4D打印技術(shù)的醫(yī)學(xué)應(yīng)用與展望

黨競醫(yī)，朱東澤，劉鑫成，孫立國，張煜珅，張昭，范宏斌

空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院骨科，西安 710032

3D打印是指在計(jì)算機(jī)輔助控制下，采用噴射、擠壓、熔融、光固化等方式制造出三維實(shí)體物品的過程。與傳統(tǒng)的減材成型和組裝加工模式不同，3D打印采用逐層堆積的增材制造方法，可精確實(shí)現(xiàn)復(fù)雜構(gòu)件的“自由制造”，自20世紀(jì)80年代首次提出后便受到了廣泛關(guān)注并得到了迅速發(fā)展，為制造業(yè)帶來了革命性的變化[1]。然而，3D打印產(chǎn)品與傳統(tǒng)機(jī)加工產(chǎn)品的幾何結(jié)構(gòu)都不會(huì)隨時(shí)間發(fā)生形變，無法充分模擬人體組織的動(dòng)態(tài)演變[2]。鑒于此，為了充分模擬人體組織的動(dòng)態(tài)愈合和再生過程，研究人員提出4D打印的概念，有望為其靜態(tài)局限性提供可能的解決方案，即將“智能材料”通過3D打印技術(shù)制備成初次結(jié)構(gòu)產(chǎn)品，初次結(jié)構(gòu)可按照預(yù)先設(shè)計(jì)的形狀在特定條件刺激下發(fā)生折疊、彎曲、膨脹或收縮，并形成最終結(jié)構(gòu)。

1 4D打印概況

近年來新興起的智能材料逐漸應(yīng)用于3D打印，給3D打印技術(shù)注入了新的活力。由于智能材料可感知內(nèi)外部相關(guān)刺激并進(jìn)行適度響應(yīng)，可在時(shí)間軸上產(chǎn)生形變，突破了原有的靜態(tài)模式，滿足了人們對動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的需求，故而4D打印是在原有增材制造基礎(chǔ)上的進(jìn)一步發(fā)展，即4D打印是在3D打印的基礎(chǔ)上增加“時(shí)間”這一維度。2013年麻省理工學(xué)院的Tibbits[3]在美國TED大會(huì)上向與會(huì)者首次展示了4D打印技術(shù)：他將一根由3D打印制造出的多串繩狀PVC復(fù)合材料管置于水中，在“水刺激”的作用下復(fù)合管發(fā)生形變，由繩狀緩緩地形成“MIT”字樣。由此，4D打印進(jìn)入了人們的視野，其前瞻性和顛覆性的理念迅速吸引了大量研究者。

2 智能材料及其刺激因素

智能材料及其相應(yīng)的刺激因素是4D打印的關(guān)鍵。近年來，隨著新型智能材料及其刺激機(jī)制的研究進(jìn)展，響應(yīng)體內(nèi)外環(huán)境的4D打印技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日益受到關(guān)注。

溫敏性形狀記憶材料是4D打印的經(jīng)典材料。Miao等[4]以大豆油環(huán)氧化丙烯酸酯為材料打印出支持人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長的溫敏性形狀記憶支架，平展的樣品于37 ℃下預(yù)彎曲成U形，隨后降溫至-18 ℃，使其進(jìn)入臨時(shí)固定狀態(tài)；最后將樣品重新放置于37 ℃時(shí)，樣品可在1 min內(nèi)完全恢復(fù)初始形態(tài)，表明該樣品不僅具有良好的生物相容性，且可顯著提高干細(xì)胞的附著和增殖能力。用于治療支氣管軟化癥的打印支架已成功應(yīng)用于臨床。Zarek等[5]以甲基丙烯酸酯化聚己內(nèi)酯為材料，打印出一種遇熱可產(chǎn)生形變的形狀記憶氣管支架。該支架隨著局部溫度的升高而擴(kuò)張，并能很好地貼合人體缺陷的氣管。另外，體內(nèi)微環(huán)境的pH值改變也可誘發(fā)智能材料產(chǎn)生形變。癌變或炎癥部位的酸化、胃腸道pH值的差異使pH響應(yīng)材料用于抗癌藥物的可控釋放成為可能。Ramos等[6]證實(shí)了膠原蛋白和角蛋白的pH響應(yīng)性，前者在中性pH范圍內(nèi)溶脹度最小，而在弱酸性環(huán)境下溶脹度最大；后者在酸性環(huán)境下收縮成無序、塌陷的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而在堿性環(huán)境下發(fā)生溶脹。天然蛋白質(zhì)的這種pH響應(yīng)性已被用于研究藥物如阿霉素[7-8]、抗生素[9]的智能釋放，可用于治療腫瘤及預(yù)防感染。酶也是一種常見的刺激因素，采用酶響應(yīng)材料為載體，可實(shí)現(xiàn)藥物的精準(zhǔn)投遞。Hu等[10]以腫瘤侵襲時(shí)高表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶作為觸發(fā)因子，利用載藥水凝膠的酶降解作用，開發(fā)了自組裝水凝膠載體系統(tǒng)。該系統(tǒng)可通過控制藥物在體內(nèi)按需輸送，進(jìn)而調(diào)節(jié)與癌癥相關(guān)的各種細(xì)胞行為。另外，將細(xì)胞作為材料進(jìn)行打印是生物制造的革命性突破。Tang等[11]將細(xì)胞打印成環(huán)形結(jié)構(gòu)，利用細(xì)胞的自裝配特性，形成環(huán)狀血管移植物，證實(shí)了細(xì)胞打印用于血管化組織工程的可行性。

總之，合適的智能材料是4D打印的首要條件；作為觸發(fā)因子，刺激因素是實(shí)現(xiàn)智能材料形變的關(guān)鍵一環(huán)。智能材料與刺激因素相互作用是準(zhǔn)確控制形變過程的必要因素。

3 4D打印與醫(yī)學(xué)應(yīng)用

3.1 藥物遞送 靶向載藥系統(tǒng)由藥物及載體構(gòu)成，可定向按需輸送藥物。載體是一種可結(jié)合到特定部位并能在刺激條件下釋放藥物的智能材料。Ghosh等[12]以不同溶脹比的聚合物水凝膠為材料，制備出基于自折疊的口服給藥裝置。該裝置由背襯層、可折疊雙層和藥物包埋的粘結(jié)層組成。其中，可折疊雙層由聚甲基丙烯酸交聯(lián)形成的pH敏感層和聚甲基丙烯酸羥乙酯形成的非溶脹層組成，前者與液體接觸可發(fā)生折疊，顯著促進(jìn)黏液黏附，從而延長藥物在靶區(qū)停留的時(shí)間；后者作為擴(kuò)散屏障，可減少藥物在腸道中的泄露。目前該微型裝置已成功應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[12]。光敏材料的形變可被光刺激精確控制。Gupta等[13]利用光敏材料打印出一種用于腫瘤治療的核-殼結(jié)構(gòu)膠囊，藥物可裝載于核區(qū)，具有納米表征的等離子棒(AuNRs)裝載于殼區(qū)。通過特定波長的激光照射可使AuNRs溫度升高，間接對核區(qū)產(chǎn)生局部破壞，膠囊發(fā)生選擇性斷裂，藥物可選擇性釋放。此外，Zhang等[14]將Fe3O4納米顆粒與聚乙二醇(PEG)組合形成磁響應(yīng)材料，用于控制多柔比星的釋放。Trenfield等[15]打印出一種基于琥珀酸的聚合物，可用于藥物撲熱息痛的遞送。

關(guān)于藥物遞送的研究已取得了巨大進(jìn)展，與傳統(tǒng)給藥方式相比，智能載藥體系能夠靶向釋放藥物，從而減少藥物的毒副作用。目前的瓶頸問題是許多體內(nèi)環(huán)境的變化指標(biāo)(如血脂、血壓等)尚未找到相對應(yīng)的智能材料。因此，4D打印智能材料在藥物遞送中的研究有待進(jìn)一步深入開展。

3.2 生物支架 目前組織工程已涉及現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)的多個(gè)方面。支架是組織工程的重要組成部分，智能材料的4D打印為生物支架的設(shè)計(jì)和應(yīng)用開辟了新的路徑。Jamal等[16]以不同分子量的PEG為材料制備出雙層水凝膠支架并對細(xì)胞進(jìn)行封裝，利用不同分子量的PEG層在水中膨脹比的差異實(shí)現(xiàn)支架的自動(dòng)折疊。利用該特性，細(xì)胞負(fù)載支架可自動(dòng)彎曲成不同半徑的圓柱體。經(jīng)試驗(yàn)，接種于該支架上的細(xì)胞8周后存活率高達(dá)90%。Senatov等[17]以聚乳酸(PLA)和羥基磷灰石(HA)為材料，打印出一種具有形狀記憶功能的多孔骨支架，對其熱學(xué)性能、力學(xué)性能、形狀記憶效應(yīng)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該支架的形狀記憶恢復(fù)率高達(dá)98%，可作為自體植入物用于修復(fù)較小的骨缺損。另外，考慮到人體結(jié)構(gòu)的納米特點(diǎn)，Zhu等[18]以石墨烯納米薄片為材料打印了神經(jīng)支架模型，石墨烯可從近紅外照射中吸收光子，引發(fā)支架的自我變形并調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的生物學(xué)行為。

智能材料4D打印支架仍面臨諸多挑戰(zhàn)：(1)打印支架形變的有限性使其無法充分模擬人體微環(huán)境的動(dòng)態(tài)演變過程；(2)支架置入引起的宿主炎癥反應(yīng)可影響工程組織的構(gòu)建且直接干擾種子細(xì)胞的主要生物學(xué)功能。

3.3 組織自愈 自愈是生物體內(nèi)普遍存在的現(xiàn)象[19]。為模擬天然生物材料的自愈特性，近年來研發(fā)出了多種能夠修復(fù)內(nèi)外部損傷的自愈性聚合物。Lai等[20]報(bào)道了一種在體溫作用下可發(fā)生形變的自愈聚合物，并設(shè)計(jì)了具有永久共價(jià)交聯(lián)和豐富弱氫鍵的聚合物網(wǎng)，共價(jià)交聯(lián)用于保持原有形狀，弱氫鍵用于產(chǎn)生臨時(shí)形狀。采用這種方法制備的聚合物薄膜在37 ℃(體溫觸發(fā))下可從黏性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閺椥誀顟B(tài)，且具有優(yōu)異的力學(xué)性能和高效的室溫下自愈能力。室溫下將樣品切割成完全分離的兩半，隨后將分離的斷裂面重新接觸，材料斷端于25 ℃下發(fā)生愈合并可拉伸到原始長度的200%，移除外力后，由于其形狀記憶特性，樣品以較小的殘余應(yīng)力恢復(fù)到初始長度。此外，功能凝膠與人體軟組織的結(jié)構(gòu)功能相似，其固有的損傷后自我修復(fù)特性充分地展現(xiàn)了其潛在的應(yīng)用價(jià)值。Dong等[21]基于殼聚糖-苯胺四聚體(CS-AT)與聚乙二醇之間的亞胺鍵合成了導(dǎo)電自愈性水凝膠。該水凝膠的電導(dǎo)率范圍與心臟組織相近，提示其在心臟修復(fù)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。CS-AT的氨基基團(tuán)帶有正電荷，具有強(qiáng)大的抗菌能力(尤以大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌為著)。上述特性表明水凝膠具有強(qiáng)大的損傷修復(fù)能力。然而，水凝膠迅速降解的特性給打印體的完整性帶來了挑戰(zhàn)，如何延緩其降解速率有待進(jìn)一步研究。3.4 器官打印 將細(xì)胞納入4D打印中，人們創(chuàng)造了更具仿生行為的直接生物打印技術(shù)。該技術(shù)通過控制不同種類細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的分布，構(gòu)造出與人體高度相似的仿生組織。目前，細(xì)胞4D打印技術(shù)主要用于模擬制造可供臨床移植的組織和器官。Park等[22]使用4D打印技術(shù)制備了人工內(nèi)分泌胰腺(BEAP)，由一系列經(jīng)熱刺激而發(fā)生自組裝的多面體膠囊組成。4D打印技術(shù)可將胰腺β細(xì)胞封裝于多面體膠囊內(nèi)，通過精確控制膠囊孔徑來控制膠囊內(nèi)外擴(kuò)散的分子類型。經(jīng)測定，BEAP能夠釋放胰島素，且釋放量可通過患者的血糖水平而智能調(diào)節(jié)。與傳統(tǒng)組織工程中將細(xì)胞接種于可降解支架相比，該技術(shù)克服了細(xì)胞難于長入支架深部空間的問題，且構(gòu)建了有生物活性的材料體系。

盡管細(xì)胞打印技術(shù)在組織器官重建方面的可行性得到了驗(yàn)證，但由于人體組織器官的復(fù)雜性和精確性，該技術(shù)仍需克服許多問題：(1)組織器官功能的模擬對細(xì)胞的排列方式提出了更高的要求，4D打印空間分辨率有限，尚無法達(dá)到對單個(gè)細(xì)胞的精準(zhǔn)控制；(2)智能材料的生物相容性有待進(jìn)一步提高，細(xì)胞4D打印器官移植到人體面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

3.5 人工血管 血管是維持組織器官功能的主要通道，通過提供營養(yǎng)、輸送氧氣、清除廢物來支持全身細(xì)胞功能。脈管系統(tǒng)的打印是構(gòu)建復(fù)雜組織器官的重要基礎(chǔ)，一般認(rèn)為，質(zhì)量擴(kuò)散僅能對100～200 μm范圍內(nèi)的組織提供有效支持[23]，在沒有血管運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)的條件下，組織器官將無法發(fā)揮其特有功能，因此組織器官的血管化是一個(gè)迫切需要解決的重要問題。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，4D血管打印為解決這一挑戰(zhàn)提供了新方法。Moysidou等[24]將混合于水凝膠中的細(xì)胞球體打印成管狀血管移植物，管狀移植物內(nèi)的活細(xì)胞通過不同的信號(hào)分子產(chǎn)生相互聯(lián)系，并調(diào)整細(xì)胞球體在基質(zhì)中的位置。由于細(xì)胞的自黏附特性，離散的細(xì)胞球體緊密排列呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，球形顆粒細(xì)胞相互融合組裝，在細(xì)胞因子的激活下打印細(xì)胞迅速發(fā)生血管化，進(jìn)而構(gòu)建組織工程化血管，形成連接一致的管狀移植物。值得注意的是，Moysidou等[24]僅構(gòu)建了簡單的血管結(jié)構(gòu)，而天然血管包括三層細(xì)胞組織(成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞)，因此，為了進(jìn)一步構(gòu)建完整的管壁結(jié)構(gòu)，應(yīng)同時(shí)考慮三種類型的細(xì)胞。在血管移植物的管腔中涂覆內(nèi)皮細(xì)胞層是構(gòu)建完整管壁的常用手段[25]。內(nèi)皮細(xì)胞層具有減少血栓形成、防止堵塞的能力，且可確保血管移植物內(nèi)的血液長期流動(dòng)。Kolesky等[26]將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液涂覆到管狀血管移植物中以促進(jìn)內(nèi)皮化，48 h后，在打印移植血管的管腔中成功地形成了融合的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞層。

近年來，4D打印在人工血管支架材料及構(gòu)建模式等方面取得了重大突破，打印血管的生物性能逐漸得到優(yōu)化。然而，人工血管目前仍存在許多不足，管壁的內(nèi)皮化對打印技術(shù)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)提出了較高的要求，吻合口處的內(nèi)膜增生及血栓形成一直以來也是制約其成為移植物的核心問題。在構(gòu)建微血管方面，天然毛細(xì)血管和小靜脈的內(nèi)徑低至8～20 μm，因此需要足夠的分辨率進(jìn)行打印，4D打印的精確度不足與管腔通暢率較低使人工血管無法充分模擬人體血管。盡管生物打印技術(shù)在人工血管的制造方面表現(xiàn)出良好的生物相容性，但移植材料彈性不匹配、形變限制等問題仍是影響管腔通暢及移植血管長期有效的關(guān)鍵所在。

4 總結(jié)與展望

4D打印技術(shù)是一項(xiàng)革命性的實(shí)用工具，可使智能材料在獨(dú)特的仿生學(xué)基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)復(fù)雜構(gòu)件的自由形變，并強(qiáng)調(diào)在設(shè)計(jì)生物醫(yī)學(xué)設(shè)備時(shí)考慮人體動(dòng)態(tài)的組織愈合和再生過程[27]。然而，4D打印是在材料學(xué)、生物學(xué)、機(jī)械學(xué)和計(jì)算機(jī)學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展起來的交叉融合技術(shù)，受到相關(guān)學(xué)科發(fā)展的影響與制約。

目前，4D打印技術(shù)存在的主要問題包括：(1)現(xiàn)有的智能材料僅可進(jìn)行簡單的形變，而人體組織結(jié)構(gòu)的形變過程常復(fù)雜多樣，如血管適應(yīng)性收縮、胃腸蠕動(dòng)、心臟搏動(dòng)等，因此器官組織工程修復(fù)對支架形變的復(fù)雜度提出了更高的要求；(2)3D打印制造條件與智能材料性能的匹配需要進(jìn)一步研究，目前尚缺乏復(fù)雜智能材料構(gòu)件的有效制造方法；(3)多種智能材料在指定區(qū)域的精確沉積需要更高分辨率的打印設(shè)備，這是精確變形和對多種刺激反應(yīng)的必要條件；(4)在以智能材料為支架的4D打印中，當(dāng)打印支架發(fā)生變形后，其內(nèi)的細(xì)胞活性降低甚至死亡，尤其是以pH值變化和紫外線為響應(yīng)刺激時(shí)這一問題更為突出，因此如何提高4D支架上細(xì)胞的存活率是未來研究面臨的嚴(yán)峻問題[28]。

總之，4D打印技術(shù)為生物醫(yī)學(xué)打開了一扇探索新型組織工程技術(shù)的窗口，但目前尚處于起步階段，面臨著許多未知的挑戰(zhàn)。隨著對智能材料的不斷挖掘和響應(yīng)機(jī)制的不斷明確，相信4D打印的應(yīng)用前景必將非常廣闊。