miR-491-5p靶向FGFR4調(diào)節(jié)肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和遷移

趙天嬌耿建磊溫嬋任慧劉鋒魏平

作者單位：050051 石家莊 1河北省優(yōu)撫醫(yī)院普外科；河北省兒童醫(yī)院2普外科，3醫(yī)務(wù)處；4河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

肝母細(xì)胞瘤起源于胚胎發(fā)生時(shí)的祖細(xì)胞，是兒童常見(jiàn)的肝臟惡性腫瘤［1］，發(fā)病率約占兒童惡性腫瘤總數(shù)的1%，發(fā)病率持續(xù)增長(zhǎng)，且預(yù)后較差［2］。然而目前其發(fā)病分子機(jī)制尚未明確，也缺乏有效的治療靶點(diǎn)。microRNA（miRNA）是一類(lèi)進(jìn)化保守、長(zhǎng)度較短的非編碼RNA，已被證實(shí)在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3］。近年來(lái)，miR-491-5p也被發(fā)現(xiàn)在宮頸癌［4］、乳腺癌［5］等發(fā)揮抑癌作用。在肝母細(xì)胞瘤中也發(fā)現(xiàn)miR-491-5p低表達(dá)，且與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和糖酵解相關(guān)［6］。FGFR4是含有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的家族成員之一，在乳腺癌和胃癌中高表達(dá)且與腫瘤侵襲和放化療抗性相關(guān)，而miR-491-5p通過(guò)調(diào)節(jié) FGFR4可促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［7-10］。在肝癌細(xì)胞中FGFR4同樣過(guò)表達(dá)且促進(jìn)肝癌細(xì)胞進(jìn)展［11］。但是FGFR4是否參與小兒肝母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展尚未明確。

GSK3β/β-catenin信號(hào)通路是腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的重要通路，其中GSK3β是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過(guò)磷酸化β-catenin氨基末端的3個(gè)保守氨基酸殘基，調(diào)控細(xì)胞質(zhì)中β-catenin蛋白的穩(wěn)定性。當(dāng)穩(wěn)定的β-catenin蛋白在細(xì)胞質(zhì)積累至一定量時(shí)，隨即轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與核轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合并導(dǎo)致靶基因C-myc啟動(dòng)子暴露，使其激活并表達(dá)，致使腫瘤細(xì)胞惡性增殖和遷移［12］。研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)FGFR4表達(dá)可介導(dǎo)GSK3β/β-catenin信號(hào)通路激活并促進(jìn)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移［13］。而miR-491-5p和FGFR4在肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和遷移中是否具有調(diào)控作用有待進(jìn)一步探討。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-491-5p和FGFR4在肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表達(dá)并分析miR-491-5p與FGFR4的靶向關(guān)系及兩者對(duì)GSK3β/β-catenin信號(hào)通路的影響，為闡明肝母細(xì)胞瘤發(fā)病機(jī)制及尋找治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

收集河北省兒童醫(yī)院2018年3月至2019年10月收治的15例小兒肝母細(xì)胞瘤組織樣本及其相應(yīng)的癌旁正常組織。所有患者年齡均<4歲，術(shù)后病理診斷為小兒肝母細(xì)胞瘤，術(shù)前未行化療或放療。本研究獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，家屬知情同意。

正常肝細(xì)胞LO2和肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞HuH-6購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶和CCK-8試劑盒購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Trizol試劑購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；qRT-PCR試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；miR-491-5p mimics、miR-491-5p inhibitor由 Genepharma公司合成；LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；pcDNA3.1質(zhì)粒購(gòu)自云舟生物科技有限公司；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒和8 μm孔徑的Transwell小室購(gòu)自北京平皓生物技術(shù)有限公司；FGFR4、GSK3β、p-GSK3β、β-catenin、p-β-catenin、C-myc和 p-C-myc抗體購(gòu)自 Abcam 公司；兔抗β-actin抗體和兔抗鼠IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

正常肝細(xì)胞LO2用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞HuH-6用含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。將FGFR4基因序列克隆進(jìn)入pcDNA3.1載體。HuH-6細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 d用胰酶消化后計(jì)數(shù)，接種至6孔板（3.0×104/孔）內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)將 50 ng的miR-491-5p mimic、mimic NC分別轉(zhuǎn)染至HuH-6細(xì)胞，分別記為mimic組和mimic NC組，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，更換新鮮培養(yǎng)基。再將pcDNA3.1空載體和pcDNA3.1-FGFR4質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HuH-6細(xì)胞（已轉(zhuǎn)染miR-491-5p mimic），分別記為mimic+Pc組和mimic+Pc-FGFR4組，然后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)基。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-491-5p和FGFR4 mRNA的表達(dá)

采用Trizol試劑提取組織樣本或細(xì)胞中的總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA；應(yīng)用qRTPCR法擴(kuò)增miR-491-5p和FGFR4 mRNA的表達(dá)水平。PCR反應(yīng)條件：95℃變性15 s，57℃退火30 s，72℃延伸10 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系：cDNA模板2 ng，上下游引物各 0.4 μL，SYBR Primix Ex TaqTM 5 μL，ddH2O補(bǔ)充至10 μL。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-491-5p與FGFR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。miR-491-5p正向引物序列：5′-TTGACTTAGCTGGGTAGTGGGGA-3′，反向引物序列：5′-CAACCCAGCCAGGTAGAAGGGA-3′；FGFR4 正向引物序列：5′-TCCTACCTGAGGATGCTGGCCGCT-3′，反向引物序列：5′-ACCGTCGGCTCCGAAGCTGCTGCCGA-3′；β-actin正向引物序列：5′-CCGTTGCCCTGAGGCTCTTT-3′，反向引物序列：5′-GATCTGTCTGTCTTCTGTCTC-3′。

1.4 Western blot檢測(cè) FGFR4 和 GSK3β/β-catenin 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

用RIPA細(xì)胞裂解液裂解未轉(zhuǎn)染及已轉(zhuǎn)染的HuH-6細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，用BSA法檢測(cè)細(xì)胞蛋白濃度。每組取120 μg蛋白進(jìn)行變性、SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶4℃封閉1 h，然后加入鼠抗人的FGFR4、GSK3β、p-GSK3β、β-catenin、p-β-catenin、C-myc和p-C-myc抗體（均1∶1 500）搖床4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次；加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗（1∶2 000），37℃孵育1 h，TBST洗膜3次后，顯影、曝光并采集圖片，用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

取轉(zhuǎn)染后的HuH-6細(xì)胞，更換無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，用胰酶消化、培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)。取200 μL細(xì)胞懸液（2.5×104個(gè)）接種于Transwell小室上室，下室加入15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；用棉簽擦除上室細(xì)胞，95%乙醇固定10 min，結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗滌3次后，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖能力

取未轉(zhuǎn)染的HuH-6細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化、培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)。以2.5×104/孔接種至96孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至60%時(shí)，按方法1.2進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并置于上述條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別于48 h和72 h，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的光密度（OD）值。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-491-5p和FGFR4的靶向關(guān)系

將 FGFR4 3′UTR 野生型/突變型（WT/MUT）分別克隆至熒光素酶報(bào)告載體pmirGLO載體中，然后分別將miR-491-5p mimic和mimic NC與pmirGLO-FGFR4-WT或pmirGLO-FGFR4-MUT共轉(zhuǎn)染至HuH-6細(xì)胞中。48 h后收集上述共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，應(yīng)用熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶的活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。癌組織和癌旁正常組織miR-491-5p與FGFR4的表達(dá)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey檢驗(yàn)。以雙側(cè)P＜0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-491-5p、FGFR4在小兒肝母細(xì)胞瘤組織和肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，小兒肝母細(xì)胞瘤組織中miR-491-5p的表達(dá)低于癌旁正常組織（t=54.653，P=0.005），而FGFR4的表達(dá)高于癌旁正常組織（t=32.592，P=0.015），見(jiàn)圖1A～B。HuH-6細(xì)胞中miR-491-5p mRNA的表達(dá)低于 LO2 細(xì)胞（t=26.371，P=0.012），見(jiàn)圖 1C；FGFR4 mRNA及蛋白表達(dá)則高于正常肝細(xì)胞LO2（t=39.572，P=0.013；t=79.158，P=0.011），見(jiàn)圖 1D～E。

2.2 過(guò)表達(dá)miR-491-5p的HuH-6細(xì)胞中FGFR4的表達(dá)

qRT-PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，mimic組、mimic NC組和Control組細(xì)胞中FGFR4 mRNA和蛋白表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.715，P＜0.01；F=12.157，P＜0.01），多重比較結(jié)果顯示，mimic 組 FGFR4 mRNA和蛋白表達(dá)量低于Control組和mimic NC組（P＜0.05），見(jiàn)圖 2。

圖2 過(guò)表達(dá)miR-491-5p對(duì)HuH-6細(xì)胞中FGFR4表達(dá)的影響Fig.2 Effect of overexpression miR-491-5p on the FGFR4 expression in HuH-6 cells

2.3 miR-491-5p靶向結(jié)合FGFR4

通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站TargetScan進(jìn)行生物學(xué)信息預(yù)測(cè)，miR-491-5p與FGFR4 mRNA的3′UTR之間存在互補(bǔ)配對(duì)序列，見(jiàn)圖3A。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與mimic NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-491-5p mimic的野生型組HuH-6細(xì)胞的熒光素酶活性降低（t=13.062，P=0.003），而轉(zhuǎn)染miR-491-5p mimic的突變型組HuH-6細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖3B。

圖3 miR-491-5p與FGFR4的靶向關(guān)系Fig.3 Targeting relationship between miR-491-5p and FGFR4

2.4 過(guò)表達(dá)miR-491-5p抑制HuH-6細(xì)胞遷移和增殖

單因素方差分析顯示，mimic組、mimic NC組和Control組細(xì)胞遷移數(shù)及OD值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.527，P=0.016；F=20.916，P=0.013），多重比較發(fā)現(xiàn)，mimic組細(xì)胞遷移數(shù)及OD值均低于Control組與 mimic NC 組（P<0.05），見(jiàn)圖 4。

圖4 過(guò)表達(dá)miR-491-5p對(duì)HuH-6細(xì)胞遷移和增殖的影響Fig.4 Effect of overexpression of miR-491-5p on the migration and proliferation of HuH-6 cells

2.5 上調(diào)miR-491-5p和FGFR4表達(dá)促進(jìn)HuH-6細(xì)胞增殖和遷移

單因素方差分析顯示，mimic組、mimic+Pc組、mimic+Pc-FGFR4組和Control組細(xì)胞遷移數(shù)及OD值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.379，P=0.012；F=23.157，P<0.018）。多重比較發(fā)現(xiàn)，mimic組與mimic+Pc組的HuH-6細(xì)胞遷移數(shù)和OD值均低于Control組與mimic+Pc-FGFR4組（P<0.05），見(jiàn)圖 5。

圖5 上調(diào)miR-491-5p和FGFR4表達(dá)對(duì)HuH-6細(xì)胞增殖和遷移的影響Fig.5 Effect of up-regulation of miR-491-5p and FGFR4 expression on the proliferation and migration of HuH-6 cells

2.6 上調(diào)miR-491-5p和FGFR4表達(dá)促進(jìn)GSK3β/βcatenin信號(hào)通路激活

單因素方差分析顯示，mimic組、mimic NC組和Control 組 p-GSK3β/GSK3β、p-β-catenin/β-catenin 及p-C-myc/C-myc比值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.547，P=0.017），多重比較顯示，mimic組3項(xiàng)指標(biāo)比值均低于 Control組與 mimic NC 組（P＜0.05），見(jiàn)圖6A。mimic組、mimic+Pc組、mimic+Pc-FGFR4組和 Control組p-GSK3β/GSK3β、p-β-catenin/β-catenin 及 p-C-myc/C-myc比值比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.108，P=0.015），其中mimic組與mimic+Pc組3項(xiàng)指標(biāo)的比值均低于 Control組和 mimic+Pc-FGFR4組（P＜0.05），見(jiàn)圖6B。

圖6 上調(diào)miR-491-5p和FGFR4表達(dá)促進(jìn)GSK3β/β-catenin信號(hào)通路激活Fig.6 Up-regulation of miR-491-5p and FGFR4 expression promoted the activation of GSK3β/β-catenin signaling pathway

3 討論

miRNA是一類(lèi)小的單鏈非編碼RNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制特定目標(biāo)mRNA的表達(dá)，成為基因表達(dá)的主要調(diào)控因子［14-15］。近年研究發(fā)現(xiàn)部分miRNA在腫瘤細(xì)胞包括肝母細(xì)胞瘤中表達(dá)量的改變是影響其功能的主要原因。如ECEVIT等［16］研究發(fā)現(xiàn)，miR-17在肝母細(xì)胞瘤組織中低表達(dá)且與預(yù)后相關(guān)。CUI等［17］報(bào)道m(xù)iR-186通過(guò)Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)肝母細(xì)胞瘤進(jìn)展。也有研究報(bào)道m(xù)iR-491-5p在小兒肝母細(xì)胞瘤中低表達(dá)［6］。本研究亦發(fā)現(xiàn)miR-491-5p在小兒肝母細(xì)胞瘤組織和肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞HuH-6中低表達(dá)，且過(guò)表達(dá)miR-491-5p可抑制HuH-6細(xì)胞增殖與遷移。而既往研究顯示，miR-491-5p在腫瘤細(xì)胞中的功能發(fā)揮依賴(lài)于其與特定靶向基因的相互作用［18-19］。本研究通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站TargetScan進(jìn)行生物學(xué)信息預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-491-5p與FGFR4 mRNA的3′UTR之間存在互補(bǔ)配對(duì)序列，且在細(xì)胞中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-491-5p可抑制FGFR4表達(dá)，說(shuō)明在肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞中miR-491-5p可靶向負(fù)調(diào)控FGFR4表達(dá)。

FGFR4是FGFR蛋白家族成員之一，在胚胎發(fā)育、傷口愈合和血管生成的多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［20］。已有研究報(bào)道顯示，F(xiàn)GFR4在結(jié)直腸癌、乳腺癌中過(guò)表達(dá)，且與患者生存率低下有關(guān)［21-22］。在肝癌細(xì)胞研究中也發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)GFR4可抑制細(xì)胞增殖和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR4在小兒肝母細(xì)胞瘤組織和HuH-6細(xì)胞中高表達(dá)，過(guò)表達(dá)FGFR4可逆轉(zhuǎn)miR-491-5p對(duì)HuH-6細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用，說(shuō)明miR-491-5p可能通過(guò)調(diào)控FGFR4影響HuH-6細(xì)胞增殖和遷移。而既往研究報(bào)道，miR-491-5p靶向基因FGFR4被激活后，會(huì)導(dǎo)致受體二聚、自磷酸化和下游信號(hào)通路激活，而這些信號(hào)通路影響細(xì)胞分化、增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成和化療耐受等［24］。GSK3β/β-catenin信號(hào)通路是參與調(diào)控腫瘤增殖和遷移的重要通路［25］。研究顯示，F(xiàn)GF19激活FGFR4可介導(dǎo)GSK3β/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［26］。本研究進(jìn)一步檢測(cè) GSK3β/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-491-5p可抑制GSK3β/β-catenin信號(hào)通路激活，而過(guò)表達(dá)FGFR4不僅可逆轉(zhuǎn)miR-491-5p對(duì)HuH-6細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用，還減弱了miR-491-5p對(duì)GSK3β/β-catenin信號(hào)通路的抑制作用，表明miR-491-5p可能通過(guò)FGFR4調(diào)控 GSK3β/β-catenin 信號(hào)通路。

綜上所述，miR-491-5p在小兒肝母細(xì)胞瘤組織中低表達(dá)，而FGFR4高表達(dá)，miR-491-5p可能通過(guò)靶向調(diào)控FGFR4表達(dá)而阻止GSK3β/β-catenin信號(hào)通路從而抑制肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖與遷移。