循環(huán)外泌體PD-L1與惡性腫瘤

張武文 汪付兵

作者單位：213100 常州 1南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科；430071 武漢 2武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗(yàn)科

外泌體是一組由細(xì)胞釋放、大小為30～150 nm的細(xì)胞外囊泡［1］。人體多種細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞均可釋放外泌體。外泌體不是簡(jiǎn)單的細(xì)胞脫落碎片，往往攜帶有大量來(lái)源于母體細(xì)胞的核酸、蛋白及糖類等物質(zhì)。近來(lái)研究表明，腫瘤源外泌體所攜帶的PD-L1在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用，并可進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移［2］。此外，腫瘤源外泌體PD-L1被發(fā)現(xiàn)與患者接受抗PD1免疫治療的響應(yīng)程度有關(guān)，因此外泌體PD-L1有望成為一種新型的指導(dǎo)抗PD1免疫治療標(biāo)志物。在外泌體研究領(lǐng)域，已有大量研究聚焦于循環(huán)外泌體PD-L1在惡性腫瘤中的診療價(jià)值，且認(rèn)為檢測(cè)循環(huán)外泌體PD-L1可促進(jìn)精準(zhǔn)診療。然而，目前循環(huán)外泌體PD-L1檢測(cè)仍然缺乏公認(rèn)有效的手段，本文就循環(huán)外泌體PD-L1檢測(cè)方法及其在惡性腫瘤診療中的價(jià)值作一綜述。

1 外泌體PD-L1的作用機(jī)制

外泌體可通過(guò)與靶細(xì)胞識(shí)別和融合等過(guò)程傳遞生物調(diào)節(jié)信息，影響靶細(xì)胞的活性及功能，而腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的分泌外泌體功能，腫瘤來(lái)源外泌體通過(guò)作用于鄰近腫瘤細(xì)胞從而導(dǎo)致惡性腫瘤進(jìn)展（圖1）［3］。在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，免疫逃逸機(jī)制發(fā)揮重要作用［4］。腫瘤細(xì)胞可通過(guò)多種機(jī)制躲避免疫細(xì)胞殺傷效應(yīng)，包括隱蔽腫瘤抗原、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、釋放抑制性細(xì)胞因子以及通過(guò)直接接觸抑制免疫殺傷細(xì)胞等［5］。PD1/PD-L1信號(hào)通路是最經(jīng)典的抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞效應(yīng)的機(jī)制。在惡性腫瘤細(xì)胞及免疫抑制性細(xì)胞如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面均可表達(dá)PD-L1分子，而PD-L1分子又可與免疫殺傷細(xì)胞CD8+T細(xì)胞表面的PD1受體結(jié)合，引起CD8+T細(xì)胞功能耗竭，使其失去對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力［6-7］。腫瘤細(xì)胞也可通過(guò)釋放外泌體抑制免疫殺傷細(xì)胞功能。有研究在腫瘤來(lái)源外泌體膜上發(fā)現(xiàn)具有PD-L1和FasL等配體，其通過(guò)與免疫殺傷細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，致使靶細(xì)胞凋亡及功能耗竭［8］。此外，外泌體PD-L1除了可直接抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能外，還可誘導(dǎo)免疫抑制細(xì)胞的產(chǎn)生，被認(rèn)為在介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［9］。綜上認(rèn)為，外泌體PD-L1主要通過(guò)發(fā)揮廣泛的免疫抑制效應(yīng)，從而間接促進(jìn)惡性腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。

圖1 腫瘤源外泌體促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展Fig.1 Tumor-derived exosomes promote the development of malignant tumors

2 循環(huán)外泌體PD-L1在惡性腫瘤診療中的價(jià)值

外泌體PD-L1已被發(fā)現(xiàn)是導(dǎo)致腫瘤免疫抑制的一個(gè)重要因子［10］。體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)PD-L1+外泌體可抑制淋巴細(xì)胞功能，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［11］。因此，外泌體PD-L1水平常與惡性腫瘤患者的疾病進(jìn)展及預(yù)后以及抗PD1免疫治療效應(yīng)相關(guān)，檢測(cè)其水平有助于篩選合適的抗PD1治療患者。

2.1 循環(huán)外泌體PD-L1與免疫治療

免疫治療作為一種新型的惡性腫瘤治療方式，在一定程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)治療方式的不足，是充滿前景的惡性腫瘤治療手段［12］。腫瘤免疫治療通過(guò)增強(qiáng)或激活淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制或消除。目前FDA批準(zhǔn)的腫瘤免疫療法包括癌癥疫苗、細(xì)胞因子、抗CTLA-4抗體、CAR-T療法及抗PD1/PD-L1抗體療法等。其中抗PD1/PD-L1抗體療法因具有客觀緩解率高，治療副作用較少，適用于多種實(shí)體腫瘤類型等特點(diǎn)，成為免疫療法的主流治療手段［13-14］。在臨床上，惡性腫瘤患者是否適用于抗PD1治療主要以組織病理學(xué)PD-L1檢測(cè)為指征，但組織標(biāo)本往往不易獲取，且局部取材難以避免腫瘤異質(zhì)性的問(wèn)題。此外，有研究表明，組織PD-L1陰性的患者也可能產(chǎn)生大量的PD-L1陽(yáng)性外泌體［15］。而與組織PD-L1檢測(cè)相比，檢測(cè)循環(huán)外泌體PD-L1可實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)取樣，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)，且可避免局部取材帶來(lái)的腫瘤異質(zhì)性問(wèn)題。因此，循環(huán)外泌體PD-L1有望成為一種新的抗PD1免疫治療標(biāo)志物。有研究在治療前檢測(cè)了指導(dǎo)抗PD1治療的黑色素瘤患者的循環(huán)外泌體PD-L1蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)治療無(wú)響應(yīng)的患者循環(huán)外泌體PD-L1水平往往很高，而低水平循環(huán)外泌體PD-L1的患者多表現(xiàn)為完全應(yīng)答或部分應(yīng)答［9］。在黑色素瘤及非小細(xì)胞肺癌研究中也發(fā)現(xiàn)，循環(huán)外泌體PD-L1 mRNA表達(dá)水平與患者抗PD1治療響應(yīng)相關(guān)，經(jīng)PD1單抗治療后，響應(yīng)組患者的外泌體PD-L1 mRNA水平顯著降低，而病情穩(wěn)定組降低不明顯，病情惡化組則顯著升高［16］。因此認(rèn)為，接受抗PD1治療的患者進(jìn)行外泌體PD-L1檢測(cè)有助于預(yù)測(cè)其療效。

2.2 循環(huán)外泌體PD-L1與腫瘤監(jiān)控

外泌體PD-L1可通過(guò)抑制CD8+T細(xì)胞功能協(xié)助惡性腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，促進(jìn)疾病進(jìn)展。因此，循環(huán)外泌體PD-L1水平也可反映惡性腫瘤患者的疾病狀況。在一項(xiàng)包含40例頭頸鱗癌患者的臨床研究中發(fā)現(xiàn)患者循環(huán)外泌體PD-L1水平與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)高度相關(guān)（P=0.0008，0.013），認(rèn)為循環(huán)外泌體PD-L1水平可間接反映患者疾病進(jìn)展及免疫功能，可作為頭頸鱗癌病情的監(jiān)測(cè)指標(biāo)［17］。也有研究在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)血清外泌體PD-L1水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀態(tài)等參數(shù)相關(guān)，且與低水平血清外泌體PD-L1的患者相比，高水平患者腫瘤體積（＞2.5 cm）更大（P＜0.001），更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P＜0.05）［18］。因此，監(jiān)測(cè)血清外泌體 PD-L1水平對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者病情狀態(tài)具有提示價(jià)值。此外，循環(huán)外泌體PD-L1在治療前后的變化水平（ΔExoPD-L1）也具有重要的臨床價(jià)值。一項(xiàng)研究納入100例黑色素瘤患者，通過(guò)檢測(cè)患者在治療前后的ΔExoPD-L1水平并分析其與黑色素瘤治療后進(jìn)展的關(guān)系，結(jié)果顯示治療后進(jìn)展患者的ΔExoPD-L1水平高于治療后無(wú)進(jìn)展患者，且以ΔExoPD-L1＞100為臨界值診斷黑色素瘤治療后進(jìn)展時(shí)，其靈敏度和特異度分別為83%和70%［19］。

2.3 循環(huán)外泌體PD-L1與腫瘤預(yù)后

外泌體PD-L1在促進(jìn)惡性腫瘤進(jìn)展中有重要作用，因此也往往導(dǎo)致患者不良預(yù)后，檢測(cè)其水平對(duì)判斷預(yù)后同樣具有重要價(jià)值。一項(xiàng)研究納入69例胃癌患者，發(fā)現(xiàn)術(shù)前血漿外泌體PD-L1水平與患者預(yù)后相關(guān)，與低水平血漿外泌體PD-L1組患者相比，高水平血漿外泌體PD-L1組患者的總體生存期顯著縮短（P=0.004），生存分析顯示血漿外泌體PD-L1是獨(dú)立的預(yù)后影響因素（P=0.026）［20］。在預(yù)測(cè)治療后的預(yù)后方面，循環(huán)外泌體PD-L1也顯示出了一定潛力。一項(xiàng)研究納入55例胰腺癌患者并于術(shù)前檢測(cè)其血清外泌體PD-L1，發(fā)現(xiàn)與血清外泌體PD-L1陰性患者相比，PD-L1陽(yáng)性患者術(shù)后生存期顯著縮短（9.5個(gè)月vs 21.7 個(gè)月，P＜0.001）［21］。此外，在黑色素瘤研究中也顯示治療前后的ΔExoPD-L1水平可用于預(yù)測(cè)預(yù)后，ΔExoPD-L1＞100的患者較 ΔExoPD-L1＜100的患者總體生存期和無(wú)進(jìn)展生存期顯著縮短（P=0.048，0.011），說(shuō)明循環(huán)外泌體PD-L1治療前后的變化量對(duì)提示預(yù)后具有重要價(jià)值［19］。

3 循環(huán)外泌體PD-L1的檢測(cè)方法

循環(huán)外泌體PD-L1檢測(cè)仍缺乏公認(rèn)和主流的方法。傳統(tǒng)的外泌體檢測(cè)方法如酶聯(lián)免疫分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、流式分析法均可用于循環(huán)外泌體PD-L1檢測(cè)，目前以ELISA法應(yīng)用較為普遍。ELISA法可定量檢測(cè)循環(huán)外泌體PD-L1含量，且易操作。流式分析法可用于大樣本定量檢測(cè)循環(huán)外泌體PD-L1，但對(duì)檢測(cè)設(shè)備要求較高。隨著對(duì)外泌體研究的深入，外泌體蛋白及核酸檢測(cè)方法也在不斷豐富和發(fā)展，一些新的方法被引入到循環(huán)外泌體PDL1檢測(cè)（圖2）領(lǐng)域。

圖2 惡性腫瘤患者循環(huán)外泌體PD-L1檢測(cè)模式圖Fig.2 Detection of circulating exosomal PD-L1 in patients with malignant tumors

3.1 數(shù)字PCR

由于外泌體所含核酸量較少，因此常規(guī)檢測(cè)方法難以對(duì)其基因拷貝數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。數(shù)字PCR技術(shù)是一種具有極高靈敏度且可以絕對(duì)定量的核酸檢測(cè)方法，其靈敏度可達(dá)單個(gè)核酸分子級(jí)別，因此在檢測(cè)外泌體核酸含量方面具有優(yōu)勢(shì)。研究者利用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)黑色素瘤及非小細(xì)胞肺癌患者血漿外泌體中PD-L1 mRNA拷貝數(shù)進(jìn)行了精確定量分析，并據(jù)此揭示了血漿外泌體PD-L1 mRNA拷貝數(shù)與抗PD1治療效果間的相關(guān)性［16］。數(shù)字PCR技術(shù)的引入顯著提高了外泌體PD-L1 mRNA的檢測(cè)能力，對(duì)外泌體PD-L1研究具有重要意義。但外泌體PD-L1 mRNA含量與PD-L1蛋白表達(dá)量間可能存在非一致性，因此單純檢測(cè)外泌體PD-L1 mRNA可能存在一定缺陷，需進(jìn)一步研究闡明。

3.2 ELISA

ELISA是傳統(tǒng)的免疫學(xué)分析方法，常用于檢測(cè)血漿或培養(yǎng)基中的小分子蛋白，具有較高的靈敏度且可進(jìn)行定量分析。ELISA也可用于檢測(cè)外泌體PD-L1蛋白，且可實(shí)現(xiàn)對(duì)大批量樣本的定量檢測(cè)。基于ELISA法原理的PD-L1蛋白檢測(cè)試劑盒也被應(yīng)用于血漿外泌體 PD-L1 蛋白定量檢測(cè)中［18-19］。CHEN 等［9］基于ELISA法原理構(gòu)建了外泌體PD-L1蛋白檢測(cè)體系，用于細(xì)胞培養(yǎng)基或血漿來(lái)源外泌體PD-L1蛋白檢測(cè)，其線性檢測(cè)范圍為0.2～12.0 ng/mL。ELISA法是一種較好的外泌體PD-L1蛋白檢測(cè)方法，易于定量檢測(cè)、重復(fù)性好，但是由于血漿中亦存在游離的PD-L1蛋白，會(huì)干擾其準(zhǔn)確性，因此該方法檢測(cè)循環(huán)外泌體PD-L1蛋白的靈敏度與特異度仍需進(jìn)一步探究。

3.3 流式分析法

流式分析法常用于對(duì)懸浮于液體中的細(xì)胞或其他生物顆粒進(jìn)行分型及計(jì)數(shù)，因此該法亦被引入到外泌體檢測(cè)及計(jì)數(shù)中。THEODORAKI等［17］首先使用層析法對(duì)頭頸癌患者血漿中的外泌體進(jìn)行初步分離，然后采用流式分析法對(duì)PD-L1陽(yáng)性的外泌體進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)數(shù)，PD-L1蛋白表達(dá)量以熒光強(qiáng)度表示，結(jié)果顯示該方法在檢測(cè)外泌體PD-L1蛋白時(shí)具有很好的重復(fù)性，對(duì)單個(gè)患者樣本進(jìn)行多次平行測(cè)定時(shí)，其個(gè)體內(nèi)變異為7%。同時(shí)，為驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性，研究者以共聚焦熒光分析法作為外泌體PDL1蛋白檢測(cè)的參考方法，使用流式分析法與共聚焦熒光分析法對(duì)低值、中值、高值3例樣本進(jìn)行平行檢測(cè)，并將結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)流式分析法結(jié)果與共聚焦熒光分析法結(jié)果具有較高的一致性，說(shuō)明流式分析法是準(zhǔn)確的外泌體PD-L1定量分析方法。此外，LUX等［21］也成功利用流式分析法檢測(cè)了胰腺癌患者血清中的外泌體PD-L1和c-Met蛋白表達(dá)量，但檢測(cè)方法性能有待進(jìn)一步研究。目前專門(mén)用于外泌體檢測(cè)的流式分析儀也已上市，如Apogee超靈敏納米流式分析儀等［22］，相比傳統(tǒng)流式分析儀更適合用于外泌體蛋白檢測(cè)。

3.4 表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)

表面增強(qiáng)拉曼散射（surface-enhanced raman scattering，SERS）技術(shù)是一種具有極高靈敏度的指紋光譜技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中。目前已有學(xué)者采用SERS技術(shù)進(jìn)行外泌體PD-L1蛋白檢測(cè)。研究者首先利用TiO2修飾的磁珠對(duì)血漿中的外泌體進(jìn)行非特異性吸附，再利用連接有PD-L1抗體的SERS探針修飾納米金顆粒，然后將外泌體樣本與納米金顆粒共同孵育使其形成磁珠-外泌體-納米金顆粒復(fù)合物結(jié)構(gòu)，最后利用磁場(chǎng)將該復(fù)合物富集并分離，再置于激光共焦拉曼光譜儀上檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)PD-L1陽(yáng)性外泌體含量的檢測(cè)。該方法檢測(cè)靈敏度高，其最低檢測(cè)限可達(dá)1 PD-L1+外泌體/μL血漿。此外，研究者利用該方法對(duì)一組不同濃度的樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示SERS強(qiáng)度與外泌體樣本濃度對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系，表明該檢測(cè)方法具有較好的穩(wěn)定性，且可直接在血漿中檢測(cè)外泌體，無(wú)需另外的外泌體分離步驟［23］。目前將SERS技術(shù)直接應(yīng)用于外泌體PD-L1蛋白檢測(cè)的研究還較少，但SERS技術(shù)應(yīng)用于其他外泌體檢測(cè)的研究已經(jīng)開(kāi)展［24-25］，這對(duì)外泌體PD-L1蛋白檢測(cè)也具有重要的借鑒價(jià)值。

3.5 HOLMES-ExoPD-L1法

HOLMES-ExoPD-L1法是一種新穎的外泌體PD-L1蛋白檢測(cè)方法。該方法設(shè)計(jì)了一種新的靶向PD-L1蛋白MJ5C適體，可高效結(jié)合外泌體膜上的PD-L1蛋白，且不受PD-L1蛋白糖基化干擾。該方法首先將熒光標(biāo)記的MJ5C適體與外泌體共孵育于細(xì)毛細(xì)管中使其相互結(jié)合，并將紅外激光聚焦到細(xì)毛細(xì)管中以形成一個(gè)微米級(jí)的溫度梯度。游離的MJ5C適體與外泌體MJ5C適體復(fù)合物的熱泳速率顯著不同，其中游離適體較外泌體-適體復(fù)合物的熱泳耗竭快，據(jù)此可將游離適體從反應(yīng)體系中分離出去。因此，在激發(fā)光作用下，可通過(guò)檢測(cè)熒光標(biāo)記的適體熒光強(qiáng)度測(cè)定外泌體PD-L1蛋白含量［26］。該方法靈敏度較高，檢測(cè)限為17.6 pg/mL，此外還具有所需樣本量少、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，是一種原創(chuàng)性較高的外泌體PD-L1蛋白檢測(cè)方法，對(duì)開(kāi)發(fā)新的外泌體PD-L1蛋白檢測(cè)方法具有啟示價(jià)值。

4 小結(jié)與展望

外泌體PD-L1在惡性腫瘤免疫治療領(lǐng)應(yīng)用前景廣闊，已成為外泌體領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。相比檢測(cè)組織PD-L1表達(dá)，循環(huán)外泌體PD-L1檢測(cè)更易于獲取標(biāo)本和開(kāi)展實(shí)時(shí)檢測(cè)，同時(shí)可避免病理取材帶來(lái)的組織異質(zhì)性問(wèn)題；外泌體PD-L1也是導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的重要原因，且與惡性腫瘤進(jìn)展相關(guān)，有可能成為病情評(píng)估及預(yù)后預(yù)測(cè)的重要指標(biāo)。此外，血漿外泌體PD-L1水平也有望用于篩選適于抗PD1免疫治療的患者并預(yù)測(cè)其對(duì)治療的響應(yīng)程度。然而，目前循環(huán)外泌體PD-L1檢測(cè)仍缺乏公認(rèn)有效的手段，有待建立分離方式簡(jiǎn)單或不需分離、樣本需求量少、高靈敏度、重復(fù)性好、檢測(cè)信號(hào)不易受干擾的理想循環(huán)外泌體PD-L1檢測(cè)方法。循環(huán)外泌體PD-L1檢測(cè)方法仍需進(jìn)一步深入研究，但相信未來(lái)隨著檢測(cè)新方法的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，循環(huán)外泌體PD-L1將能更好地指導(dǎo)抗PD1免疫治療，在惡性腫瘤診療中發(fā)揮更重要的作用。