超聲微泡介導(dǎo)微RNA治療肝細(xì)胞癌的研究進(jìn)展

鄒云雷，劉小慧，趙 云，劉朝奇，劉愛華*

(1.三峽大學(xué)腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443000；2.重慶市梁平區(qū)婦幼保健院超聲科，重慶 405200)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma， HCC)是臨床常見惡性腫瘤之一[1]。肝移植和外科手術(shù)是治療早期HCC的最佳選擇，但由于移植器官供體缺乏、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高，且多數(shù)HCC確診時(shí)已為晚期，導(dǎo)致僅有小部分患者獲益于上述治療方法。經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)為治療中期HCC最常用的方法[2]，但栓塞所致缺血性損傷及藥物非特異性毒性可能進(jìn)一步損傷肝功能。分子層面的靶向基因療法正在成為治療各期HCC的新策略，調(diào)控特異性微RNA(microRNA， miRNA)水平能控制HCC進(jìn)展[3]，可于超聲引導(dǎo)下將藥物或基因傳遞到靶器官。與傳統(tǒng)基因載體相比，超聲微泡用于傳遞非侵入性基因或藥物的安全性、穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)染效率均較高[4]，已有研究[5]將超聲微泡用于治療胰腺癌，并驗(yàn)證了其安全性及有效性。本文對(duì)超聲微泡介導(dǎo)的miRNA治療HCC研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 超聲微泡介導(dǎo)miRNA轉(zhuǎn)染機(jī)制

1.1 超聲空化效應(yīng) 超聲和微泡介導(dǎo)的空化通過聲穿孔在血管壁上產(chǎn)生短暫或永久性的孔而顯著增強(qiáng)ROI內(nèi)藥物濃度[6]?？栈?yīng)指微氣泡在高、低壓超聲波交替作用下產(chǎn)生的膨脹和收縮。微氣泡在聲場(chǎng)中穩(wěn)定振蕩，可見穩(wěn)定空化現(xiàn)象；微氣泡劇烈膨脹或崩塌時(shí)，即產(chǎn)生慣性空化現(xiàn)象。穩(wěn)定空化和慣性空化對(duì)鄰近組織施加機(jī)械力時(shí)，慣性空化的微泡潰滅導(dǎo)致額外的撞擊效應(yīng)，如沖擊波和液體噴射，進(jìn)一步增強(qiáng)超聲的空化效應(yīng)[7]。目前相關(guān)研究主要針對(duì)孤立環(huán)境中的單個(gè)微泡動(dòng)力學(xué)，卻很少關(guān)注體內(nèi)多個(gè)微泡及其與周圍環(huán)境的相互作用。微泡間的距離或微泡與邊界間的距離均可影響空化現(xiàn)象，距離較小時(shí)會(huì)限制微泡膨脹，從而減輕空化效應(yīng)。2個(gè)或多個(gè)膨脹的微氣泡可在高壓超聲下合并成單個(gè)微泡，稱為融合微氣泡；這種空化會(huì)產(chǎn)生更大的機(jī)械力并導(dǎo)致更大的孔徑，但也可能增加組織損傷范圍[8]。

1.2 腫瘤的高通透性和滯留效應(yīng) 與正常組織相比，惡性腫瘤血管系統(tǒng)滲透性更強(qiáng)、內(nèi)皮細(xì)胞間隙更寬，淋巴引流不暢且靜脈回流緩慢，有助于滲透納米級(jí)物質(zhì)，增加藥物在血管外空間滯留或積聚時(shí)間；這種高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect， EPR)介導(dǎo)的累積稱為被動(dòng)靶向，10～200 nm粒徑納米粒子可通過這種方式積聚于腫瘤部位，超聲成像所用納米級(jí)微泡、納米液滴(nano droplets， ND)的作用原理亦如此[9]。

2 超聲微泡介導(dǎo)miRNA轉(zhuǎn)染的遞送方式

微泡介導(dǎo)miRNA的主要遞送方式為微泡與miRNA不耦聯(lián)遞送、miRNA或miRNA基因裝載于微泡內(nèi)或微泡殼。微米級(jí)微泡僅能到達(dá)血管，卻無法向周圍腫瘤組織滲透，故需采用微泡與miRNA不耦聯(lián)遞送方式，另將miRNA或編碼miRNA的基因裝載于其他載體。質(zhì)粒是最常用于構(gòu)建表達(dá)miRNA基因的載體之一，但循環(huán)過程中載有基因的質(zhì)粒極不穩(wěn)定，可被血清中的核酸內(nèi)切酶分解。聚乳酸-聚乙醇酸納米粒(poly lactic-co-glycolic acid nanoparticles， PLGA-NP)通過超聲穿孔進(jìn)入血管外腔室，被腫瘤細(xì)胞迅速內(nèi)吞后，在細(xì)胞內(nèi)緩慢釋放miRNA，可獲得持續(xù)治療效果[10]，且具有良好的生物相容性和降解性，是臨床所用最有效的聚合物藥物遞送載體之一[11]。采用親水分子如聚乙二醇修飾PLGA-NP表面可延長(zhǎng)其循環(huán)時(shí)間。CHOWDHURY等[12]發(fā)現(xiàn)載有miRNA的PLGA-NP粒徑多為100～150 nm，封裝率可達(dá)70%；即使在極高濃度下，均未見PLGA-NP對(duì)癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒性。

另一方面，將miRNA或miRNA基因裝載于微泡內(nèi)或微泡殼的裝載技術(shù)較為復(fù)雜，目前用于遞送miRNA至HCC細(xì)胞的微泡載體主要為相變陽離子ND及納米級(jí)陽離子脂質(zhì)微泡。ND具有微泡聲學(xué)特性，體內(nèi)循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)，且靶向性、安全性和穩(wěn)定性均較高。ND粒徑<400 nm，可經(jīng)EPR外滲至周圍腫瘤組織，并在循環(huán)中保持納米級(jí)液態(tài)，直至被超聲觸發(fā)聲波液滴汽化轉(zhuǎn)變成微泡。GUO等[13]以超聲觸發(fā)相變且粒徑改變的ND遞送miR-122至HCC細(xì)胞，顯著提高了基因遞送效率。納米級(jí)陽離子脂質(zhì)微泡粒徑<1 μm，氣泡殼主要為脂類物質(zhì)，微泡內(nèi)填充氟烷乳劑或氟烷氣體。載miRNA基因的質(zhì)?？赏ㄟ^靜電作用吸附于微泡殼。載質(zhì)粒納米微泡可被動(dòng)靶向腫瘤組織，由EPR介導(dǎo)滯留于腫瘤的時(shí)間更長(zhǎng)，且納米微泡易與組織中微氣泡結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)其聲學(xué)特性和檢測(cè)敏感度。

3 超聲微泡介導(dǎo)miRNA應(yīng)用于HCC

3.1 miR-122/反義miR-21 miR-122在各階段HCC均顯著下降，因此上調(diào)miR-122可能減緩腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，提高腫瘤對(duì)阿霉素的敏感度[14]。相反，miR-21在HCC中高表達(dá)，以反義miR-21沉默miR-21可抑制HCC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，同時(shí)減輕其耐藥性[15]。CHOWDHURY等[12]將miR-122、反義miR-21分別載入PLGA-NP并經(jīng)尾靜脈注射于小鼠體內(nèi)，通過超聲成像引導(dǎo)超聲聚焦輻照小鼠一側(cè)皮下肝癌移植瘤，發(fā)現(xiàn)多次重復(fù)治療效果優(yōu)于單次治療，且聯(lián)合應(yīng)用兩種互補(bǔ)的miRNA不僅可顯著縮小腫瘤體積、降低HCC細(xì)胞增殖、侵襲及遷移，還可提高腫瘤對(duì)阿霉素的敏感度。

WISCHHUSEN等[16]觀察超聲微泡介導(dǎo)miR-122、反義miR-21對(duì)免疫活性的Hepa1-6同基因HCC小鼠模型的免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)超聲靶向微泡破壞(ultrasound targeted microbubble destruction， UTMD)聯(lián)合miRNA治療可引起短暫性細(xì)胞因子風(fēng)暴；miR-122和反義miR-21通過降低腫瘤的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子水平而調(diào)節(jié)腫瘤近端淋巴結(jié)中促癌因子IL-1α、IL-1β、IL-5、IL-6和抗腫瘤因子IL-2、IL-12水平，從而影響免疫微環(huán)境；UTMD局部靶向治療可明顯降低治療側(cè)和對(duì)側(cè)腫瘤淋巴結(jié)IL-12和IL-17濃度，提示局部治療引起了系統(tǒng)反應(yīng)。但該研究?jī)H觀察了UTMD介導(dǎo)miRNA釋放后24 h內(nèi)的細(xì)胞因子變化，為證實(shí)此類假設(shè)并了解反復(fù)治療后HCC免疫微環(huán)境的長(zhǎng)期變化，仍需對(duì)更多時(shí)間點(diǎn)及多種治療條件下進(jìn)行深入研究。除細(xì)胞因子譜外，免疫細(xì)胞群的特征也可能有助于了解該療法的免疫調(diào)節(jié)潛力。

3.2 miR-221/miR-199a miR-221高表達(dá)與HCC臨床分期、腫瘤包膜浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[17-18]。實(shí)驗(yàn)研究[19]證明miR-221高表達(dá)與索拉非尼耐藥相關(guān)。HCC患者miR-221與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitor， CDKN)1B/p27、CDKN1C/p57呈負(fù)相關(guān)，可通過靶向p27和p57啟動(dòng)腫瘤發(fā)生。GUO等[13]以超聲微泡將反義miR-221轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞(human hepatoma cells， Hep)——G2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CDKN1B/p27和CDKN1C/p57表達(dá)上調(diào)，HepG2凋亡增加。HCC患者miR-199a下降多提示預(yù)后不良。miR-199a可通過靶向低氧誘導(dǎo)因子-1a、分化簇44及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制HCC細(xì)胞增殖。此外，miR-199a可上調(diào)CDKNlB/p27和CDKN1A/p21抑制細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有學(xué)者[13]通過超聲微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染觀察反義miR-21、反義miR-221和miR-199a對(duì)HepG2細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)miR-199a可在最大程度上抑制細(xì)胞增殖。

3.3 叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3-miRNA 叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3(forkhead box p3， Foxp3)可調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells， Treg)的免疫抑制功能[20]。SHI等[21]通過UTMD介導(dǎo)的Foxp3-miRNA轉(zhuǎn)染Treg，以降低Foxp3，結(jié)果顯示Foxp3-miRNA可下調(diào)HCC模型小鼠Treg/T細(xì)胞比例、IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平，并上調(diào)IFN-γ及IL-2水平，提示其可在體外解除Treg對(duì)HCC的免疫抑制功能，通過增強(qiáng)免疫功能和抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子產(chǎn)生，抑制腫瘤生長(zhǎng)。目前尚不清楚UTMD介導(dǎo)的Foxp3-miRNA對(duì)免疫功能和腫瘤生長(zhǎng)的長(zhǎng)期影響，并需進(jìn)一步研究如何調(diào)控Treg細(xì)胞產(chǎn)生精確的免疫反應(yīng)及減少Treg細(xì)胞，以期增強(qiáng)對(duì)于腫瘤的免疫力，而不引起嚴(yán)重的自身免疫反應(yīng)。

3.4 抑制磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α(phosphoinositide 3-kinase catalytic subunit alpha， PIK3CA)基因的前體miRNA 編碼p110α蛋白亞基的PIK3CA與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。HCC患者生存率與PIK3CA表達(dá)水平相連緊密，HCC中PIK3CA表達(dá)高于非瘤肝組織[22]，因此，抑制PIK3CA表達(dá)對(duì)于治療HCC具有重要意義。DONG等[23]篩選出4種在HCC下調(diào)且抑制PIK3CA表達(dá)的miRNA(miR-139、203a、378a及422a)，并構(gòu)建了高表達(dá)載體(前體miRNA質(zhì)粒)，利用超聲觸發(fā)可相變的載質(zhì)粒ND，在體外通過聲穿孔傳遞基因治療荷瘤裸鼠，結(jié)果顯示前體miR-139和miR-378a可有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。目前應(yīng)用前體miRNA聯(lián)合超聲微泡治療HCC的研究較少。此外，一種前體miRNA可產(chǎn)生不止一種成熟的miRNA，例如miR-17-5p和miR-17-3p均來自同一前體miR-17，靶向位點(diǎn)卻不同，可能出現(xiàn)不可預(yù)想的結(jié)果，有待進(jìn)一步研究可控性和可行性。

3.5 miR-206聯(lián)合可溶性程序性死亡因子1 miR-206是強(qiáng)大的腫瘤抑制因子。結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分子細(xì)胞方法，WU等[24]發(fā)現(xiàn)miR-206可通過抑制肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體C-Met、細(xì)胞周期素D1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6表達(dá)而延緩3種不同Hep的細(xì)胞周期，誘導(dǎo)其凋亡及抑制增殖?？扇苄猿绦蛐运劳鲆蜃?(soluble programmed cell death 1， sPD-1)是腫瘤免疫治療的靶基因，通過阻斷程序性死亡因子1(programmed cell death 1， PD-1)/PD-1配體(PD-1 ligand， PD-L1)的相互作用而激活機(jī)體免疫系統(tǒng)。HCC中miR-206表達(dá)通常顯著降低，而靶基因C-Met表達(dá)增加。譚妍迪等[25]利用超聲介導(dǎo)載miR-206和sPD-1基因納米微泡治療小鼠H22肝癌皮下移植瘤，發(fā)現(xiàn)sPD-1與miR-206聯(lián)合治療可有效阻斷PD-1與PD-L1結(jié)合，上調(diào)干擾素-γ并下調(diào)PD-L1，解除T細(xì)胞的抑制，提高T細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞活性，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤作用；基因治療后，腫瘤組織中B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2， BCL-2)表達(dá)降低，BCL-2相關(guān)X蛋白(BCL-2 associated X， BAX)表達(dá)增加，以聯(lián)合治療后更為明顯。上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR-206可通過靶向C-Met促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡；miR-206與sPD-1聯(lián)合可更有效地阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路，表現(xiàn)出更好的抗腫瘤效果。

4 小結(jié)與展望

超聲微泡介導(dǎo)miRNA治療HCC相關(guān)研究雖已取得重大進(jìn)展，但在復(fù)雜多變的機(jī)體微環(huán)境中實(shí)現(xiàn)具有高診斷敏感度、高特異度和良好治療效果的靶向系統(tǒng)仍面臨諸多挑戰(zhàn)：①治療基因的定位和靶向傳遞是治療HCC的首要問題；②對(duì)超聲能量的安全強(qiáng)度、基因治療的復(fù)雜性和不良反應(yīng)及基因載體和微泡的毒性仍需深入研究；③既往研究采用的超聲參數(shù)、動(dòng)物模型和微泡濃度均有所不同，使得結(jié)果的可比性有限，亟需開發(fā)在治療期間可監(jiān)測(cè)聲學(xué)效應(yīng)、估計(jì)靶組織中傳遞藥物量的系統(tǒng)；④進(jìn)一步優(yōu)化微泡制備方法，提高其精度、可控性和重復(fù)性，以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。