外泌體及其miRNA治療化療所致早發(fā)性卵巢功能不全的研究進(jìn)展*

張秀娟，張瑞紅，郝 晶，呂夢瀟，蘇 嬋，穆玉蘭**

(1.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科，濟(jì)南 250021；2.山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250012))

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每8對育齡夫婦中就有1對患不孕不育癥[1]，不孕不育已成為繼心腦血管和腫瘤之后威脅人類健康的第三大疾病，而腫瘤生育作為不孕不育治療領(lǐng)域的新型分支，其重要性逐漸受到重視。流行病學(xué)文獻(xiàn)報(bào)道，世界范圍內(nèi)50歲以下婦女5%罹患腫瘤。由于腫瘤的早診斷和早治療措施的推廣，腫瘤患者5年生存率顯著提高，且年輕患者生存率顯著高于高齡患者。據(jù)報(bào)道，35歲以下乳腺癌患者的生存率為90.91%，35～45歲患者的生存率為57.84%[2]。化療作為腫瘤治療的重要方案，可導(dǎo)致卵巢不可逆轉(zhuǎn)損傷，因此育齡期婦女和青少年女性抗癌期間的生育力保存受到更多的關(guān)注[3]。美國生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)(ASRM)推薦的生育力保存方式，僅有胚胎和成熟卵的凍存[4]。此外，若抗苗勒管激素(Anti-Mullerian Hormone,AMH)基礎(chǔ)水平持續(xù)低于3.32ng/mL，放療后即使沒有閉經(jīng)，也可能導(dǎo)致生育問題[5]。雖可長期使用激素補(bǔ)充治療(hormone replacement therapy，HRT)緩解圍絕經(jīng)期癥狀，但不能防止其發(fā)生和進(jìn)展，因此迫切需為早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)患者找到一種新的臨床治療策略。近年研究發(fā)現(xiàn)，卵巢組織、干細(xì)胞及其外泌體移植可部分或完全恢復(fù)化療性POI，其中外泌體以及其轉(zhuǎn)運(yùn)的miRNA為POI的診治提供了新思路。

1 化療所致POI的病因及機(jī)制

POI是指卵巢功能衰竭所導(dǎo)致的女性在40歲之前出現(xiàn)閉經(jīng)的現(xiàn)象，特點(diǎn)是原發(fā)或繼發(fā)性閉經(jīng)，血促性腺激素水平升高、雌激素水平降低、卵泡數(shù)量減少等[6]。POI分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種。原發(fā)性POI一般由遺傳、免疫、炎癥、酶代謝紊亂等引起，但大多原因未明；繼發(fā)性POI一般由手術(shù)、放療、化療和其他接觸毒性物質(zhì)引起[7]。大劑量放療、化療或骨髓移植可使超過90%的年輕女性惡性腫瘤患者的病情得到緩解，但對卵巢功能和生育力造成不良影響。化療造成卵巢功能衰退的主要機(jī)制可分為兩類：(1)對卵母細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞(ovarian granulosa cells，OGCs)的直接毒性作用；(2)通過損傷生長卵母細(xì)胞間接造成原始卵母細(xì)胞過度活化從而耗竭[8]。其中化療藥物順鉑在化療過程中使原始卵母細(xì)胞庫持續(xù)激活、卵泡過度凋亡導(dǎo)致卵巢衰竭；而化療藥物環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)誘導(dǎo)卵巢間質(zhì)細(xì)胞和顆粒細(xì)胞水腫和凋亡，通過線粒體釋放細(xì)胞色素c激活凋亡通路，誘導(dǎo)DNA損傷，從而消除高度分裂的細(xì)胞，如卵母細(xì)胞[9]。造成原始卵母細(xì)胞凋亡或激活的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一為磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tension homolog,PTEN)依賴性信號(hào)途徑。研究表明，PTEN/AKT/FOXO3信號(hào)途徑參與了小鼠原始卵母細(xì)胞和體外培養(yǎng)的人卵母細(xì)胞的激活，而PTEN抑制劑則可解除其抑制功能[10]。Huang等[6]研究表明，化療后患者卵巢功能可出現(xiàn)一定程度的恢復(fù),性激素改變及化療引起的閉經(jīng)在一定程度上可以逆轉(zhuǎn),恢復(fù)情況與化療藥物的累計(jì)劑量和卵巢損傷程度有關(guān)。但目前關(guān)于化療所致POI尚無明確的治療方法，只能根據(jù)相關(guān)臨床癥狀采取相應(yīng)措施。

2 干細(xì)胞用于POI治療

POI患者使用HRT后，癌癥風(fēng)險(xiǎn)及副作用增加，因此科學(xué)家提出運(yùn)用干細(xì)胞治療POI。干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的細(xì)胞，并且已有研究表明人羊膜、臍帶、骨髓、脂肪等來源的間充質(zhì)干細(xì)胞以及人羊膜上皮細(xì)胞、羊水干細(xì)胞卵巢注射可部分或完全恢復(fù)卵巢功能。但以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療仍面臨一些挑戰(zhàn)，包括移植排斥、腫瘤轉(zhuǎn)化、來源有限、倫理問題等，導(dǎo)致其在臨床應(yīng)用中受到限制[11]?；诖?，研究者著眼于干細(xì)胞內(nèi)的有效物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)外泌體不僅可治療某些疾病，還可在胚胎發(fā)育、配子發(fā)生和受精的生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。相較于干細(xì)胞，外泌體具有低免疫原性、不致瘤性、高臨床安全性和低倫理風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)[12]。國內(nèi)外研究已證實(shí)，外泌體在改善POI方面具有重要作用。

3 外泌體用于POI治療

外泌體介導(dǎo)的干細(xì)胞與靶細(xì)胞之間的相互作用作為新的細(xì)胞間作用方式，可能為臨床治療POI提供新的策略。外泌體屬于細(xì)胞多泡體，是多泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外的一種直徑小于150nm的均一膜性囊泡，通過攜帶mRNA、miRNA、circRNAs、lncRNAs及蛋白質(zhì)等信號(hào)分子，借助靶細(xì)胞內(nèi)化、配體-受體相互作用或脂膜融合來完成鄰近或遠(yuǎn)距離細(xì)胞間信號(hào)傳遞，進(jìn)而發(fā)揮重要的生理或病理功能[13-14]。研究病變組織外泌體及其成分變化為發(fā)現(xiàn)新的疾病診斷標(biāo)記物、探索新的發(fā)病機(jī)制以及開發(fā)新的治療措施提供可靠的技術(shù)手段和依據(jù)。

3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體 間充質(zhì)干細(xì)胞是多能干細(xì)胞，優(yōu)點(diǎn)是容易獲得和免疫原性不完全，可來源于骨髓、臍帶、羊膜、脂肪等組織。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有來源方便、無倫理問題等優(yōu)點(diǎn)；缺點(diǎn)是對同種異體移植產(chǎn)生免疫反應(yīng)及潛在的致瘤性[15]。而外泌體是較為合適的選擇：(1)與干細(xì)胞相比，安全，無致瘤傾向；(2)非免疫原性外泌體在體內(nèi)耐受性好，循環(huán)半衰期長，免疫原性低[16]。Sun等[8]證實(shí)，BMSCs來源的外泌體(BMSCs derived exosomes，BMSCs-Exos)可改善卵巢早衰(premature ovrian failure，POF)小鼠的卵泡形態(tài)，抑制凋亡相關(guān)蛋白c-caspase 3、p53表達(dá)；與原代卵巢顆粒細(xì)胞(ovarian granulosa cells,OGCs)共培養(yǎng)，明顯抑制順鉑誘導(dǎo)的OGCs凋亡，改善卵泡衰竭和閉鎖，提高細(xì)胞活力。Yang等[7]發(fā)現(xiàn)，BMSCs-Exos移植顯著恢復(fù)POF大鼠的發(fā)情周期，增加始基卵泡和竇卵泡數(shù)，提高血清中E2和AMH水平，降低FSH、LH及caspase 3和caspase 9水平，緩解CTX所致的卵巢損傷。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSCs)表達(dá)了BMSCs的全部生物學(xué)特性，且具有良好的增殖分化潛能，臨床應(yīng)用廣泛[17]。Sun等[18]研究表明，hUMSCs-Exos使順鉑組Bcl-2表達(dá)上調(diào)，bax、caspase-3和PARP表達(dá)下調(diào)以保護(hù)OGCs，提示hUMSCs-Exos體外預(yù)防和治療化療誘導(dǎo)的OGCs凋亡。Ding等[16]表明，hUMSCs-Exos增加POI小鼠OGCs及卵泡的增殖速率，降低凋亡率，且呈劑量依賴性。其分子機(jī)制主要是通過抑制CTX損傷的OGCs中SIRT7及下游靶基因的表達(dá)，從而恢復(fù)卵巢功能。同年該課題組首次發(fā)現(xiàn)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs)來源的外泌體(hAMSCs-Exos)能促進(jìn)卵巢細(xì)胞增殖，降低OGCs和卵母細(xì)胞的SIRT4和ROS水平，并改善POI小鼠卵巢重量和產(chǎn)仔數(shù)[19]。Huang等[6]發(fā)現(xiàn)，人脂肪干細(xì)胞(human adipose mesenchymal stem cells，hADSCs)來源外泌體(hADSCs-Exos)可恢復(fù)化療損傷的卵巢功能，顯著促進(jìn)卵泡增殖，抑制細(xì)胞凋亡，使相關(guān)激素E2、AMH、FSH水平升高至正常。此外，hADSCs-Exos通過激活SMAD抑制凋亡基因Fas、FasL、caspase-3和caspase-8的表達(dá)，表明其可通過調(diào)節(jié)SMAD通路來恢復(fù)POI患者卵巢功能。

3.2 羊水干細(xì)胞及羊膜上皮細(xì)胞來源外泌體 羊水干細(xì)胞(amniotic ?叢uid stem cells，AFSCs)來源于胚胎外層，是兼具胚胎干細(xì)胞和成人干細(xì)胞的多能干細(xì)胞，與間充質(zhì)干細(xì)胞相比增殖更快。Xiao等[20]證明，AFSCs-Exos能抑制CTX所致OGCs的凋亡。人羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelial cell，hAECs)保留了胚胎干細(xì)胞的特性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗炎特性和低免疫原性[21]。由于這些有利的特點(diǎn)，hAECs已在再生醫(yī)學(xué)廣泛應(yīng)用，在肺損傷、腦損傷和肝纖維化等移植治療后取得了良好的效果[22-23]。Zhang等[6]證實(shí)，hAECs-Exos能明顯抑制卵巢衰竭引起的OGCs凋亡，保護(hù)卵巢血管免受損傷，參與維持受損卵巢中原始卵泡數(shù)，改善卵巢功能。并通過KEEG和GO分析表明，hAECs來源的外泌體逆轉(zhuǎn)化療影響的某些生物學(xué)過程，包括棕色脂肪細(xì)胞分化、脂肪代謝過程或途徑、增殖物激活受體γ(PPARg)和AMP活化蛋白激酶信號(hào)途徑，同時(shí)該過程證實(shí)hAEC-Exos具有修復(fù)POF小鼠卵巢功能的潛力。

總之，某些干細(xì)胞來源的外泌體可改善化療所致POI/POF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的內(nèi)分泌及生殖功能。但是由于外泌體提取需要耗費(fèi)大量精力，并且純度及量不能達(dá)到預(yù)期，因此尋求外泌體中發(fā)揮作用的有效物質(zhì)是新的突破點(diǎn)。

4 外泌體miRNA用于POI治療

4.1 外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的miRNA miRNA是一類長度約為22～24個(gè)堿基的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，廣泛存在于真核生物體內(nèi)，并在進(jìn)化上相對保守，通過與Agonaute一起結(jié)合在信使mRNA3'非編碼區(qū)(UTR)來調(diào)節(jié)基因的翻譯水平。miRNA有自己特異的結(jié)合靶位，在細(xì)胞增殖、分化、遷移、維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)以及凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[24]。miRNA的異常表達(dá)與多種疾病密切相關(guān)，如來自癌細(xì)胞的外泌體miR-205能調(diào)控血管生成和腫瘤的轉(zhuǎn)移[25]；miR-106a與卵巢發(fā)育密切相關(guān)，其表達(dá)下調(diào)可抑制卵巢癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[18]。近年miRNA與POI的研究逐漸增多，這些研究不僅證實(shí)了外泌體中miRNA對POI的治療作用，還探討驗(yàn)證了相關(guān)機(jī)制。

4.2 外泌體miRNA治療POI Xiao等[20]發(fā)現(xiàn)，AFSCs-Exos來源的miR-10a可抑制OGCs凋亡，阻止化療后卵泡閉鎖，可能有助于卵泡的保存；hAEC-Exos來源的miR-1246和miR-21-5p過表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)化療引起的凋亡蛋白caspase 3的表達(dá)[6]。另有研究證實(shí)huMSC-Exos來源的miR-644-5p分別通過調(diào)節(jié)靶基因PTEN、p53抑制受損的OGCs凋亡，抑制化療所致的卵巢衰竭[8]。2019年江蘇大學(xué)朱曉蘭課題組通過miR-144-5p抑制PTEN來改善化療導(dǎo)致的卵巢衰竭癥狀[7]。2020年Ding等[16]研究顯示，huMSCs-Exos通過激活 miR-17-5p 抑制SIRT7及其下游靶基因的表達(dá)改善POI患者的卵巢功能，卵巢總卵泡數(shù)量明顯增加，血清E2和AMH水平明顯升高，卵巢大小和重量明顯增加。進(jìn)一步研究表明huMSCs-Exos通過遞送 miR-17-5p 抑制ROS的積累，并證實(shí)了外泌體 miR-17-5p 在人胚胎干細(xì)胞和卵母細(xì)胞中抑制活性氧水平的關(guān)鍵作用。同年，該課組研究發(fā)現(xiàn)hAMSCs-Exos的miR-320a可通過調(diào)控SIRT4蛋白表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，維持卵巢功能進(jìn)而改善POI[19]。兩項(xiàng)研究分別對huMSCs-Exos的 miR-17-5p、hAMSCs-Exos的miR-320a基因敲除，更為精準(zhǔn)地研究了miRNA對POI的作用及機(jī)制，證明了外泌體miRNA可有效緩解POI。

5 精準(zhǔn)研究外泌體miRNA

目前科學(xué)家對于miRNA分子功能的研究主要集中于患者病變組織和體外培養(yǎng)的細(xì)胞，而其在組織細(xì)胞發(fā)育和發(fā)病過程中的具體功能尚不明確[26]?；蚯贸Ｐ蜑榫珳?zhǔn)研究miRNA的功能提供了重要的技術(shù)手段[27]。鑒于真核細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，且miRNA在基因調(diào)控中起輔助作用，miRNA分子基因敲除基本上不表現(xiàn)出明顯的表型變化。在線蟲中，低于10%的miRNA分子敲除不會(huì)造成胚胎發(fā)育障礙或明顯的表型變化，且基因敲除對線蟲或小鼠造成的變化主要發(fā)生在壓力或損傷等應(yīng)激狀態(tài)下[28]?；蚯贸褳殛U明miR-126[29]、miR-132[30]、miR-17-5p[16]、miR-320a[19]等分子的生理功能發(fā)揮了不可替代的作用。欲精準(zhǔn)研究某一miRNA的生物學(xué)特性，可運(yùn)用相關(guān)技術(shù)系統(tǒng)制備生殖細(xì)胞miRNA基因敲除模型及卵巢組織特異的基因敲除模型，從而研究某一miRNA基因敲除小鼠整體、卵巢生長發(fā)育狀況及組織反應(yīng)，由此可精準(zhǔn)推測出某一特定miRNA在改善POI方面是否有效。

6 展 望

化療所致POI患者恢復(fù)情況與化療藥的累計(jì)劑量和卵巢損傷程度有關(guān)，在化療后進(jìn)行早期干預(yù)可使卵巢功能有一定程度的恢復(fù)。但是由于化療所致POI機(jī)制復(fù)雜多變，臨床上尚無有效的治療方法。研究證實(shí)，外泌體及其miRNA可顯著改善化療藥物所致POI的相關(guān)癥狀，其作用機(jī)制及安全性有待深入研究。探索外泌體及其miRNA與卵巢細(xì)胞的作用機(jī)制，有利于研發(fā)新的POI治療方法，改善POI患者的內(nèi)分泌及生育功能。