具有生防潛力的枯草芽孢桿菌KC-1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

王晴，朱成誠，王欣悅，文雪，王文中，馬超，馬爽，王彥杰

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院/寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用重點實驗室，大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院克山分院）

植物病害是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素之一，如由多種真菌引起的穗臟?。―irtypanicle disease（DPD））導致水稻產(chǎn)量和品質嚴重損失[1]；水稻稻瘟病、白葉枯病和紋枯病更是嚴重影響著水稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)[2]。目前植物病害的防治主要是化學試劑防治、生物防治以及水肥控制等田間管理的防治方法[3-4]。其中生防菌[5]的研究成為熱點研究方向之一。近年來，國內外學者已經(jīng)篩選了不同種類的細菌、放線菌、真菌用于植物病害的防治[6-7]。芽孢桿菌（Bacillus）作為一種理想的植物病害生防微生物，其在控制病害，提高作物產(chǎn)量等方面表現(xiàn)出了顯著的應用前景[8-9]?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）是重要的生防菌之一[10]，它是一種嗜溫好氧、產(chǎn)芽孢的桿狀細菌，具有生長快、芽孢抗逆性強等特點[11]。王紅麗等[12]將枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis GLB191）和短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus GLB197）生防菌株單獨或混合接種，結果表明混合生防菌在田間防效試驗中對葡萄灰霉病有很好的防治效果，與化學藥劑無顯著差異，防效可達到70.02%?？莶菅挎邨U菌的有效菌數(shù)是枯草芽孢桿菌發(fā)揮作用的前提，也是進行擴大培養(yǎng)工業(yè)發(fā)酵的重要指標。通過優(yōu)化其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件能夠有效提高該菌株的活菌數(shù)[13]，葉碧霞等[14]優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件后的芽孢桿菌數(shù)目達到1.03×1010CFU·mL-1；饒犇等[15]通過Plackett-Burman 試驗、最陡爬坡試驗、中心組合設計和響應面分析對枯草芽孢桿菌進行優(yōu)化培養(yǎng)，優(yōu)化后比未優(yōu)化的芽孢數(shù)目提高了37%；劉寬博等[16]采用單因素試驗與正交試驗法對枯草芽孢桿菌C3 增菌培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，結果表明優(yōu)化后活菌數(shù)可達到7.1×1010CFU·mL-1，比優(yōu)化前提高了7.89 倍。

實驗前期分離篩選得到一株枯草芽孢桿菌KC-1，對病原菌進行拮抗試驗[17]發(fā)現(xiàn)該菌種對禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、鐮孢菌（Fusarium spp）、玉米鏈格孢（Maize Alternaria tenuis Nees）、稻梨孢（Piricularia oryzae）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）具有良好的拮抗作用，是一株具有開發(fā)潛力的枯草芽孢桿菌。在前期研究的基礎上，通過單因素試驗與正交試驗結合，對枯草芽孢桿菌KC-1 培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化，獲得最優(yōu)的培養(yǎng)基及最佳培養(yǎng)條件，提高KC-1 有效活菌數(shù)，為該菌后續(xù)的研究和開發(fā)應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌種

枯草芽孢桿菌KC-1 菌種由黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用重點實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

NB 培養(yǎng)基[18]：牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、葡萄糖1.0%、pH 值（7.2～7.5）；

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、瓊脂2.0%、蒸餾水1 000 mL、pH（7.2～7.4）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化和接種物的制備

將KC-1 接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)1～2 d。挑取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好的單菌落接種至液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，置于37 ℃，180 r·min-1恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)24 h 后，置于4 ℃冰箱作為接種物備用。

1.2.2 培養(yǎng)時間對菌體生長的影響

按照1.3.2 測定生長曲線。

1.2.3 培養(yǎng)基

成分和濃度的優(yōu)化試驗：

（1）碳源種類及濃度對KC-1 生長量的影響

分別選用0.5%的葡萄糖、D-果糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉為碳源，其他成分及添加量與NB 培養(yǎng)基相同，每種碳源設置3 個重復處理，培養(yǎng)條件為pH 值7.2，4%的接種量接種至培養(yǎng)基，置于37 ℃，180 r·min-1轉速搖床上培養(yǎng)12 h，平板菌落計數(shù)法測定其活菌數(shù)[19]。

在篩選獲得的最佳碳源基礎上，設置1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0% 5 個梯度濃度，其他成分及添加量不變，每種濃度設置3 個重復處理，培養(yǎng)條件為pH 值7.2，4%的接種量接種至培養(yǎng)基，置于37 ℃，180 r·min-1轉速搖床上培養(yǎng)16 h，每2 h 取樣，按照1.3.2 測定生長曲線，以最大活菌數(shù)確定最佳的碳源濃度。

（2）氮源種類及濃度對KC-1 生長量的影響

選取氯化銨（NH4Cl）、尿素、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨和硫酸銨6 種氮源分別為氮源，添加量均為1.0%，培養(yǎng)基其他成分及添加量不變，每種氮源設置3 個重復處理，培養(yǎng)條件、取樣方法、測定方法同最佳碳源的篩選試驗。

在篩選獲得的最適氮源基礎上，分別設置0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的6 種不同梯度濃度，其他成分及添加量不變，每種濃度設置3 個重復處理，培養(yǎng)條件、取樣方法、測定方法同最佳碳源的最優(yōu)濃度的篩選試驗。

（3）無機鹽種類及濃度對KC-1 生長量的影響

選取的NaCl、MgSO4·7H2O、Na2HPO4·NaH2PO4（1∶1）、K2HPO4·KH2PO4（1∶1）和FeSO4作為培養(yǎng)所需的無機鹽，添加量均為0.5%，培養(yǎng)基其他成分及添加量不變，pH 值7.2，每種無機鹽設置3 個重復處理，培養(yǎng)條件、取樣方法、測定方法同最佳碳源的篩選試驗。

在篩選獲得的最適無機鹽基礎上，設置濃度分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%及不添加無機鹽的處理，其他成分及添加量與基礎培養(yǎng)基相同，每種濃度設置3 個重復處理，培養(yǎng)條件、取樣方法、測定方法同最佳碳源的最優(yōu)濃度的篩選試驗。

（4）培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，確定碳源、氮源和無機鹽的種類，利用碳源、氮源和無機鹽三因素對菌體生長情況的影響，采用三因素五水平L25（53）的正交試驗，確定最佳培養(yǎng)基組合。正交試驗試驗因素和水平見表1，試驗布置見表2。培養(yǎng)方法同（1）。

1.2.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗

在裝有150 mL 優(yōu)化后培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中分別以接種量3%、4%、5%、6%、7%和8%接種，調節(jié)pH 值7.2～7.4，每種梯度設置3 個重復處理，在180 r·min-1轉速、37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)12 h 后，通過測定OD600確定最適接種量。

在裝有150 mL 優(yōu)化后培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，分別設置不同初始pH 值、不同培養(yǎng)溫度和不同搖床轉速，接種量均為4%，其他非單因素試驗培養(yǎng)條件和測定指標與接種量優(yōu)化試驗相同，每種處理設置3 個重復試驗。分別確定最適培養(yǎng)溫度、初始pH 值和搖床轉速。供試的培養(yǎng)溫度分別設置為28、31、33、37、40 ℃和43 ℃，初始pH 值設置為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0，搖床轉速設置為140、160、180、200 r·min-1和220 r·min-1。

1.2.5 優(yōu)化前后結果比較

將150 mL 優(yōu)化后的最適培養(yǎng)基裝入250 mL 錐形瓶中，在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，搖床培養(yǎng)12 h，平板菌落計數(shù)法測定其活菌數(shù)。將150 mL 未優(yōu)化液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基裝入250 mL 錐形瓶中，在預設培養(yǎng)條件下，搖床培養(yǎng)12 h，平板菌落計數(shù)法測定其活菌數(shù)。

1.3 測定方法

1.3.1 有效活菌數(shù)的測定

采用平板菌落計數(shù)法。

1.3.2 生長曲線的測定

將制備好的接種菌液以4%的接入量接種到裝有150 mL 培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，置于37 ℃，180 r·min-1搖床上恒溫振蕩培養(yǎng)，分別測定在培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 h 和24 h 時間點上的OD600值，設置3 次重復。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

碳源、氮源、無機鹽、培養(yǎng)溫度、pH 值、接種量以及搖床轉速對菌體生長影響實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并進行繪圖處理（圖中小寫字母a、b、c…代表組間差異顯著性），其他實驗數(shù)據(jù)均采用Excel 軟件對3 次重復試驗的結果進行求均值，同時進行繪圖處理。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)時間對菌體生長的影響

圖1 為枯草芽孢桿菌KC-1 的生長曲線，從圖1可見菌體生長量呈先升高后下降的趨勢，在12 h 時OD600值最高，達到1.884。

圖1 培養(yǎng)時間對菌體生長量的影響Fig.1 The effects of cultivate time on growth rate of bacteria

2.2 培養(yǎng)基成分和濃度的優(yōu)化

2.2.1 碳源種類及濃度對KC-1 生長量的影響

圖2 為不同碳源種類對KC-1 生長量的影響，不同組別間差異顯著，葡萄糖作為碳源時，KC-1 有效活菌數(shù)顯著高于其他碳源處理；圖3 為不同濃度的葡萄糖對KC-1 生長量的影響，隨著培養(yǎng)時間的延長，不同處理的有效活菌數(shù)均呈上升的趨勢，供試濃度為2.0%時，KC-1 有效活菌數(shù)顯著高于其他葡萄糖濃度處理。

圖2 碳源種類對KC-1 活菌數(shù)的影響Fig.2 The effects of kinds of carbon sources on the KC-1 viable count

圖3 葡萄糖濃度對KC-1 活菌數(shù)的影響Fig.3 The effects of glucose concentration on the KC-1 viable count

2.2.2 氮源種類及濃度對KC-1 生長量的影響

氮源主要作用是維持胞內需氮化合物的合成，如氨基酸、蛋白質和核酸[20]等。不同氮源對KC-1 生長量的影響有一定差異（圖4），有機氮作氮源的有效活菌數(shù)顯著高于無機氮，其中酵母粉的作用效果最優(yōu)。圖5 為不同濃度的酵母粉對KC-1 生長量的影響，不同處理的有效活菌數(shù)均隨培養(yǎng)時間的延長呈上升趨勢，在12 h 時開始趨于平緩，供試添加量中濃度為1.0%的處理有效活菌數(shù)顯著高于其他處理。

圖4 氮源種類對KC-1 活菌數(shù)的影響Fig.4 The effects of kinds of nitrogen sources on the KC-1 viable count

圖5 酵母粉濃度對KC-1 活菌數(shù)的影響Fig.5 The effects of yeast concentration on the KC-1 viable count

2.2.3 無機鹽種類及濃度對KC-1 生長量的影響

無機鹽在微生物生長過程中起著重要的作用[21]。不同無機鹽種類對KC-1 生長量影響如圖6，K2HPO4·KH2PO4（1∶1）作為無機鹽時菌體生長情況顯著優(yōu)于其他處理。圖7 為不同濃度的K2HPO4·KH2PO4（1∶1）對KC-1 生長量的影響，其中濃度為0.4%的處理有效活菌數(shù)顯著高于其他處理。

圖6 無機鹽種類對KC-1 活菌數(shù)的影響Fig.6 The effects of kinds of Inorganic salts on the KC-1 viable count

圖7 K2HPO4·KH2PO4（1∶1）濃度對KC-1 活菌數(shù)的影響Fig.7 The effects of K2HPO4·KH2PO4（1∶1）concentration on the the KC-1 viable count

2.2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗結果

L25（53）的變量及水平如表1 所示，表2 為25 個實驗組培養(yǎng)12 h 的OD600結果及極差分析，從極差R看出，此三因素對菌體生長影響的主次順序為酵母粉＞葡萄糖＞K2HPO4·KH2PO4（1∶1）；從吸光值可看出，19 號處理的組合最優(yōu)，兩表結合分析篩選得到培養(yǎng)基組合為葡萄糖2.50%，酵母粉1.25%和K2HPO4·KH2PO4（1∶1）0.3%。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table

表2 正交試驗設計及結果Table2 Orthogonal design and results

續(xù)表2 正交試驗設計及結果Continued table 2 Orthogonal design and results

2.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)溫度對KC-1 生長量的影響結果

不同培養(yǎng)溫度對菌體生長的影響如圖8 所示，菌體生長量隨溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，37 ℃時菌體生長量最高。

圖8 溫度對菌體生長量的影響Fig.8 The effects of temperature on bacteria growth

2.3.2 初始pH 值對KC-1 生長量的影響結果

不同初始pH 對菌體生長量的影響如圖9 所示，初始pH 值為5.0 時菌體生長量最高，且初始pH 值為4.0、8.0、9.0 和10.0 時菌體生長均受到抑制，說明在過酸或過堿環(huán)境下，均不利于菌體的生長。

圖9 初始pH 值對菌體生長量的影響Fig.9 The effects of initial pH value on bacteria growth

2.3.3 接種量對KC-1 生長量的影響結果

不同接種量對KC-1 生長量的影響如圖10，接種量小于7%時，菌體生長量呈上升趨勢，接種量為7%時菌體生長量達到最大值，接種量過高不利于菌體生長。

圖10 接種量對菌種生長量的影響Fig.10 The effects of inoculation amount on bacteria growth

2.3.4 搖床轉速對KC-1 生長量的影響

不同搖床轉速對KC-1 生長量的影響見圖11，小于200 r·min-1時隨著轉速的增加，菌體生長量隨之增加，200 r·min-1時生長量顯著高于其他轉速。

圖11 轉速對菌體生長量的影響Fig.11 The effects of rotation speed on bacteria growth

2.4 優(yōu)化前后結果比較

將優(yōu)化后的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件同最初的液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基及預設培養(yǎng)條件相對照，優(yōu)化前活菌數(shù)在12 h 達到2.61×108CFU·mL-1，優(yōu)化后最適活菌數(shù)在12 h 達到4.29×108CFU·mL-1，比優(yōu)化前活菌數(shù)提高了1.64 倍。

圖12 優(yōu)化處理對KC-1 有效活菌數(shù)的影響Fig.12 The effects of optimization process on effective KC-1 effective viable count

3 結論與討論

目前，芽孢桿菌開發(fā)的生防菌劑和生物制劑應用廣泛，在農(nóng)業(yè)上的應用已取得了長足的進步，但在生產(chǎn)應用中仍存在一些如拮抗物質不耐貯存、熱穩(wěn)定性較差、不耐酸堿和在田間無法發(fā)揮穩(wěn)定有效的防治效果等問題[22]。因此，通過篩選、優(yōu)化、基因改造[23]等，生產(chǎn)出適用于田間具有廣譜效果的生防菌株還需加強研究[24]。試驗對枯草芽孢桿菌KC-1 基本培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基進行優(yōu)化，顯著提高了KC-1 有效活菌數(shù)，為KC-1 的培養(yǎng)優(yōu)化及利用提供科學的參考依據(jù)。通過繪制枯草芽孢桿菌KC-1 的生長曲線圖，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌的指數(shù)生長期是第2～12 h，在第12 h時枯草芽孢桿菌的生長開始趨于平緩，從而確定枯草芽孢桿菌的最適宜培養(yǎng)時間。為提高枯草芽孢桿菌KC-1 菌株有效活菌數(shù)，通過單因素試驗和正交試驗相結合的方法，對枯草芽孢桿菌KC-1 培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。

結果表明，優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分為2.50%葡萄糖，1.25%酵母粉和0.30%K2HPO4·KH2PO4（1∶1）；優(yōu)化后的最適培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37 ℃，初始pH 值5.0，接種量7%，搖床轉速200 r·min-1，培養(yǎng)時間為12 h。菌體培養(yǎng)達到37 ℃后，菌體生物量開始隨著溫度的升高而下降，是由于菌體內的酶為蛋白質，溫度過高使其失活導致活菌數(shù)下降；該菌種在pH 值為5.0～7.0 之間可以生長，最適為pH 值5.0，該菌的pH耐受范圍較小，只有在這個范圍中菌體才可生長。經(jīng)過優(yōu)化處理后，KC-1 在最優(yōu)培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件下，有效活菌數(shù)可達4.29×108CFU·mL-1，較優(yōu)化前提高1.64 倍。