體的數(shù)量來逃避Ⅲ型干擾素的免疫應答[35]。Xufang D等[36]還發(fā)現(xiàn)冠狀病毒核糖核酸內切酶是一類重要的毒力因子，在上皮細胞中能顯著抑制豬Ⅰ型和Ⅲ型干擾素的應答。

4.2 豬輪狀病毒

輪狀病毒是人畜共患腹瀉病的重要病原之一。輪狀病毒感染能侵害人類和許多種畜禽，不僅感染率高，有時發(fā)病率也相當高，對人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展都有較大的危害。董波等[37]對2014～2017間來自閩西地區(qū)規(guī)?；i場的173份腹瀉病例進行了PoRV的實驗室診斷，發(fā)現(xiàn)2014～2017年間PoRV的陽性率分別為22.22%、30.90%、23.80%、2.70%。尹寶英等[38]對2018年陜西162腹瀉樣品進行了PoRV的樣品檢測，陽性檢出率為9.48%。

殷玥等[39]首次應用PoRV為模型，研究豬III型干擾素對其的抗病毒活性及機理。他們通過克隆藏豬IFN-λ3成熟肽基因，構建原核表達載體 pET-32a（+）-mZPoIFN-λ3，成功表達了藏豬IFN-λ3重組蛋白，該重組蛋白經(jīng)親和層析純化，比活性能約2×103.0IU/mg。將原核表達產物以不同的劑量預處理IPEC-J2細胞和MA104 細胞24h后，再接種0.1MOI輪狀病毒SC-R株，于接種后不同時間收集細胞懸液。qPCR 檢測樣品中VP6基因的 mRNA水平。結果顯示不同劑量的原核表達產物在病毒接種IPEC-J2細胞和MA104細胞后均能有效地抑制SC-R株的增殖，并呈現(xiàn)一定的劑量和時間依賴，且低濃度IFN-λ3（100ng/mL和10ng/mL）在IPEC-J2細胞的抗輪狀病毒活性顯著強于在MA104細胞的活性，高濃度（1000ng/mL）則差異不顯著。同時研究人員為了證實IFN-λ3和IFN-α聯(lián)合應用能否增強抗PoRV活性，將重組IFN-λ3和IFN-α以不同劑量單獨或聯(lián)合應用預處理IPEC-J2細胞，再接種SC-R株病毒，收獲細胞液，測定病毒滴度。結果顯示所有劑量二者聯(lián)合應用均沒有IFN-λ3單獨應用抑制SC-R株增殖的活性強。為探究其中機制，相對熒光定量測定下游抗病毒蛋白 MxA、OASL和ISG15轉錄情況，發(fā)現(xiàn)單獨使用IFN-λ3誘導的下游抗病毒蛋白轉錄均高于二者聯(lián)合應用。

4.3 豬繁殖與呼吸綜合征病毒

豬繁殖與呼吸綜合征的病原體為動脈炎病毒屬的成員，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，易變異，雖然現(xiàn)在市場上對于該病防控的疫苗種類眾多，但在安全性、有效性方面都存在或多或少的問題。Sang等[40]利用肺泡巨噬細胞（PAM）和MARC-145兩種細胞研究了豬IFN-λs對PRRSV的抑制和保護效果。他們用含不同量的IFN-λs多肽處理細胞，然后接種病毒，發(fā)現(xiàn)：0.1ug/mL的豬IFN-λ1和IFN-λ3在PAM細胞上能分別產生40%和20%的保護，而同一條件下，IFN-a1能產生80%的保護；在MARC145細胞上，0.01μg/mL的豬IFN-λ1就能對PRRSV產生接近完全的保護，與IFN-β效果類似，同一濃度下豬IFN-λ3只能提供約20%的保護。Dang等[41]人利用原核表達載體克隆構建了豬IFN-λ1（IL-29）重組蛋白，測得的生物學活性約1.8×103.0U/mL，他們用該制備的不同劑量的重組IFN-λ1感作MARC145細胞，再接種CH-1a株PRRSV，收集不同時間段的培養(yǎng)上清液，通過病毒滴度測定和熒光定量PCR檢測，證明50U作用劑量的IFN-λ1對PRRSV能產生約60%的抑制，當200U作用劑量時，PCR幾乎都檢測不到RNA存在，證明該劑量下能對PRRSV產生約100%的抑制，以及該抑制作用具有劑量依賴性。

豬IFN-λ1作為PRRSV DNA疫苗佐劑也有相關研究，Luping D等[42]通過將豬IFN-λ1與PRRSV GP5蛋白融合構建DNA疫苗，免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，IFN-λ1能顯著增強小鼠的體液和細胞免疫應答，能產生更強的中和抗體和IFN-γ表達水平。

4.4 豬口蹄疫

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的，發(fā)生于牛、羊、豬等偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織將口蹄疫列為動物A類烈性傳染病，嚴重危害畜牧業(yè)的健康發(fā)展以及相關產品的對外貿易，對國家的政治、經(jīng)濟具有深遠的影響。Perez-Martin等[43]研究人員通過實驗證明，豬IFN-λ3在預防豬FMDV時也能發(fā)揮非常重要的作用。他們利用人腺病毒5型重組構建了表達豬IFN-λ3的Ad5-PoIFN-λ3載體，免疫10頭豬，結果顯示：相對于對照組，免疫組有7頭豬無FMDV癥狀或病毒血癥，另外3頭表現(xiàn)出溫和或延遲的臨床癥狀；基因分析顯示，Ad5-PoIFN-λ3在豬腸上皮細胞能誘導產生較強的ISGs，而在外周血淋巴細胞中誘導的ISGs非常有限。

另外，Dang等[41]人利用原核表達載體克隆構建的豬IFN-λ1（IL-29）重組蛋白，對豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）的抑制效果進行了研究，結果表明，重組IFN-λ1在對PK15細胞50U、100U和200U的劑量作用下，PRV在PK15中形成的蝕斑數(shù)分別減少42%、56%和71%，證明重組IFN-λ1對PRV也具有相當好的抑制作用，抑制效果與劑量相關性明顯。對Ⅲ型干擾素的體外藥代學實驗也顯示，使用IFN-λ及IFN-α/-β分別作用HaCat細胞后，IFN-λ誘導ISGs產生和衰減緩慢，而IFN-α則非常迅速[44]。這提示，Ⅲ型干擾素比Ⅰ型干擾素發(fā)揮更加長效持久的生物學功能。

先天免疫反應是動物機體抵御病毒入侵的第一道防線，干擾素，包括Ⅰ型和Ⅲ型干擾素就會被激活來抵御病毒的感染，它們是動物機體天然免疫反應的重要組成部分。Ⅲ型干擾素不同Ⅰ型干擾素的重要特點在于，Ⅲ型干擾素受體主要表達于上皮細胞豐富的黏膜組織，更容易直接暴露接觸病毒，引發(fā)快速、持續(xù)、低水平的局部免疫應答，在觸發(fā)主要由Ⅰ型干擾素介導的全身性免疫應答之前，發(fā)揮抗病毒作用，將病毒限定在局部區(qū)域，以減少由Ⅰ型干擾素引起的可能的炎癥反應。隨著近幾年，Ⅲ型干擾素在抑制人登革熱病毒、諾如病毒、SARS、中東呼吸綜合征、新冠病毒等方面表現(xiàn)出來的突出效果，Ⅲ型干擾素的研究已愈來愈受到科研人員的重視。