龜鹿二仙膠在骨質(zhì)疏松癥領(lǐng)域研究進展及其現(xiàn)代應(yīng)用迷思

司譽豪 馬勇 許奇 李紹爍 郭楊 潘婭嵐 王禮寧 劉孟敏 孫杰 涂鵬程 吳承杰楊光露 王建偉 尹恒*

1.浙江省中醫(yī)院骨傷科，浙江 杭州 310006 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所、骨傷修復(fù)與重建新技術(shù)實驗室，江蘇 南京 210023 3.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，江蘇 南京 210023 4.南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附院骨傷科，江蘇 無錫 214071

龜鹿二仙膠又名龜鹿二仙膏、龜鹿參芪膠、龜鹿膠等，出自于王三才所著《醫(yī)便》，由龜甲膠、鹿角膠、人參、枸杞子組成，有滋陰養(yǎng)血、填精助陽等功效[1]?！夺t(yī)便》載其：“專治男婦真元虛損，久不孕育……服此膠百日，即有孕……并治男子酒色過度，銷鑠真陰；婦人七情傷損血氣；諸虛百損，五勞七傷，并皆治之?！迸R床常用于陰陽兩虛、虛勞、遺精陽痿、腰膝酸軟、痿軟無力、視物昏花等。中醫(yī)對于骨質(zhì)疏松癥描述有“骨痿”、“骨枯”、“骨痹”等，其中以“骨痿”癥狀最為貼切，《素問·痿論篇》曰“腎者水藏也……則骨枯而髓虛……發(fā)為骨痿。”張介賓也直言“腎痿者，骨痿也”。可見，腎虛髓虧為骨質(zhì)疏松癥的根本中醫(yī)病機，這與龜鹿二仙膠適應(yīng)癥相合，因此臨床常用于論治骨質(zhì)疏松癥。目前尚無醫(yī)家對龜鹿二仙膠的現(xiàn)代臨床應(yīng)用與機制研究進行系統(tǒng)總結(jié)，故而筆者整理了相關(guān)文獻進行綜述，為深入研究龜鹿二仙膠治療骨質(zhì)疏松癥的臨床療效與機制提供相關(guān)參考。

1 臨床應(yīng)用

當(dāng)代醫(yī)家中，周修通[2-3]于2001年最早公開報道將龜鹿二仙湯運用于骨質(zhì)疏松癥的治療中，他自擬“龜鹿二仙湯”聯(lián)合葡萄酸鈣片/碳酸鈣片用于治療罹患骨質(zhì)疏松癥的老年女性，結(jié)果提示聯(lián)合使用“龜鹿二仙湯”可明顯增強西藥療效。而后楊偉岸[4]運用龜鹿二仙湯加味治療老年脊椎骨質(zhì)疏松性腰背部疼痛獲得了92.1 %有效率，黃民興等[5]也觀察到龜鹿二仙膠可明顯降低脊椎骨質(zhì)疏松性腰背痛老年患者VAS評分。陳治諶[6]的研究將龜鹿二仙膠丸劑與福善美進行對比，發(fā)現(xiàn)二者在骨代謝指標(biāo)及骨密度(bone mineral density，BMD)方面均具有良好的療效，區(qū)別在于，福善美1年內(nèi)即可顯著提高患者BMD，而龜鹿二仙膠丸劑的療效需3年方可較為明顯。尹恒等[7]亦是將龜鹿二仙膠與西藥單獨對比，發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠對于原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者BMD的提升效果顯著優(yōu)于阿爾法骨化醇。王科艇等[8]的研究稍有不同，他們將龜鹿二仙膠與福美加聯(lián)用鈣爾奇作對比，發(fā)現(xiàn)兩種療法干預(yù)6月后在BMD方面無顯著差異，而龜鹿二仙膠可額外加強患者日常體力、精力，在提升患者健康狀況上略優(yōu)于聯(lián)用福美加與鈣爾奇。

注射用鮭魚降鈣素可以顯著降低高轉(zhuǎn)換型骨丟失[9]，齊潤文[10]發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠聯(lián)合鮭魚降鈣素可明顯緩解骨質(zhì)疏松性腰背痛，且長短期療效均明顯強于單用鮭魚降鈣素。此外，也有將龜鹿二仙膠與抗阻運動聯(lián)合使用的報道，結(jié)果顯示抗阻運動與龜鹿二仙膠均可改善患者高轉(zhuǎn)換型骨代謝，提高腰椎、髖部BMD，而二者聯(lián)用后對患者破骨細胞相關(guān)指標(biāo)的抑制作用明顯優(yōu)于單用其一[11]。齊鵬坤等[12-13]針對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥進行了兩種試驗方案，既采用龜鹿二仙膠對比阿侖膦酸鈉，也比較了兩藥聯(lián)用與單獨阿侖膦酸鈉/龜鹿二仙膠的療效差異，結(jié)果顯示二者聯(lián)用比單用其一可顯著提高患者BMD，緩解疼痛。并且，龜鹿二仙膠抗骨質(zhì)疏松作用可能與調(diào)節(jié)患者體內(nèi)雌二醇、睪酮有關(guān)。張健[14]的研究方案與齊鵬坤等[13]幾乎相同，結(jié)果顯示，龜鹿二仙膠聯(lián)合阿侖膦酸鈉對于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的臨床療效優(yōu)于阿侖膦酸鈉，可明顯升高患者腰椎及股骨近端BMD，改善血清IGF-1及TNF-α水平。

2 基礎(chǔ)研究

2.1 在體實驗

對于龜鹿二仙膠治療骨質(zhì)疏松癥的具體機制研究目前仍僅見于國內(nèi)學(xué)者及文獻，目前涉及到的動物模型包括：去卵巢(OVX)大鼠骨質(zhì)疏松模型[15-21]、激素誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松模型[22-23]、激素誘導(dǎo)斑馬魚骨質(zhì)疏松模型[24-26]。其中，以卵巢切除12周后建立的OVX大鼠骨質(zhì)疏松模型最為常見，張瑤等[17,19-20]以O(shè)VX大鼠為對象進行了三種實驗方案，首先他們對比了龜鹿二仙膠與戊酸雌二醇片，結(jié)果顯示，與戊酸雌二醇片比較，龜鹿二仙膠治療組 Ca 含量、BMD顯著增高，而P、Ca/P、β-Crosslaps、PINP 含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。而后他們比較了包括龜鹿二仙膠在內(nèi)的多個補腎方對于OVX大鼠骨質(zhì)疏松模型生物力學(xué)以及骨代謝指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠、補腎健脾方、仙靈骨葆膠囊組的大鼠BMD顯著高于雌二醇組大鼠，而二仙湯組與仙靈骨葆膠囊組的β-Crosslaps顯著降低。在二仙湯、龜鹿二仙膠、補腎健脾湯三者比較中，補腎健脾湯組β-Crosslaps及PINP含量均顯著增高，龜鹿二仙膠組PINP含量顯著增高，Ca/P比值高于仙靈骨葆膠囊組、二仙湯組、補腎健脾湯。在腰椎壓縮試驗及股骨三點彎曲試驗中，龜鹿二仙膠組、二仙湯組、補腎健脾湯組的最大負荷量、最大應(yīng)力、彈性模量明顯高于雌二醇組與仙靈骨葆膠囊組，其中以龜鹿二仙膠組最為顯著，表明其具有提升OVX大鼠生物力學(xué)性能，改善鈣磷代謝，促進骨形成與抑制骨吸收的功效。上述三種方案[17,19-20]均使用了同一種干預(yù)劑量，而牛素生等[16,18]研究則將龜鹿二仙膠分為高、中、低劑量進行干預(yù)，通過測定OVX大鼠血清E2、血清ALP、TRACP、左側(cè)股骨BMD、最大載荷、骨小梁面積等指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，中劑量(按體表面積換算人臨床用量而來)龜鹿二仙膠對于調(diào)節(jié)OVX大鼠激素水平，增強骨密度與骨顯微結(jié)構(gòu)效果最佳。陳竑明等[21]的研究方案與張瑤等[17,19-20]類似，但著重檢測了骨骼肌Akt蛋白表達量，發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠對OVX大鼠有顯著的治療作用，能升高腰椎BMD及Akt蛋白和基因的表達量。王立新[15]將龜鹿二仙膠與倍力美對比，發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠提取物對大鼠脛骨上段松質(zhì)骨的靜態(tài)學(xué)參數(shù)及動態(tài)學(xué)參數(shù)都有較好的改善作用，在股骨中段的皮質(zhì)骨、遠段松質(zhì)骨、腰椎松質(zhì)骨的生物力學(xué)改善效果與倍美力相近。

郭建博[22]與徐衛(wèi)峰[23]均采用地塞米松誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松模型，前者檢測血清指標(biāo)與牛素生等[16]的研究相近，包括TRACP-5b、ALP、N-MID-OT、股骨BMD等，結(jié)果表明龜鹿二仙膠對于激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠也具有提高骨密度、促成骨、抑破骨的作用，且效果明顯優(yōu)于阿侖膦酸鈉。后者著重探討機制，將龜鹿二仙膠分為高、低劑量組，發(fā)現(xiàn)兩種劑量均能顯著增加大鼠股骨BMD，降低血清ALP、IL-6、IL-β、TNF-α水平，提高降鈣素與血清E2。Western blot顯示大鼠滑膜Nrf-2、HO-1蛋白表達顯著升高，而p-IκB、P-NF-κB蛋白表達明顯下降，表明龜鹿二仙膠發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用可能與調(diào)控Nrf-2/HO-1/NF-κB有關(guān)聯(lián)。

尹恒[25]與錢哲[26]的研究均采用了激素誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松模型。前者證實了龜鹿二仙膠能夠促進激素誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松模型合成I型膠原蛋白，且此機制是通過上調(diào)TGF-β/Smad信號通路的上游蛋白TGF-β1、TGF-β2及下游蛋白Smad3實現(xiàn)的。后者除再次驗證龜鹿二仙膠抗骨質(zhì)疏松作用與激活TGF-β/Smad信號通路有關(guān)外，還發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠可降低IL-6、IL-β、TNF-α等炎癥因子，調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1抑制炎癥反應(yīng)所致骨量丟失。

2.2 離體實驗

目前龜鹿二仙膠的離體實驗均為細胞水平研究，涉及成骨細胞(osteoblasts，OB)/成骨細胞系(Mc3t3-E1、ROS17/2.8)、破骨細胞(osteoclasts，OC)、骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)，人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞(human endometrial stromal cells，HESCs)。徐衛(wèi)峰[23]采用地塞米松誘導(dǎo)小鼠成骨細胞系Mc3t3-E1損傷，觀察龜鹿二仙膠含藥血清對成骨細胞系的保護作用，發(fā)現(xiàn)含藥血清組的細胞上 IL-6、IL-β、TNF-α水平顯著下降。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nrf-2、HO-1蛋白表達明顯升高，并且p-IκB、P-NF-κB蛋白表達明顯下降。表明龜鹿二仙膠可顯著改善地塞米松誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松，且機制與調(diào)控Nrf-2/HO-1/NF-κB有關(guān)，該結(jié)果與其在體實驗結(jié)果相吻合。而錢哲等[27]采用了大鼠成骨肉瘤細胞系ROS17/2.8，發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠可通過調(diào)控TGF-β而促進 I 型膠原的表達起抗骨質(zhì)疏松作用。該結(jié)果與尹恒[25]一致，后者發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠含藥血清可明顯提高ROS17/2.8細胞株TGF-β1、TGF-β2、Smad3、COL1A1、COL1A2蛋白及基因表達量。袁明陽[28]同樣采用了ROS17/2.8作為研究對象，其實驗方案、結(jié)果與尹恒[25]、錢哲等[27]的研究基本一致，在此不做過多贅述。錢康[29-30]的兩項研究均體外分離大鼠原代OB，分別探究了不同濃度龜鹿二仙膠含藥血清(20 %、15 %、10 %)對OB增殖、周期以及OPG/ODF系統(tǒng)的影響，結(jié)果顯示龜鹿二仙膠含藥血清對OB具有促進增殖和抗凋亡作用，且濃度越高，效果越顯著。同時當(dāng)含藥血清濃度在20 %時OPG基因表達量最高，而ODF基因表達量最低，亦是呈現(xiàn)出了濃度依賴性。該結(jié)果與朱崇梅[31]的結(jié)果如出一轍，后者亦是發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙湯含藥血清可呈劑量依賴性地促進OB增殖分化，并且上調(diào)OPG表達和抑制ODF表達。

毛翠平等[32]不但體外分離得到大鼠原代OB，還利用1,25(OH)2D3誘導(dǎo)骨髓單核細胞獲得原代OC，發(fā)現(xiàn)10 %龜鹿二仙膠含藥血清可增加 IGF-1分泌量，促進OB增殖，并且能夠顯著抑制由1,25(OH)2D3誘導(dǎo)的破骨分化，起抗骨質(zhì)疏松作用。楊樹華等[33-34]應(yīng)用龜鹿二仙膠醇提物干預(yù)RAW264.7誘導(dǎo)的破骨樣細胞，發(fā)現(xiàn)與生理鹽水組比較，龜鹿二仙膠醇提物含藥血清可降低破骨樣細胞 CtsK、TRAP基因表達，提高CTR基因表達，抑制骨吸收活性。牛素生等[35]觀察了龜鹿二仙膠含藥血清對BMMSCs成骨分化的作用，發(fā)現(xiàn)10 %龜鹿二仙膠含藥血清與成骨誘導(dǎo)液都可以促進BMMSCs向OB分化，且作用機制可能與增強Fzd-2表達、抑制Axin-2表達和激活Wnt/β-catenin通路有關(guān)。不僅如此，徐衛(wèi)峰等[36]還發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠含藥血清能夠保護BMMSCs細胞活性，免受地塞米松損傷，降低炎性反應(yīng)。尚冰等[37]的研究較為與眾不同，他們并未采用常用的含藥血清作為干預(yù)手段，而是觀察了不同濃度龜鹿二仙膏(10-4、10-6、10-8mol /L)對HESCs增殖和胰島素樣生長因子(IGF)-1表達的影響。結(jié)果顯示，高濃度龜鹿二仙膏能夠顯著促進HESCs增殖活性，提升 IGF-1基因、蛋白表達。一定程度上說明了龜鹿二仙膠具有調(diào)節(jié)卵巢相關(guān)激素水平的功效，通過延緩女性衰老從而改善圍絕經(jīng)期女性骨質(zhì)疏松。

3 現(xiàn)代應(yīng)用迷思

3.1 相關(guān)研究量明顯不足

筆者通過檢索PubMed、中國知網(wǎng)(CNKI)、萬方數(shù)據(jù)庫(Wanfang Database)搜集文獻，然而并未檢索到任何相關(guān)英文文獻。此外，作為著名填精益髓、延年益壽的名方，龜鹿二仙膠相關(guān)的中文文獻數(shù)量也明顯不及其他補腎經(jīng)方。以CNKI舊版為例，檢索日期為從建庫至2020年11月11日，以“篇關(guān)摘”檢索“龜鹿二仙”可得結(jié)果共計286條，同樣方法檢索“左歸丸”(1 346條)、右歸丸(1 322條)、六味地黃丸(5 325條)、地黃飲子(1 102條)、金匱腎氣丸(2 232條)。個中原因頗多，但筆者推測，如此大的差異最有可能與龜鹿二仙膠藥材價格相關(guān)。龜甲膠、鹿角膠、人參均為名貴藥材，根據(jù)阿里巴巴自營健康醫(yī)藥旗艦店報價，龜甲膠(四方箄)售價為720元/盒(200 g)，鹿角膠(北京同仁堂)售價為1 026元/盒(108 g)，而金匱腎氣丸(北京同仁堂)15元/盒(60 g)、六味地黃丸(仲景牌)35元/盒(360丸)，左歸丸(仲景牌)65元/盒(45 g)。原材料價格昂貴、需長期服用等因素?zé)o疑抬高了龜鹿二仙膠的研究門檻，將研究經(jīng)費不甚充裕的科研團隊拒之門外。

3.2 臨床應(yīng)用方法不一

當(dāng)前貫以“龜鹿二仙膠”名稱的研究一定程度上存在名不符實的現(xiàn)象，不少研究者所用處方的組成、劑量、劑型等與龜鹿二仙膠原方相差較大，難以體現(xiàn)龜鹿二仙膠對于骨質(zhì)疏松癥的治療作用。例如有早期研究的處方為龜板12 g、鹿角片12 g、仙靈脾12 g、威靈仙12 g、熟地12 g、肉蓯蓉12 g、巴戟天12 g、黃芪12 g、黨參12 g、當(dāng)歸12 g、紅花3 g[2-3]。該方以“龜鹿”為君，另加藥9味，且無人參與枸杞子，龜板與鹿角片皆未制成膠狀，顯然與龜鹿二仙膠原方相去甚遠。此方雖以“龜鹿二仙”為名，但并不足以代表龜鹿二仙膠。又如陳治堪[6]采用了以淀粉與蜂蜜制成的龜鹿二仙膠(丸劑)，且原藥材仍然是使用了未制膠的龜板與鹿角。無獨有偶，齊鵬坤等[12-13]所用處方為龜板10 g、鹿角10 g、人參10 g、枸杞15 g，名為龜鹿二仙湯。龜板性寒，味甘咸，可滋腎潛陽，退虛熱。而龜甲膠是由龜甲反復(fù)煎熬、濃縮制成的膠狀物，性平，具有滋陰潛陽、養(yǎng)血補血功效。同理，鹿角制成鹿角膠后藥性與功效也不可避免的發(fā)生改變，因此，所有未將“龜鹿”制成膠狀物的研究能否算作是龜鹿二仙膠的現(xiàn)代應(yīng)用研究仍有待商榷。

此外，當(dāng)代醫(yī)家所用龜鹿二仙膠各藥的配比也是不盡相同。據(jù)第五版高等醫(yī)藥院校教材《方劑學(xué)》記錄的《醫(yī)方考》原藥材配比為，鹿角(5 kg)∶龜板(2.5 kg)∶枸杞子(1.5 kg)∶人參(0.5 kg)=10∶5∶3∶1[38]，但并未言明龜板膠、鹿角膠與人參、枸杞子的具體比例。我們注意到當(dāng)前四藥臨床配比大致為鹿角膠10～18 g、龜板膠10～18 g、人參10～20 g、枸杞子15～30 g[4-5,8,10-11]，所有文獻均未注明如此使用的出處和根據(jù)。還有學(xué)者直接購買中成藥“龜鹿二仙膏”進行臨床試驗，其配置比例更是難以考證[6-7,14]?？傊m配比上仍有無法考據(jù)的內(nèi)容，但可以肯定，直接采用龜板、鹿角制成的貫以“龜鹿二仙”名稱的復(fù)方并不能較好的代表龜鹿二仙膠的臨床療效，未來研究的處方仍應(yīng)遵從經(jīng)典原方組成、藥物劑型及藥材配比。

3.3 細胞水平干預(yù)方式爭議

此次檢索到的所有體外實驗文獻絕大部分均采用了同種屬動物含藥血清的方式進行細胞實驗。唯有尚冰等[37]采用了直接體外中藥給藥的方式，龜鹿二仙膠雖僅有四味中藥，組方精簡，但兼具植物藥與動物藥，化學(xué)成分十分復(fù)雜?，F(xiàn)有相關(guān)研究數(shù)量稀少，尚無法確定龜鹿二仙膠是通過藥物成分直接起效，還是經(jīng)過肝臟代謝后產(chǎn)物發(fā)揮作用，亦或是憑借第二信使起到間接作用[39-40]。因此，也無法斷言尚冰等[37]的實驗方案就不如其余基于血清藥理學(xué)的研究。單從目前中醫(yī)藥領(lǐng)域研究方法而言，使用血清藥理學(xué)的研究認可度更高，更貼近復(fù)雜藥物在內(nèi)環(huán)境中的藥物起效過程。然而在龜鹿二仙膠含藥血清的使用上各學(xué)者間也存在些許不同。一部分學(xué)者以低、中、高三種劑量灌胃大鼠，隨即將所得的相應(yīng)含藥血清定義為低、中、高三種[23,25-28,32,36]。而其余學(xué)者均是由同一濃度中藥灌胃后提取含藥血清，在干預(yù)細胞時再調(diào)整相應(yīng)濃度(例如10 %、15 %、20 %等)[29-31,35]。兩種方法均有各自的理論支撐點，前者模擬不同濃度藥物在體內(nèi)代謝，更接近現(xiàn)實代謝情況，而后者摒除了不同濃度藥物在體內(nèi)代謝的異質(zhì)性，縮小了個體差異，具備更強的均一性和可重復(fù)性。由此可見，目前無論是從藥物直接發(fā)揮作用，還是借助含藥血清進行實驗都存在難以避免的爭議，將來研究除了繼續(xù)探索這兩種方式以外，還可關(guān)注第二信使在龜鹿二仙膠與細胞間通訊所起的作用，例如時下較熱門的外泌體、微小囊泡等。

4 小結(jié)與展望

目前龜鹿二仙膠相關(guān)研究仍顯匱乏，且現(xiàn)有研究存在臨床應(yīng)用方法迥異，細胞水平干預(yù)方式爭議等問題，總體上缺乏準度與深度。故而將來研究可從如下幾方面入手：①開展多中心、大樣本、高質(zhì)量的臨床試驗進一步驗證療效；②進行藥物質(zhì)控研究，規(guī)范和制定相對精準化的配方和劑量；③探索細胞水平給藥方式，如細胞外囊泡等第二信使在骨細胞間通訊的作用；④優(yōu)化藥物制備方式，降低成本和研究門檻。龜鹿二仙膠是陰陽雙補，延年益壽的名方，研究其抗骨質(zhì)疏松作用對拓寬和明確中醫(yī)復(fù)方應(yīng)用范圍大有裨益。此文旨在厘清現(xiàn)狀，拋出重點問題，以待今后同道勠力同心，為此方正名。