基于液質(zhì)聯(lián)用的人血清代謝組學(xué)樣品前處理方法研究

李倩倩 任冠樺 葉春華 吳龍俊宇 黎遠(yuǎn)冬 張春燕

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，研究對(duì)象主要包括生物體液、細(xì)胞或組織、植物和相關(guān)樣品中的低分子量代謝物（相對(duì)分子量＜1 000 Da），這些代謝物能準(zhǔn)確、靈敏地反映生物體系的整體功能狀態(tài)［1-2］。血清是代謝組學(xué)研究中的重要體液樣本之一，含有多種內(nèi)源性代謝產(chǎn)物［3］，且獲取方式簡(jiǎn)便、成本低廉［4-10］。在基于液質(zhì)聯(lián)用的血清代謝組學(xué)分析中，樣品前處理是影響分析結(jié)果質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)［11］，但目前尚缺乏理想的血清代謝組學(xué)前處理方法。本研究基于超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）技術(shù)建立血清代謝組學(xué)樣品前處理方法，為血清樣品前處理提供新方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

收集于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院就診的200例患者晨起空腹抽取的血液標(biāo)本，于室溫下靜置30 min，4 000 r/min離心10 min，每份取10 μL上清液充分混勻，置于-80℃下冷凍保存待用。所有血液樣本均為實(shí)驗(yàn)前2 d收集。

超高效液相色譜儀、SCIEX X500R四級(jí)飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀為美國(guó)SCIEX公司產(chǎn)品；ACQUITY BEH C18色譜柱（2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm）為 Waters 公司產(chǎn)品，乙腈、甲酸（色譜純）為Merck公司產(chǎn)品，Amicon Ultra-0.5超濾離心管（截留分子量3 000 Da）為美國(guó)Merck millipore公司產(chǎn)品，真空離心濃縮儀為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)超純水為本中心自制。

1.2 色譜條件

ACQUITY BEH C18色譜柱（2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.1% 甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）；線(xiàn)性梯度洗脫（0～9 min：B 2%→45%；9～15 min：B 45%→100%；15～18 min：B 100%；18～20 min：B 100%→2%；20～23 min：B 2%）。進(jìn)樣前色譜柱在初始流動(dòng)相條件下平衡15 min，流速0.4 mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源分別采用ESI+和ESI-掃描模式，噴霧電壓分別為5 500 V和-4 500 V，源溫度500℃，霧化氣壓50 MPa，干燥氣壓50 MPa，氣簾氣35 MPa。MS 掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）100～1 250，碰撞能為 10 eV；MS/MS掃描范圍為m/z 50～1 000，碰撞能為（35±15）eV。掃描過(guò)程中動(dòng)態(tài)扣除背景離子。

1.4 樣品前處理方法

混和血清樣品于室溫下解凍，分別取100 μL血清轉(zhuǎn)移至15個(gè)1.5 mL的EP管，并按照不同處理方法分為3組，每組5個(gè)。

血清樣品經(jīng)三倍乙腈沉淀處理（方法一）：每個(gè)樣品分別加入300 μL乙腈，渦旋混勻30 s，于-20℃下冷凍沉淀蛋白1 h，然后以15 000 r/min離心15 min，取上清液至進(jìn)樣瓶中。

血清樣品經(jīng)三倍乙腈沉淀后再通過(guò)濃縮復(fù)溶方式處理（方法二）：每個(gè)樣品分別加入300 μL乙腈，渦旋混勻30 s，于-20℃下冷凍沉淀蛋白1 h，以15 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至1.5 mL EP管中，用真空離心濃縮儀在室溫下濃縮4 h至干，再用 100 μL 乙腈：水（1∶1）復(fù)溶，渦旋混勻 30 s，再以15 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至進(jìn)樣瓶中。

血清樣品經(jīng)一倍乙腈沉淀后再通過(guò)超濾管截留大分子方式處理（方法三）：每個(gè)樣品分別加入100 μL的乙腈，渦旋混勻30 s，于-20℃下冷凍沉淀蛋白1 h，以15 000 r/min離心15 min，取上清液至Amicon Ultra-0.5超濾離心管中，15 000 r/min離心15 min，截留分子量≥3 000 Da的分子，取離心管內(nèi)液體至進(jìn)樣瓶中。

3組血清樣品經(jīng)上述方法處理后，15個(gè)樣本分別取 10 μL 配成質(zhì)控（quality control，QC）樣品，每 5 個(gè)樣品穿插1個(gè)QC樣品進(jìn)樣，分析儀器的精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)據(jù)采集使用SCIEC OS系統(tǒng)。采用數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換軟件MSConvert將采集的原始數(shù)據(jù)（wiff格式）轉(zhuǎn)換成為XCMS可識(shí)別的mzXML格式文件，并導(dǎo)入數(shù)據(jù)處理軟件XCMS進(jìn)行峰的識(shí)別、對(duì)齊及過(guò)濾，最終獲得包括 m/z、保留時(shí)間（retention time，RT）及其峰強(qiáng)度的二維數(shù)據(jù)矩陣。在ESI+和ESI-兩種模式下，分別按照時(shí)間順序在色譜圖中隨機(jī)選取10個(gè)離子峰，根據(jù)XCMS軟件處理后得到的峰強(qiáng)度矩陣圖，分別計(jì)算每種方法5個(gè)樣品的峰強(qiáng)度均值，再根據(jù)稀釋倍數(shù)，計(jì)算各方法前處理后每10 μL血清中所測(cè)的10個(gè)離子峰峰強(qiáng)度及其變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用IBM SPSS Statistics 23軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。3種前處理方法所測(cè)峰強(qiáng)度以均值表示，多組間比較采用隨機(jī)區(qū)組的單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同血清前處理方法提取的代謝物特征總數(shù)

ESI+和ESI-掃描模式下獲得的液質(zhì)聯(lián)用原始譜圖數(shù)據(jù)經(jīng)格式轉(zhuǎn)化及XCMS軟件進(jìn)行預(yù)處理后，結(jié)果顯示，在ESI+模式下，方法二可檢測(cè)到最多的代謝物特征數(shù)（12 801個(gè)），方法三（8 502個(gè)）次之；ESI-模式下，方法二和方法三所檢測(cè)的代謝物特征數(shù)接近，分別為5 889個(gè)、5 528個(gè)；而方法一在ESI+和ESI-掃描模式下所檢測(cè)的代謝物特征數(shù)均最少，分別為7 896個(gè)、3 980個(gè)。

2.2 不同血清前處理方法所測(cè)代謝物的峰強(qiáng)度

ESI+和ESI-掃描模式下，方法二和方法三進(jìn)行前處理后，大部分離子峰的峰強(qiáng)度CV值＜25.00%，而方法一中大部分離子峰的峰強(qiáng)度CV值＞25.00%，見(jiàn)表1和表2，說(shuō)明方法二和方法三對(duì)血清中代謝物提取的重復(fù)性較好。3種前處理方法在ESI+和ESI-掃描模式下測(cè)得離子峰的峰強(qiáng)度均值比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中方法一與方法三比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但均大于方法二（均P＜0.05）；方法三的血清樣品離子基峰圖見(jiàn)圖1。以上結(jié)果表明，方法三更適于需要大樣本分析的血清代謝組學(xué)研究。

圖1 ESI+/ESI-掃描模式下檢測(cè)得到的血清樣品離子基峰圖Fig.1 Chromatogram of serum sample ion base peaks detected in ESI+/ESI-scan modes

表1 ESI+掃描模式下3種前處理方法測(cè)得的峰強(qiáng)度及CV值Tab.1 Peak intensity and CV measured by three pre-processing methods in ESI+scan mode

表2 ESI-掃描模式下3種前處理方法測(cè)得的峰強(qiáng)度及CV值Tab.2 Peak intensity and CV measured by three pre-processing methods in ESI-scan mode

2.3 儀器的精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性考察

在ESI+和ESI-掃描模式下，分別疊加QC樣品3次進(jìn)樣的總離子流色譜圖，結(jié)果顯示疊加效果均較好，見(jiàn)圖2。分別在QC樣品色譜圖的前、中、后隨機(jī)共選取10個(gè)離子峰的提取離子色譜圖進(jìn)行分析，結(jié)果顯示RT的偏差均＜0.1 min且其CV值均≤1.00%，各峰面積和峰強(qiáng)度的CV值均＜25.00%，見(jiàn)表3～4。以上結(jié)果表明本研究樣品分析過(guò)程中儀器的精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性均較好，滿(mǎn)足分析要求。

表3 ESI+掃描模式下QC樣品考察結(jié)果Tab.3 Investigation results of QC samples in ESI+scan mode

圖2 ESI+/ESI-掃描模式下QC樣品3次進(jìn)樣的總離子流色譜圖的疊加情況Fig.2 The stack of total ion current chromatograms of three injections of QC samples in ESI+/ESI-scan modes

表4 ESI-掃描模式下QC樣品考察結(jié)果Tab.4 Investigation results of QC samples in ESI-scan mode

3 討論

在基于液質(zhì)聯(lián)用的代謝組學(xué)分析中，去蛋白是人血清樣品前處理的關(guān)鍵，研究表明蛋白質(zhì)的存在對(duì)色譜柱壽命造成很大的影響，且對(duì)含量較低的代謝物的質(zhì)譜產(chǎn)生一定的干擾［12］，因此在進(jìn)行代謝組學(xué)分析前需要進(jìn)行去蛋白處理。目前血清樣品前處理常用的一種方法是有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)［13-15］，另一種方法是血清樣品經(jīng)有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)后再進(jìn)行濃縮復(fù)溶［16-18］，前者操作簡(jiǎn)便但可能沉淀蛋白不完全，而后者則操作繁瑣且耗時(shí)。本研究對(duì)3種不同的血清樣品前處理方法進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)單純?nèi)兑译娉恋淼鞍椎奶幚矸绞胶?jiǎn)便耗時(shí)短，測(cè)得的化合物峰強(qiáng)度亦較高，但該法對(duì)代謝物提取的重復(fù)性較差；同時(shí)可能由于稀釋的原因?qū)е乱恍┖枯^低的代謝物不易被檢測(cè)到，該法測(cè)得的代謝物特征總數(shù)較少。三倍乙腈沉淀后再通過(guò)濃縮復(fù)溶處理所提取的代謝物特征總數(shù)稍多且提取代謝物的重復(fù)性較好，但處理方式復(fù)雜且耗時(shí)；同時(shí)真空濃縮干燥過(guò)程中可能導(dǎo)致一些易揮發(fā)代謝物丟失，故該法所測(cè)得的代謝物峰強(qiáng)度偏低。一倍乙腈沉淀后再通過(guò)超濾管截留大分子的處理方式簡(jiǎn)便且耗時(shí)短，既能保證測(cè)得的代謝物的總量，又能保證測(cè)得的代謝物的峰強(qiáng)度，且代謝物提取的重復(fù)性較好，說(shuō)明該法更適于需要大樣本分析的血清代謝組學(xué)研究。為排除樣品分析過(guò)程中儀器對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，本研究同時(shí)采用穿插在檢測(cè)序列中的QC樣本對(duì)分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性進(jìn)行論證，結(jié)果精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性均較好，滿(mǎn)足分析要求。說(shuō)明本研究測(cè)試樣本之間的差別主要來(lái)自于樣本中提取的代謝物差異，不是來(lái)自分析方法誤差，證明在代謝組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的差異代謝物可靠。

綜上所述，本研究利用一倍乙腈沉淀蛋白后再通過(guò)超濾管截留大分子建立的血清樣本前處理方操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，能夠更全面保留和檢測(cè)到血清樣品中的小分子化合物，符合代謝組學(xué)的高通量研究的基本要求，適用于大批量樣品分析，是一種值得推廣的代謝組學(xué)血清樣品前處理方法。