CASC19通過維持巨噬細胞M1型極化狀態(tài)保持對結直腸癌的抑制作用

葛將 吳靜， 張澍田 閔力 劉揆亮 李倩 李楠杉

作者單位：100038 北京 1首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院消化科；100050 北京 2首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院消化分中心，國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心，消化疾病癌前病變北京市重點實驗室，北京消化中心；100730 北京 3首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院科技處

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球死亡人數排名第二的惡性腫瘤［1］。CRC具有被大量免疫細胞浸潤的微環(huán)境，即腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME），包括腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）、單核細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞等，其中TAMs是TME中最豐富的免疫細胞［2］。TAMs來自單核細胞的定向分化，一般來說，單核細胞被腫瘤細胞的分泌因子CCL2、CCL3、VEGF等招募到TME中，又被TME中的其他因子（如IL-12等）誘導分化為TAMs。在不同刺激條件下TAMs還會繼續(xù)分化為兩種重要亞型：經典活化的M1型和替代活化的M2型［3］。有研究顯示，單核細胞浸潤到不同組織分化成巨噬細胞這一復雜的分化過程需要非編碼RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）、轉錄因子、細胞因子的協(xié)同作用［4］。但是，不同亞型TAMs之間相互轉化的關鍵分子機制并不清楚。

長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是長度超過200個堿基對、不編碼蛋白質的內源性RNA［5］。既往研究表明正常巨噬細胞在不同條件下誘導極化后具有特征差異顯著的lncRNAs表達譜，且lncRNAs異常表達可能在調控巨噬細胞極化中發(fā)揮重要作用［6］。lncRNAs還可通過調控巨噬細胞極化影響腫瘤細胞遷移和侵襲［7］，如lncRNA cox-2能調控巨噬細胞極化方向，從而抑制肝癌細胞侵襲和遷移［8］。lncRNA ANCR則能通過抑制M1極化促進胃癌細胞侵襲和遷移［9］。癌癥易感基因19（the cancer susceptibility 19，CASC19）是位于染色體8q24.21上324 bp的lncRNA，研究表明CASC19在CRC組織中表達缺失，且與CRC進展密切相關［10］。然而，CASC19如何調控CRC進展以及是否通過調控TAMs或其他TME相關細胞發(fā)揮作用及其機制目前尚不清楚。本研究旨在探討CASC19誘導巨噬細胞從M1型向M2型轉化的潛在功能，并明確這一過程對TAMs及結腸癌細胞增殖及遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

人單核細胞型淋巴瘤細胞系Thp1、結直腸癌細胞系SW480購自中國醫(yī)學科學院；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；胰蛋白酶購自Solarbio公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTS）購自武漢博士德公司；二甲基亞砜購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）、LPS 購自 SIGMA 公司；IFN-γ、IL-4 購自PEROTECH 公司；CCL22、CD206、IL-10、CD40、IL-1β、CD163、GAPDH引物購自上海生工生物工程股份有限公司；FBS、LipofectamineTM3000購自Thermo Fisher Scientific公司；siRNA CASC19及內參購自廣州銳博生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒、TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit逆轉錄和Fast Star Universal SYBR Green Mastermix擴增（RT-qPCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司；Transwell遷移小室購自Millicell公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及不同亞型巨噬細胞誘導

人單核細胞型淋巴瘤細胞系Thp1用含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2全濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數生長期的細胞（2×106/mL）鋪至6孔板中，使用終濃度100 ng/mL PMA誘導48 h為貼壁巨噬細胞M0。吸除原培養(yǎng)基，設為M0組、M1組、M2組，M0組用含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，M1組用含100 ng/mL LPS和 20 ng/mL IFN-γ的10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，M2組用含100 ng/mL IL-4的10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.3 RT-qPCR檢測M1/M2分子標記及CASC19 mRNA表達水平

采用TRIzol試劑法提取M0組、M1組和M2組細胞的總RNA，按照TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，進行RT-qPCR擴增CCL22、CD206、IL-10、CD40、IL-1β、CD163、GAPDH、CASC19，以GAPDH為內參。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性 5 s，60 ℃退火/延伸 1 min，共 40 個循環(huán)。用 2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 目的基因的引物序列Tab.1 Primer sequence of target gene

1.4 細胞轉染與分組

取M1型巨噬細胞接種于6孔板（2×106/孔）中，分別轉染200 nmol/L NC-siRNA 以及50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L的CASC19-siRNA，依次記為NC-siRNA組、50 nmol/L組、100 nmol/L組、200 nmol/L組，按照LipofectamineTM3000轉染試劑盒說明進行操作。

1.5 條件培養(yǎng)基的制備

NC-siRNA組和CASC19-siRNA組M1型巨噬細胞培養(yǎng)48h后，收集兩組上清分別為M1 NC-CM組和M1 SI-CM組，12 000 r/10 min離心，去除沉淀，將多次收集的上清混勻，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 活細胞實時動態(tài)成像檢測細胞增殖能力

SW480細胞消化離心接種至96孔板（2×103/孔），分別加入M1 SI-CM或M1 NC-CM 100 μL/孔進行培養(yǎng)，4 h拍照1次，置于活細胞實時動態(tài)成像儀下觀察，根據儀器指南手冊記錄并統(tǒng)計數據，實驗重復3次。

1.7 MTS法檢測細胞增殖能力

取對數生長期的SW480細胞消化后接種于96孔板（1×103/孔），分別加入M1SI-CM或M1NC-CM 100 μL/孔進行培養(yǎng)，分別于 0 h、24 h、48 h、72 h 時每孔加入MTS試劑20 μL繼續(xù)孵育2 h。酶標儀測定各孔490nm波長處光密度（OD）值，每組重復3次，取平均值。細胞增殖活力（%）=［（實驗組OD值-空白對照組OD值）/空白對照組OD值］×100%。

1.8 Transwell實驗檢測細胞遷移能力

SW480細胞消化后重懸，取適量細胞懸液接種于Transwell上室（8×104/孔），每孔體積 300 μL；下室分別加入M1 SI-CM或M1 NC-CM，700 μL/孔，于37℃、5% CO2全濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，孵育24 h。PBS清洗3次，用0.1%結晶紫甲醇工作液染色，棉簽擦去上室內細胞，PBS沖洗干凈后置于正置顯微鏡下觀察，分別選取膜上側、膜左側和膜右側3個視野拍照，計算穿膜細胞數。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad Prism 8、Image J進行數據分析，以均數±標準差（±s）表示。M0、M1、M2 分子標記和CASC19 mRNA表達水平比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），采用D′Agostino-Pearson和Shapiro-Wilk檢驗進行正態(tài)分析，若差異有統(tǒng)計學意義，則采用LSD-t法進行多重比較。CASC19敲降效果比較采用獨立樣本t檢驗。細胞增殖數據比較采用二因素方差分析檢驗，細胞遷移數據比較采用獨立樣本t檢驗。以雙側P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同亞型巨噬細胞的獲取與鑒定

2.1.1 PMA誘導M0型巨噬細胞的形成 100 ng/mL PMA誘導48 h后，懸浮狀態(tài)呈串珠狀的Thp1細胞轉變?yōu)橘N壁狀態(tài)M0細胞（圖1），表明巨噬細胞M0誘導成功。

圖1 PMA誘導M0型巨噬細胞的形成（比例尺：100 μm）Fig.1 PMA induced the formation of M0 type macrophage（scale bar：100 μm）

2.1.2 巨噬細胞M0誘導極化 RT-qPCR檢測結果顯示，M2型巨噬細胞分子標記CCL22、CD206、IL-10在M2中高表達（圖2A～C）；M1型巨噬細胞分子標記IL-1β、CD40在 M1中高表達（圖 2D～E）；以上標志物在M1和M2間的表達差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），表明巨噬細胞亞型M1/M2極化成功。

圖2 巨噬細胞M0誘導極化Fig.2 Induction of macrophage M0 polarization

2.2 巨噬細胞中CASC19 mRNA的表達水平及CASC19敲降效果驗證

RT-qPCR檢測結果顯示，與M0組和M2組比較，CASC19在M1組中的表達水平明顯升高（P＜0.05，圖3A）；與 NC-siRNA 組比較，50 nmol/L、100 nmol/L和200 nmol/L組CASC19的表達水平均降低（P＜0.05，圖3B）。其中選取敲降效率最佳的200 nmol/L濃度siRNA進行后續(xù)實驗。

圖3 巨噬細胞中CASC19 mRNA的表達水平及CASC19敲降效果驗證Fig.3 Expression of CASC19 mRNA in macrophages and testing transfection efficiency of knockdown CASC19

2.3 敲降CASC19對SW480細胞增殖和遷移的影響

活細胞實時動態(tài)成像檢測結果顯示，與M1 NC-CM處理組比較，M1 SI-CM處理組中SW480細胞增殖速度顯著增高（P＜0.05，圖4A）。MTS法檢測結果顯示，與M1 NC-CM處理組相比，0 h、24 h、48 h、72 h時M1 SI-CM處理組細胞增殖活力均顯著增高（圖4B）。Transwell法檢測結果顯示，SW480細胞中，M1 SI-CM處理組遷移細胞數較M1 NC-CM處理組顯著增多（圖4C），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

圖4 敲降CASC19對SW480細胞增殖和遷移的影響Fig.4 Effect of proliferation and migration on SW480 cells by knockdown CASC19

2.4 敲降CASC19使M1型巨噬細胞的M1亞型分子特征消除

在M1型巨噬細胞中敲降CASC19后，RT-qPCR檢測結果顯示，與NC組比較，SI組細胞的M2分子標記CD206、IL-10、CD163 表達水平升高（圖 5A～C），M1分子標記CD40、IL-1β表達水平降低（圖5D～E），差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.05）。

圖5 敲降CASC19使M1型巨噬細胞的M1亞型分子特征消除Fig.5 Eliminating M1 macrophage molecular markers with knockdown CASC19 in M1 macrophage

3 討論

腫瘤組織中異常表達的lncRNA可以通過不同機制對腫瘤發(fā)展產生促進或抑制作用，越來越多的證據表明lncRNA CASC19與多種不同類型腫瘤相關，例如能促進非小細胞肺癌［11］、透明細胞腎癌［12］、結直腸癌［13］等多種腫瘤細胞增殖和轉移，且與進展期胃癌進展及預后不良相關［14］。然而lncRNA CASC19在腫瘤細胞以外的TME其他組分中是否具有其他功能目前并不清楚。本研究以TAMs作為核心研究對象，探究CASC19在M1亞型巨噬細胞中的作用。本研究成功將巨噬細胞分化為M1型和M2型兩種亞型，在M1型巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)CASC19高表達。然后通過收集敲降CASC19后的M1型巨噬細胞上清培養(yǎng)結直腸癌細胞SW480，發(fā)現(xiàn)CASC19敲降后，M1型巨噬細胞對SW480細胞增殖和遷移的抑制能力顯著減弱，同時M1型巨噬細胞敲降CASC19后M2分子標記CD206、IL-10、CD163的表達明顯升高，而M1分子標記CD40、IL-1β表達則明顯下降，表明M1型巨噬細胞敲降CASC19后喪失了其對M1型巨噬細胞關鍵分子特征的維持，從而可能間接喪失了對SW480細胞增殖和遷移的抑制作用?？紤]敲降CASC19可能通過競爭性內源性RNA（ceRNA）機制影響轉錄過程以及下游蛋白表達而促使M1型巨噬細胞向M2方向極化，然而具體機制還需根據CASC19在M1型巨噬細胞中的定位進一步分析。目前已知CASC19可以靶向miR-301b-3p/LDLR軸［11］及miR-140-5p/CEMIP軸［13］，然而這些ceRNA功能是否通過某種機制，例如影響某種誘導M2的細胞因子表達或分泌過程，從而影響巨噬細胞極化仍需進一步探索。

TME是一個復雜的生理和生化系統(tǒng)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉移方面起重要作用［7］。作為數量最豐富的TME相關免疫細胞，TAMs可通過抑制免疫細胞活性、誘導新生血管形成和支持癌癥干細胞等多種不同方式促進腫瘤生長［15］。本研究顯示lncRNA CASC19在維持M1型巨噬細胞對結腸癌細胞增殖和遷移的抑制功能中起關鍵作用，而這種作用可能依賴于其對巨噬細胞M1極化狀態(tài)的保持，這是lncRNA參與巨噬細胞與腫瘤細胞相互作用的一種較為新穎的機制模式，其中是否還有其他lncRNA或分子原件參與仍有待進一步探索。

綜上所述，CASC19在M1型巨噬細胞中高表達，敲降M1型巨噬細胞中的CASC19表達可促進結直腸癌細胞增殖和遷移，其機制可能與極化為M2型巨噬細胞相關。未來通過全面揭示lncRNA在腫瘤組織及其微環(huán)境中的其他組分中的作用，有望為臨床腫瘤診治提供新的思路和方法。