鮑曼不動(dòng)桿菌和鐵離子及鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

徐 曉， 許 巍

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種機(jī)會(huì)致病菌，主要感染重癥患者及免疫力低下人群。鮑曼不動(dòng)桿菌與其他革蘭陰性病原體相比感染率較低，但在全球范圍內(nèi)，約有45%該菌分離株具有多重耐藥性，拉丁美洲和中東地區(qū)的多重耐藥率高達(dá)70%。并且鮑曼不動(dòng)桿菌的多重耐藥率比其他革蘭陰性病原體（如銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌）高出近4倍[1]。在重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）鮑曼不動(dòng)桿菌感染相關(guān)病死率高達(dá)45%～60%[2]。目前所用的抗菌藥物，如抗假單胞菌頭孢菌素、氟喹諾酮類、氨基糖苷類、碳青霉烯類和替加環(huán)素對(duì)該菌的作用有限。因此需要深入了解細(xì)菌的毒力因子和耐藥機(jī)制，找尋新的可替代的治療方法。鐵離子是鮑曼不動(dòng)桿菌生長(zhǎng)所必須的金屬離子，鐵的吸收能增強(qiáng)菌株的致病性和毒力，細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度低于10-6mol/L時(shí)稱為鐵饑餓現(xiàn)象[3]，不利于細(xì)菌生存，人體內(nèi)游離鐵離子濃度通常不能滿足細(xì)菌生長(zhǎng)需求，為了抵抗這種惡劣壞境，細(xì)菌衍生出了許多直接或者間接的機(jī)制來(lái)獲取鐵離子。在鮑曼不動(dòng)桿菌中，可以通過(guò)亞鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)（Feo）系統(tǒng)攫取Fe2+，也可在高親和力螯合劑幫助下攫取鐵離子，或者通過(guò)分泌一種攝取血紅素的蛋白來(lái)間接攫取鐵，有研究顯示，在低鐵條件下，鮑曼不動(dòng)桿菌會(huì)修飾一系列鐵離子相關(guān)基因以及生物膜形成、呼吸、動(dòng)力等相關(guān)過(guò)程的基因表達(dá)來(lái)抵抗低鐵環(huán)境，因此鐵離子是鮑曼不動(dòng)桿菌生存與毒力作用的因素之一[4]。如果能從機(jī)制入手，研發(fā)出相關(guān)藥物或者疫苗，徹底破壞鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)鐵的獲取，使得菌體缺乏必須的營(yíng)養(yǎng)元素，從而有效阻止細(xì)菌生長(zhǎng)。本文主要綜述幾種重要的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及其相關(guān)應(yīng) 用。

1 Fe3+載體

鮑曼不動(dòng)桿菌為需氧革蘭陰性桿菌，鐵離子的獲取主要依靠鐵載體和血紅素的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。在鮑曼不動(dòng)桿菌中鐵載體主要有三種：不動(dòng)桿菌素（acinetobactin）、絲膜蛋白（fimsbactin）、鮑曼鐵蛋白（baomannoferrion）。不動(dòng)桿菌素[5]和絲膜蛋白A-F[6]首次報(bào)道于1994和2013年，經(jīng)過(guò)非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase，NRPS） 生物合成裝配路徑（biosynthetic assembly line）產(chǎn)生，鮑曼鐵蛋白A/B首次報(bào)道于2015年[7]，由枸櫞酸、1，3-二氨基丙烷、2，4-二氨基丁酸、癸烯酸和α-酮戊二酸組成，合成路徑為NRPs-非依賴性鐵載體合成酶（NIS）生物合成路徑（NRPS-independent siderophore synthetase biosynthetic process），三種載體一般不共存于一種菌株上，很多鮑曼不動(dòng)桿菌菌株缺乏絲膜蛋白。

前不動(dòng)桿菌素通過(guò)非酶促反應(yīng)異構(gòu)化生成不動(dòng)桿菌素，pH＜6時(shí)，以前不動(dòng)桿菌素形式存在，pH＞7時(shí)，異構(gòu)化生成不動(dòng)桿菌素。Shapiro等[8]通過(guò)對(duì)晶體結(jié)構(gòu)模型的研究發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌素可以以2∶1的比例與鐵離子結(jié)合，生成[Fe ( Acb )2]-1復(fù)合物，前不動(dòng)桿菌素也可以與鐵離子以2∶1結(jié)合，生成 [Fe ( PreAcb )2]，絲膜蛋白和鮑曼鐵蛋白則以1∶1比例與鐵離子結(jié)合[8-10]。BauA、BauB是將鐵離子載體復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的重要蛋白質(zhì)類物質(zhì)，BauA具有典型的外膜TonB依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白折疊，其中β-barrel由22條反平行鏈，數(shù)個(gè)胞外環(huán)和折疊在桶內(nèi)的塞結(jié)構(gòu)域（plug domain）形成[11]；BauB結(jié)構(gòu)是典型的A類底物結(jié)合折疊，中心α-螺旋跨越較小的N-和C-末端結(jié)構(gòu)域，疏水性殘基介導(dǎo)配體結(jié)合在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的中央口袋中[9]。鐵離子載體復(fù)合物通過(guò)BauA轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入周質(zhì)中，再通過(guò)鐵載體結(jié)合蛋白BauB，前不動(dòng)桿菌 素 /不動(dòng)桿菌素載體復(fù)合物形成后被BauA特異性識(shí)別繼而呈遞給BauB，BauB再將載體復(fù)合物呈遞給ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（BauCDE），在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)幫助下通過(guò)內(nèi)膜，最后在BauF的幫助下釋放鐵離子，在這個(gè)過(guò)程中，能量由TonB-ExbB-ExbD系統(tǒng)提 供。

在酸性條件下載體以前不動(dòng)桿菌素形式存在，已被證實(shí)在中性至堿性條件下前不動(dòng)桿菌素可轉(zhuǎn)化為不動(dòng)桿菌素，但是在進(jìn)入過(guò)程仍然存在一些爭(zhēng)議，有研究認(rèn)為2個(gè)分子不動(dòng)桿菌素/前不動(dòng)桿菌素都可以與Fe3+形成載體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)相同通路進(jìn)入菌體內(nèi)[8]，但也有研究通過(guò)對(duì)BauA功能結(jié)構(gòu)域的分析，發(fā)現(xiàn)BauA特異性識(shí)別的是前不動(dòng)桿菌素，并且在堿性條件下，由1個(gè)分子不動(dòng)桿菌素和1個(gè)分子前不動(dòng)桿菌素共同與Fe3+結(jié)合形成載體復(fù)合物[11]，有研究表明在鐵限制條件下，絲膜蛋白鐵載體復(fù)合物和不動(dòng)桿菌素鐵載體復(fù)合物均能促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，在BauB上也發(fā)現(xiàn)了相對(duì)應(yīng)的功能結(jié)構(gòu)域，但是二者同時(shí)存在時(shí)卻會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合周質(zhì)蛋白BauB，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，而且不動(dòng)桿菌素通常都存在于鮑曼不動(dòng)桿菌體內(nèi)。因此，利用絲膜蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計(jì)出靶點(diǎn)藥物，為對(duì)抗鮑曼不動(dòng)桿菌提供了一種新思路[10]。

針對(duì)不動(dòng)桿菌素，在其他細(xì)菌的研究上證實(shí)不動(dòng)桿菌素和前不動(dòng)桿菌素都是通過(guò)相同的途徑進(jìn)入菌體內(nèi)，并且在鮑曼不動(dòng)桿菌的BauB上也有分別的功能結(jié)構(gòu)域與之相結(jié)合作用，但是是否都是通過(guò)BauA進(jìn)入，是否存在其他載體蛋白，或結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化等，未來(lái)需要更多相關(guān)研究。

2 Feo系統(tǒng)

在氧氣充足、pH值中性的情況下，F(xiàn)e3+是鐵的主要存在形式，但是在低氧酸性條件下主要以Fe2+的形式存在，比如人的胃腸黏膜等部位。Feo系統(tǒng)是另一鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，負(fù)責(zé)在低氧偏酸條件下鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)Fe2+的吸收，后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)福氏志賀菌、幽門螺桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌亦可以Fe2+吸收為主要獲取方式[12-13]。

Feo系統(tǒng)包含三個(gè)部分，分別是FeoA、FeoB、FeoC。FeoA是一種小的β桶蛋白，對(duì)于鮑曼不動(dòng)桿菌的生長(zhǎng)、黏附、生物膜的形成不可或缺，在小鼠肺炎模型中發(fā)現(xiàn)，敲除feoA基因會(huì)減弱細(xì)菌的生長(zhǎng)、定植、感染等能力，對(duì)氧化應(yīng)激更加敏感，降低整體毒力作用[14]；FeoB是具有可水解GTP的可溶性G蛋白結(jié)構(gòu)域的多組分膜蛋白[15]，是Fe2+主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的通道，研究顯示在福氏志賀菌、幽門螺桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌等菌株中出現(xiàn)FeoB基因突變，會(huì)造成Fe2+攝取障礙，毒力降低[13，16]，Subashchandrabose等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比較，在FeoB突變菌株中，抗菌肽對(duì)人血清補(bǔ)體和多黏菌素B的敏感性增加；FeoC是一種小的胞質(zhì)蛋白，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控子調(diào)控表達(dá)[18]。

迄今，F(xiàn)e2+在鮑曼不動(dòng)桿菌中的利用機(jī)制仍然存在很多疑問(wèn)，比如FeoB是如何水解GTP，F(xiàn)eo系統(tǒng)這三個(gè)部分如何協(xié)作運(yùn)轉(zhuǎn)，F(xiàn)eoA、FeoB、FeoC三者之間的關(guān)系仍舊不清楚，僅在霍亂弧菌實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了FeoB和FeoC之間可能存在相互作用[19]。

3 其他

除了上述的模式，還有一種就是細(xì)菌通過(guò)直接獲取宿主體內(nèi)含血紅素的蛋白來(lái)間接獲取鐵[20]，是一種主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程，同樣依賴于TonBExbB-ExbD的能量轉(zhuǎn)換供給。菌體先利用分泌出的血團(tuán)結(jié)合含血紅素蛋白，再與外膜表面受體結(jié)合，在ABC系統(tǒng)幫助下穿過(guò)內(nèi)膜，進(jìn)入菌體釋放出鐵離子。在這一途徑中表達(dá)數(shù)種血紅素相關(guān)的酶，其中血紅素加氧酶基因（heme oxygenase gene，hemo）研究較多。在19種暴發(fā)流行的鮑曼不動(dòng)桿菌中都發(fā)現(xiàn)了含有hemo基因的基因簇[21]。對(duì)血紅素的利用增強(qiáng)菌株毒力作用。有研究表明高毒力暴發(fā)性鮑曼不動(dòng)桿菌菌株LAC感染小鼠后，對(duì)血紅素的攝取和利用主要取決于hemo基因簇的表達(dá)，缺乏hemo基因簇的ATCC 17987菌株則不能利用血紅素[22]。

4 應(yīng)用

2017年，世界衛(wèi)生組織將鮑曼不動(dòng)桿菌列為嚴(yán)重危害人類健康的一級(jí)細(xì)菌，呼吁大家共同解決相關(guān)問(wèn)題。臨床上嘗試應(yīng)用多種抗生素，仍未取得顯著效果。鐵離子作為鮑曼不動(dòng)桿菌生存所必須的物質(zhì)，引起人們極大關(guān)注。目前科研工作者們已經(jīng)開(kāi)始探索一些螯合劑，如去鐵胺、去鐵銅等對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的影響，它們的最低抑菌濃度為32 mmol/L和64 mmol/L[23]。鎵類化合物中硝酸鎵對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 17978具有抑制作用，但是對(duì)LAC-4型鮑曼不動(dòng)桿菌沒(méi)有任何作用，在一項(xiàng)肺炎小鼠模型中顯示鎵原卟啉Ⅸ（GaPPⅨ）能完全阻斷LAC-4型鮑曼不動(dòng)桿菌中的Hemo途徑，菌株失去對(duì)硝酸鎵的耐受性和在血清中的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，更重要的是，用GaPPⅨ處理經(jīng)鼻內(nèi)感染LAC-4的小鼠可防止肺外傳播和死亡[24]；還有研究表明抗生素和載體螯合劑的聯(lián)合應(yīng)用，比如達(dá)托霉素和鐵載體模擬物[25]除了鐵載體，在機(jī)制通路上任何一個(gè)環(huán)節(jié)都有可能成為抗菌藥物研發(fā)的突破口，TonB-ExbB-ExbD在鐵載體和血紅素?cái)z取上都起到能量轉(zhuǎn)換供給的作用，其中對(duì)于TonB的了解甚少。研究發(fā)現(xiàn)，TonB1、TonB2對(duì)Fe3+的攝取作用不大，但是TonB3的存在是Fe3+攝取所需的必備條件，并且在小鼠和昆蟲(chóng)感染模型中發(fā)現(xiàn)與鮑曼不動(dòng)桿菌的毒力作用以及致病性密切相關(guān)，因此或可通過(guò)TonB3研發(fā)出相關(guān)減毒疫苗[25-26]，還有研究顯示利用BauA的功能結(jié)構(gòu)域，或可研發(fā)出相關(guān)免疫原候選[27]。

鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥問(wèn)題亟待解決，目前缺乏根治性方案，金屬離子中比如鐵離子作為鮑曼不動(dòng)桿菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不可或缺的部分，引起人們關(guān)注。鐵離子參與細(xì)菌內(nèi)眾多的生化反應(yīng)，并與生物膜的形成、外排泵的調(diào)控等都有不可或缺的關(guān)系，是造成細(xì)菌毒力以及致病性的重要因素之一，在低鐵條件下，鐵調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)增強(qiáng)[4，28]；在鮑曼不動(dòng)桿菌菌血癥基因表達(dá)分析中，557個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá)下調(diào)，329個(gè)上調(diào)，其中上調(diào)最明顯的就是鐵載體基因簇[29]。通過(guò)RNA測(cè)序分析了來(lái)自8例患者的多重耐藥菌株的縱向集，以鑒定差異表達(dá)的基因，并將其與導(dǎo)致患者和人群內(nèi)轉(zhuǎn)錄變異的遺傳變化聯(lián)系起來(lái)，經(jīng)過(guò)分析，發(fā)現(xiàn)宿主感染期間菌株會(huì)發(fā)生遺傳變異，新突變株通常富含編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子鐵的基因采集系統(tǒng)以及與表面相關(guān)的結(jié)構(gòu)[30]。有研究表明，在臨床ICU收集到的65株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，低鐵（＜20 μmol/L）條件下，外排泵aAdeABC的表達(dá)會(huì)增加四倍以上[31]，酰基高絲氨酸內(nèi)酯和生物膜形成也會(huì)增加[32]。鐵離子的攫取依靠載體等進(jìn)行，如果可以在任何一個(gè)環(huán)節(jié)造成細(xì)菌鐵離子的攫取障礙，就能一定程度上攻破鮑曼不動(dòng)桿菌這一難題。目前對(duì)于鐵離子攫取機(jī)制的研究仍然有限，尤其對(duì)鮑曼鐵蛋白、絲膜蛋白、血紅素?cái)z取、Feo系統(tǒng)都不夠了解，由于鐵攝取系統(tǒng)的多樣性，不同生理?xiàng)l件下?tīng)顟B(tài)的不同，均提示單獨(dú)研究其中一點(diǎn)的效果不會(huì)很理想，未來(lái)需要更加全面、詳細(xì)的研 究。