牙齦卟啉單胞菌對不同組織來源血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用及機(jī)制的研究進(jìn)展

雷雙 庾靖君 唐曉琳

1.中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科 遼寧省口腔疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 沈陽110001；2.中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院牙周病科 遼寧省口腔疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 沈陽110001

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是重要的牙周可疑致病菌，是1 種革蘭陰性專性厭氧桿菌，在牙周組織附著嚴(yán)重喪失部位、深牙周袋部位檢出率較高。根據(jù)第四次全國口腔流行病學(xué)調(diào)查報告，牙周病作為口腔中常見病、多發(fā)病，發(fā)病情況呈現(xiàn)上升態(tài)勢[1]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，P.gingivalis不僅與牙周病密切相關(guān)，而且與動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）[2]、阿爾茲海默病（Alzheimer's disease，AD）[3]、帕金森疾病（Parkinson's disease，PD）[4]等多種全身性疾病關(guān)系密切，可能是加重疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[5]。根據(jù)全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome?wide association study，GWAS）研究，P.gingivalis感染條件下的失調(diào)宿主基因在AD 等認(rèn)知障礙疾病、糖尿病、心血管疾病等宿主基因中富集；此外，牙周炎組織或P.gingivalis感染巨噬細(xì)胞中失調(diào)基因與AD海馬組織或粥樣硬化斑塊中的失調(diào)基因相類似，說明牙周炎可能是全身疾病的致病因素之一[6]。有學(xué)者[7]采用多種口腔致病菌共同感染Toll 樣 受 體（Toll like receptors，TLR） 2?/?和TLR4?/?雙敲除小鼠后，發(fā)現(xiàn)在心臟、腎臟、肺、動脈等器官中檢測到口腔致病菌基因組DNA，提示口腔致病菌可以向全身組織器官內(nèi)播散。

血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，EC）位于血管內(nèi)壁，有利于血流移動，血小板功能及免疫功能。微生物利用宿主循環(huán)系統(tǒng)在體內(nèi)循環(huán)，通過EC 進(jìn)出血流。細(xì)菌等危險因素暴露可損傷內(nèi)皮細(xì)胞的防御機(jī)制，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性破壞，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)[8]，同時，內(nèi)皮細(xì)胞中的某些基因?qū)⒈患せ畈⒏淖兗?xì)胞的功能特性[9]。病原菌會促進(jìn)EC 衰老、凋亡并干擾其生物學(xué)屏障。本文就P.gingivalis 對不同組織來源血管內(nèi)皮細(xì)胞的可能作用及機(jī)制作一綜述。

1 P.gingivalis對外周心血管EC的作用研究

心血管疾病是一系列由遺傳和環(huán)境共同作用而引起的多因素慢性炎癥性疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的定義，心血管病是心臟和血管疾患引起的，包括冠心病、腦血管疾病、高血壓、周圍動脈血管疾病、風(fēng)濕性心臟病、先天性心臟病和心力衰竭。應(yīng)用核酸及抗原檢測方法在人類AS斑塊中已鑒定出多種病原體，包括肺炎衣原體、幽門螺桿菌、腸桿菌及多種口腔致病菌如P.gingivalis等，提示細(xì)菌可能是參與AS 的重要致病因素之一[10]。在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用P.gingivalis脂多糖（li?popolysaccharide，LPS） 感 染 載 脂 蛋 白E 基 因（ApoE?/?）敲除小鼠構(gòu)建疾病模型，發(fā)現(xiàn)由重度牙周病誘發(fā)的系統(tǒng)性炎癥會加速AS的形成，誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂并激活巨噬細(xì)胞[11]。以上結(jié)果說明，P.gingivalis感染與AS 關(guān)系密切，P.gingivalis與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用是AS斑塊形成和內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的重要病理基礎(chǔ)。

1.1 P.gingivalis與EC相互作用的毒力因子

P.gingivalis是牙周病的主要致病菌，其菌毛、莢膜多糖、LPS、膠原酶、牙齦蛋白酶、凝血素、脂蛋白等會損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，從而引起AS。細(xì)菌菌毛蛋白fimA 作為細(xì)菌表面主要毒力因子，有學(xué)者[12]檢測AS 斑塊樣本中不同fimA 基因型，發(fā)現(xiàn)fimA Ⅳ型、Ⅱ型檢出率明顯高于其他類型。LPS 作為P.gingivalis主要毒力因子，可通過調(diào)節(jié)肌動蛋白激酶1/2途徑激活血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成[13]。有學(xué)者[14]將人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞（human coronary artery endothelial cells，HCAEC）分別持續(xù)暴露于P.gingivalis及其毒力因子LPS 中，發(fā)現(xiàn)其誘發(fā)促炎因子及血管緊張素Ⅱ的形成，從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，可能是AS 發(fā)生、發(fā)展的原因。另外，P.gingivalis脂蛋白[15]、牙齦蛋白酶[16]、血凝素A（hemagglutinin A，HagA）[17]等參與其對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和侵入過程，加速AS發(fā)病過程。

1.2 P.gingivalis對EC的黏附和侵入

細(xì)菌對EC 的黏附及侵入在細(xì)菌致病過程中具有重要意義，細(xì)菌的致病前題是其黏附于特定組織表面。P.gingivalis侵入人臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）系中，誘導(dǎo)核苷酸結(jié)合的寡聚糖結(jié)構(gòu)域過表達(dá)，促進(jìn)血管細(xì)胞黏附分子1（nucleotide?binding oli?gomerization domain 1，NOD1）及細(xì)胞間黏附分子表達(dá)，沉默NOD1 后抑制NF?κB 通路，在細(xì)菌侵入EC 中發(fā)揮重要作用[18]。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）在P.gingivalis入侵EC中促進(jìn)黏附分子1表達(dá)。內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MIF，誘導(dǎo)的促AS 病損形成[19]。另有研究發(fā)現(xiàn)，P.gingivalis可表達(dá)多種血凝素作為毒力因子參與對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及侵入，HagA 可黏附、侵入HCAEC及牙齦上皮細(xì)胞（gingival epithe?lial cells，GEC）等多種細(xì)胞[17]。還有研究發(fā)現(xiàn)，P.gingivalis通過CD74/CXCR4 受體復(fù)合體調(diào)控單核內(nèi)皮細(xì)胞黏附過程[20]。但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

侵入是細(xì)菌致病并使其深入內(nèi)部的另一種重要方式。牙齦蛋白酶在P.gingivalis侵入多種細(xì)胞中均發(fā)揮重要作用[16,21?22]。P.gingivalisW83 侵入冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞時，脂蛋白PG0717表達(dá)升高，同時PG0717缺失可降低牙齦蛋白酶的活性，說明其可能參與P.gingivalis的毒力作用，參與內(nèi)皮細(xì)胞中P.gingivalis的清除和感染控制[15]。研究發(fā)現(xiàn)，P.gingivalis381能夠入侵內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)菌避開了溶酶體的內(nèi)吞途徑，而是在自噬體中存在，持續(xù)影響內(nèi)皮細(xì)胞從而形成慢性感染可能會加劇沿血管部位的免疫應(yīng)答[23]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，相比于使用細(xì)菌毒力因子，直接采用細(xì)菌侵入對內(nèi)皮細(xì)胞損傷更大。學(xué)者應(yīng)用不同菌株P(guān).gingivalis（W83、A7436、381、33277）感染ApoE?/?AS 小鼠，評估其對人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞侵襲、黏附能力，發(fā)現(xiàn)W83、A7436、381 侵襲能力強(qiáng)于33277，說明不同菌株對內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲作用及其潛在機(jī)制存在差異[24]。

1.3 P.gingivalis促進(jìn)EC凋亡

正常血管壁存在少量的細(xì)胞凋亡，對維持血管的正常發(fā)育必不可少，而AS時則會出現(xiàn)異常活躍的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[25]。將牛冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞（bovine coronary artery endothelial cell，BCAEC）暴露于牙齦蛋白酶中，會導(dǎo)致細(xì)胞黏附降低并且凋亡增加，并與不同水平的半胱氨酸依賴蛋白水解活性相關(guān)[16]。由P.gingivalis提取的蛋白酶樣物質(zhì)可誘導(dǎo)主動脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，可能機(jī)制為破壞微管蛋白及整合素β1、降低ERK1/2 蛋白激活[26]。Hirasawa等[27]發(fā)現(xiàn)，P.gingivalis感染HUVECs誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，隨后自噬反應(yīng)保護(hù)其細(xì)胞凋亡的影響，從而影響血管系統(tǒng)AS 的發(fā)生。

1.4 P.gingivalis誘導(dǎo)EC炎癥反應(yīng)

AS 作為一種慢性炎癥性疾病，致炎因子在AS 的發(fā)病進(jìn)程中發(fā)揮了重要的炎癥調(diào)節(jié)作用。P.gingivalisfimA 通過上調(diào)gp130 表達(dá)，可誘導(dǎo)HUVECs 自分泌調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）?6，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[28]。選擇素E 作為表面蛋白，參與調(diào)控P.gingivalis對HUVECs 黏附作用，并激活胞外分泌，可能激活血管炎癥反應(yīng)[29]。Suh等[30]發(fā)現(xiàn)，P.gingivalis?LPS 可以促進(jìn)全身炎癥反應(yīng)和AS斑塊形成；P.gingivalisLPS通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，從而增加單核細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子。

2 P.gingivalis對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的作用研究

慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）是1種嚴(yán)重危害人類生命健康的常見慢性疾病。流行病學(xué)調(diào)查顯示具有逐年升高趨勢[31]。相比之下，CKD 人群罹患牙周病的風(fēng)險更高[32?33]，并且牙周病亦對CKD 的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響[33?34]。目前，很難確定牙周病在CKD致病機(jī)制中的具體作用。EC作為腎組織內(nèi)主要組成部分，研究表明EC 損傷可能是細(xì)菌及其毒性產(chǎn)物引起宿主免疫反應(yīng)的重要機(jī)制。

目前，針對P.gingivalis對腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究較少。Harada 等[35]應(yīng)用P.gingivalis?LPS刺激小鼠腎臟，檢測其基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在5 個功能性基因差異表達(dá)，同時，體外實(shí)驗(yàn)中在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞也證實(shí)以上基因表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果提示，P.gingivalis?LPS 刺激后腎組織內(nèi)基因改變主要來源于腎內(nèi)皮細(xì)胞，以上基因可能與CKD 的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。Sawa 等[36]也發(fā)現(xiàn)，血液中TLR 受體誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子?α、IL?6等炎癥因子，導(dǎo)致腎小球硬化癥，提示P.gingivalis?LPS 在糖尿病腎病中發(fā)揮重要作用。Kajiwara等[37]發(fā)現(xiàn)，在Ⅰ型、Ⅱ型糖尿病中腎小球內(nèi) 皮 細(xì) 胞 表 面 存 在TLR?2 及TLR?4 受 體，P.gingivalis?LPS 可降低糖尿病小鼠的生存率，其誘導(dǎo)糖尿病腎病主要依賴于腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中TLR2受體。

3 P.gingivalis對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用研究

血腦屏障（blood?brain barrier，BBB）位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)質(zhì)內(nèi)，由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）及其細(xì)胞間的緊密連接、基底膜、及星形膠質(zhì)細(xì)胞組成，調(diào)節(jié)離子、氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)在血液和腦實(shí)質(zhì)之間的交換。BBB 是外周微生物進(jìn)入顱內(nèi)的第1 道屏障。有學(xué)者[38]認(rèn)為，BBB 干擾是AD 的早期指標(biāo)，BBB功能受損有利于微生物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，慢性牙周炎患者患AD、PD 的危險因素更高，臨床癥狀更顯著[39?40]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，P.gingivalis及其毒力因子誘發(fā)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)能夠產(chǎn)生中樞神經(jīng)損害，從而促進(jìn)疾病發(fā)展[41?42]。P.gingivalis可通過多種途徑進(jìn)入腦內(nèi)，其主要途徑為：1）感染巨噬細(xì)胞[43]；2）通過感染顱神經(jīng)進(jìn)入腦內(nèi)（例如嗅覺神經(jīng)）[44]；3）直接感染損傷BBB 中內(nèi)皮細(xì)胞[45]。但目前對P.gingivalis如何影響B(tài)BB 及BMECs 功能研究較少?，F(xiàn)有研究顯示，慢性P.gingivalis感染可加速ApoE?/?小鼠腦組織中顆粒沉積，并且在腦毛細(xì)血管內(nèi)可見廣泛IgG 分布，免疫組化染色可見BBB 損傷，提示損傷的BBB 可能加重炎癥反應(yīng)從而加速老年鼠腦組織中顆粒沉積[46]。在P.gingivalis感染ApoE?/?小鼠大腦中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系表面膜結(jié)合的CD14受體脫落，內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密連接蛋白缺失，內(nèi)毒素滲透通過BBB，導(dǎo)致腦組織暴露于炎癥介質(zhì)中[5]。有學(xué)者[47]認(rèn)為，對于ApoE?/?小鼠大腦，BBB 完整性受損可能是實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)腦內(nèi)組織損傷的繼發(fā)因素。但目前，對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)BBB 損傷的具體機(jī)制仍不清楚。

4 結(jié)論

綜上所述，P.gingivalis與外周心血管內(nèi)皮細(xì)胞、BBB、腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，進(jìn)入全身器官組織內(nèi)從而可能參與AS、AD、CKD 等全身疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。P.gingivalis及其毒力因子致病性在AS及非中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管內(nèi)皮細(xì)胞方面的研究較多，但在BBB 及中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管內(nèi)皮細(xì)胞方面鮮見報道。AD、PD 等神經(jīng)退行性疾病在老年人中發(fā)病率較高，BBB 的病理變化在其中發(fā)揮重要作用，因此對于P.gingivalis對內(nèi)皮細(xì)胞的作用及在各類神經(jīng)系統(tǒng)病變過程中的作用機(jī)制應(yīng)該給予更多的關(guān)注。對于P.gingivalis與BMEC 之間的具體作用機(jī)制報道較少，將來可通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)高通量分析，結(jié)合生物信息學(xué)，篩選P.gingivalis發(fā)揮黏附作用的毒力因子及BMECs受體分子，有助于進(jìn)一步確定細(xì)菌與BMECs之間具體作用機(jī)制。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。