免疫檢查點抑制劑的免疫相關不良事件預測生物標志物研究進展

李穎，尹皓原，潘麗，馮磊

doi:10.3971/j.issn.1000-8578.2021.20.0997

0 引言

免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors,ICIs）是近年來癌癥治療的熱點之一，在轉移性黑色素瘤（metastatic melanoma,MM）、非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）等多種腫瘤中取得了很好的療效。然而隨著ICIs應用的推廣，ICIs的局限性和不良反應也引起了臨床的關注和重視。一方面，ICIs只對部分患者有效，其客觀緩解率仍有待提高；另一方面，ICIs在抑制腫瘤細胞的同時，也破壞著患者的免疫穩(wěn)態(tài)，引起一系列不良反應，即免疫相關不良事件（immunerelated adverse events,irAEs）。

irAEs的臨床表現(xiàn)復雜，影響患者的生活質量，嚴重的irAEs甚至需要停用ICIs，從而延誤了患者治療。因此，對使用ICIs治療的腫瘤患者，尋找預測irAEs的生物標志物顯得尤為重要。國內外關于irAEs預測生物標志物的研究越來越多，從各層面提出了對irAEs預測的可能性。本文基于irAEs的相關概念、機制、臨床表現(xiàn)，在血清學、微生物學、遺傳學等多個層面，歸納出具有代表性的能夠預測irAEs的生物標志物，并期望這些生物標志物在未來能夠應用于預測irAEs、指導ICIs用藥的臨床實踐。

1 ICIs的種類和機制

通過阻斷對T細胞的負性共刺激，ICIs可誘導抗腫瘤T細胞的活化，促使其殺傷腫瘤細胞，從而改善腫瘤患者病情。根據作用靶點不同，目前已在臨床應用的ICIs藥物主要分為抗程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1,PD-1）單抗、抗程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）單抗和抗細胞毒性相關抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA-4）單抗。PD-1與受體PD-L1的結合會抑制腫瘤微環(huán)境中T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。ICIs能夠抑制PD-1和PD-L1的結合，解除其對T細胞的抑制，使相關T細胞攻擊腫瘤細胞，從而達到腫瘤治療的目的。CTLA-4與抗原提呈細胞表面的B7分子配體結合后能誘導T細胞無反應性，抗CTLA-4單抗抑制了這種免疫負調節(jié)，使T細胞活化識別攻擊腫瘤細胞。目前，經FDA認證并進入使用的ICIs有作用于CTLA-4的ipilimumab、作用于PD-1的pembrolizumab、nivolumab，以及作用于PD-L1的atezolizumab、avelumab、durvalumab。

2 irAEs的機制和臨床表現(xiàn)

近年來，部分研究認為輕中度irAEs的存在能為腫瘤患者帶來更長的生存時間，是一種人體對ICIs產生應答的標志[1-2]。然而也有其他研究得出了與之矛盾的結論，irAEs的發(fā)生與療效改善的關系尚無定論。irAEs的確切病理生理機制尚不明確，但據信與免疫檢查點在維持免疫平衡中的作用有關。免疫檢查點的生理作用是負向調節(jié)免疫應答，防止免疫應答對自身組織的損傷。CTLA-4以多種方式抑制免疫應答，包括在免疫應答初始階段抑制T細胞激活。與此相反，人們通常認為PD-1在外周組織免疫應答的后期抑制T細胞。接受抗PD-1治療的患者與接受抗CTLA-4治療的患者的irAEs不盡相同，抗CTLA-4治療的不良事件通常更為嚴重。例如，結腸炎和垂體炎更常見于抗CTLA-4治療，而肺炎和甲狀腺炎更常見于抗PD-1治療。Postow等[3]在對irAEs機制的討論中認為，導致irAEs的可能機制包括：針對腫瘤和健康組織共同攜帶的抗原T細胞活性增強、預先存在的自身抗體水平升高、炎性細胞因子的水平升高以及在表達CTLA-4的正常組織中，抗體與CTLA-4直接結合導致補體介導的炎性反應增強。

irAEs大部分開始于ICIs治療后的3～6月，其臨床表現(xiàn)多種多樣，可以發(fā)生在人體的任何一個組織或器官。irAEs的發(fā)生率介于15%～90%之間，這可能與ICIs的種類、劑量、以及癌癥的類型有關[4]。根據癥狀的嚴重程度，第四版通用不良反應術語標準（the Common Terminology Criteria for Adverse Events,CTCAE）將irAEs分為4個等級。其中，輕度和中度分別為Grade1、Grade2，只需對患者采取相應的對癥治療，不影響ICIs的使用。但當Grade2的患者irAEs對癥治療無效且癥狀持續(xù)存在時，需停止ICIs的使用，直到irAEs情況得到改善。而對于Grade3和Grade4的患者，必須停止ICIs的治療并咨詢相關專科醫(yī)生。

irAEs可以按照器官分類，如結腸炎、垂體炎、肺炎、甲狀腺炎、肝炎、皮疹等[5]。也有學者將irAEs按系統(tǒng)分類，如常見的內分泌irAEs包括1型糖尿病、垂體功能異常，甲狀腺功能異常。風濕樣irAEs主要表現(xiàn)為炎性關節(jié)炎、風濕性多肌痛、肌炎或肌病等[6]。血液系統(tǒng)的不良反應包括血小板減少、溶血性貧血、中性粒細胞減少、再生障礙性貧血等[7]。細胞因子釋放綜合征和嚴重神經毒性兩種irAEs雖然罕見，但其致命性高，往往被單獨討論。這些irAEs與單純的傳統(tǒng)疾病相似但不相同，需要臨床醫(yī)生及時而準確地鑒別診斷。

3 預測irAEs的生物標志物

3.1 趨化因子和細胞因子

3.1.1 CXC趨化因子 對irAEs患者趨化因子變化的研究發(fā)現(xiàn)，CXC亞族的趨化因子中CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL19在治療前基線水平較沒有發(fā)生irAEs的患者低，而治療后，只有CXCL9和CXCL10出現(xiàn)明顯升高[8]。另一項研究中，irAEs患者在ICIs治療后只出現(xiàn)趨化因子CCL5的升高[9]。CXCL9、CXCL10在腫瘤微環(huán)境中有調節(jié)T細胞的分化、引導免疫細胞向腫瘤組織遷移等功能。CCL5則被認為與移植物抗宿主病有關。這些趨化因子對免疫系統(tǒng)有著不同的調節(jié)作用，監(jiān)測其變化對irAEs有一定預測作用。

3.1.2 IL-6 作為一種多功能的細胞因子，IL-6在炎性反應、免疫調節(jié)和腫瘤形成中都有重要作用。其與irAEs的相關報道和研究也較多。Valpione等通過Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)經ipilimumab治療的轉移性黑色素瘤患者血清中IL-6基線值與irAEs相關[10]：IL-6基線值低的患者發(fā)生irAEs的風險高于IL-6基線值高的。另一項研究中，經nivolumab治療出現(xiàn)銀屑病樣irAEs的黑色素瘤患者呈現(xiàn)出IL-6治療后升高，同時沒有銀屑病樣表現(xiàn)的患者呈現(xiàn)出IL-6降低[11]。這可能是由于升高的IL-6促進了Th17的分化，從而加劇了皮膚的炎性反應，使表皮異常增長，呈現(xiàn)銀屑樣病變。在腫瘤微環(huán)境中，結腸癌細胞能夠分泌miR-21和miR-29b兩種循環(huán)microRNAs，刺激免疫細胞分泌IL-6，而免疫細胞分泌的IL-6能反過來增強結腸癌細胞的侵襲性，同時使炎性反應轉向免疫抑制。IL-6是聯(lián)系腫瘤與免疫的關鍵因素之一[12]。目前，已有研究在探索IL-6阻滯劑維持ICIs藥物活性及預防結腸炎irAEs的可能性[13]。

3.1.3 IL-17 IL-17由TH17細胞分泌，在炎性反應中有多種作用。而TH17細胞和調節(jié)性T細胞之間的平衡紊亂在打破母胎免疫耐受中發(fā)揮著關鍵作用，如IL-17的明顯升高與炎性腸病有關。Tarhini等對經ipilimumab治療的黑色素瘤患者的irAEs進行研究，發(fā)現(xiàn)IL-17的基線值與Grade3結腸炎irAEs有關[14]：Grade3結腸炎患者的IL-17基線值顯著高于Grade0～2結腸炎患者。Kim等發(fā)現(xiàn)，irAEs患者的滑膜液中，IL-17和分泌IL-17的CD4+T細胞都明顯升高[15]?；ひ褐械腎L-17能夠招募中性粒細胞，后者通過釋放大量酶類，導致關節(jié)損傷。

3.1.4 可溶性CD163 可溶性CD163衍生于巨噬細胞，在多種自身免疫性疾病中都有明顯升高，如類風濕關節(jié)炎、尋常性天皰瘡等。CD163陽性的巨噬細胞能分泌趨化因子CXCL5。Fujimura等[16]檢測了nivolumab治療前及治療42天后可溶性CD163和CXCL5的濃度，與沒有irAEs的患者相比，有irAEs的患者CD163和CXCL5都出現(xiàn)明顯升高。

3.1.5 其他細胞因子 關于細胞因子與irAEs的報道很多，除以上列舉的幾種外，還有大量其他細胞因子的研究，包括IL-8、IL-10、IL-1RA、IL-2RA、可溶性CD25等等[17-18]。對黑色素瘤患者irAEs的一項研究中，甚至一共觀察到11種基線濃度升高的細胞因子[19]。遺憾的是，這些豐富的實驗結果尚缺乏進一步的驗證，部分細胞因子的相關研究結果甚至互相矛盾。這可能與血清中細胞因子的不穩(wěn)定性有關：患者血清的采集時間、基礎代謝率、激素類藥物的使用，甚至短暫劇烈運動等都會對細胞因子的濃度產生影響。這些因素導致對ICIs治療患者細胞因子的檢測很難標準化，檢測出的結果不能統(tǒng)一整合。在未來的研究中，細胞因子的檢測需要建立一個統(tǒng)一的標準，對結果的分析也應結合患者的自身情況進行討論。

3.2 自身抗體

部分患者體內自身抗體陽性，但沒有呈現(xiàn)抗體相關自身免疫疾病的癥狀，這種潛在自身免疫狀態(tài)會提高發(fā)生irAEs的風險。治療前患者體內的甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody,TgAb）和甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody,TPOAb）與甲狀腺功能異常的irAEs相關。Osorio等[20]研究中，經pembrolizumab治療的NSCLC患者，共有10例甲狀腺功能異常irAEs，其中8例表現(xiàn)為甲狀腺自身抗體陽性，4例為治療前抗體陽性。Kimbara等[21]回顧性分析了168例經nivolumab治療的癌癥患者，其中出現(xiàn)甲狀腺功能異常irAEs的患者共23例，14例在治療前TgAb和（或）TPOAb陽性。檢測患者體內的TPOAb和TgAb對其發(fā)生甲狀腺功能異常irAEs有一定的預測作用。Stamatoulie等[22]研究中檢測了糖尿病患者相關自身抗體GAD-65、IAA、IA-2，發(fā)現(xiàn)在治療開始前體內就有1型糖尿病相關抗體的患者，出現(xiàn)糖尿病相關irAEs的概率高于體內沒有抗體的患者?？购丝贵w，作為自身免疫疾病的標志物，在irAEs患者中也有相關報道。Sakakida等[23]發(fā)現(xiàn)治療前抗核抗體陽性與出現(xiàn)結腸炎irAEs顯著相關。據統(tǒng)計，約11%的irAEs患者呈抗核抗體陽性，其中27%在治療后檢測到抗核抗體譜的種類增多[24]。大皰性類天皰瘡（bullous pemphigoid,BP）屬于皮膚類irAEs中的一種。在一次研究中，研究者通過分析肺癌組織的RNA測序結果，找到了同時在肺鱗癌和健康皮膚中表達的3種抗原：BP180、BP230和Ⅶ型膠原蛋白。他們進一步分析患者治療前后血清中相關抗體的滴度，發(fā)現(xiàn)BP180IgG抗體與皮膚類irAEs的發(fā)生有關[25]。檢測BP180IgG自身抗體的存在對預測皮膚類irAEs有一定指導作用。

與細胞因子相比，自身抗體的滴度相對穩(wěn)定，其檢測也相對方便。對于自身抗體與irAEs關系的研究，不僅有助于預測irAEs，對irAEs機制的揭示也有重大意義。此外，自身抗體滴度在治療過程中并非一成不變，動態(tài)監(jiān)測自身抗體滴度及相關激素的濃度，在出現(xiàn)異常時及時采取治療也能夠有效預防嚴重的irAEs。

3.3 免疫細胞

3.3.1 嗜酸性粒細胞（eosnophils,EOS）Delyon等[26]于2012 年的一次前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，ipilimumab治療的黑色素瘤患者EOS的升高伴隨著患者的生存周期延長。然而后來的一些研究中，EOS作為預后指標在不同的腫瘤治療過程中表現(xiàn)截然相反，如在胃腸道腫瘤治療中提示預后較好，但在霍奇金淋巴瘤則提示預后較差[27]。2017年，一項包括909例癌癥患者嗜酸性粒細胞的研究中，作者認為EOS的增多本身應該屬于irAEs，其升高是由于ICIs的不良反應[28]。2019年Kizawa等[29]通過Meta分析分析了73例經ICIs治療出現(xiàn)irAEs的腫瘤患者，其中57例治療后出現(xiàn)EOS增多。EOS的增多表現(xiàn)出與irAEs的顯著相關性，尤其是內分泌性irAEs。他們認為EOS的數(shù)量變化可以作為irAEs的預測指標。同年的另一項關于血細胞計數(shù)與抗PD-1治療黑色素瘤患者irAEs關系的報告中，EOS的基線值及治療1月后的升高值可以作為預測內分泌性irAEs的生物標志物[30]。

3.3.2 中性粒細胞與淋巴細胞比例 外周血細胞計數(shù)預測irAEs的研究中，中性粒細胞與淋巴細胞數(shù)量比（neutrophil/lymphocyte ratio,NLR）也是候選指標之一。Diehl等[31]發(fā)現(xiàn)治療前淋巴細胞基線值大于2 000，且治療后1月仍然大于2 000與發(fā)生Grade 2以上irAEs有關，而在治療前伴有淋巴細胞減少的患者治療后出現(xiàn)irAEs的概率相對較小。Yasuhiro等[32]試圖觀察黑色素瘤患者irAEs的發(fā)生與血細胞計數(shù)波動的關系，他們認為WBC總數(shù)值增加，同時淋巴細胞相對計數(shù)降低與Grade3/4的irAEs發(fā)生相關，但這種相關性出現(xiàn)在irAEs發(fā)生后，對于irAEs的預測價值不大。Pavan等[33]將NSCLC患者開始接受ICIs治療前一周內的NLR設為基線值，發(fā)現(xiàn)低NLR基線值與irAEs的發(fā)生相關。Li等[34]的研究也提出NLR低基線值與irAEs的相關性。

3.3.3 T細胞庫多樣化 CTLA-4抑制劑阻斷了CTLA-4的免疫負調節(jié)作用，刺激T細胞增殖。T細胞的改變理論上能夠幫助預測irAEs。Chaput等發(fā)現(xiàn)低水平的調節(jié)性T細胞與結腸炎的發(fā)生有關[35]。此外，T細胞庫的克隆多樣化也對irAEs發(fā)生有預測作用。經ipilimumab治療出現(xiàn)irAEs的患者其T細胞克隆在開始治療后的兩周內增加，其中CD4+T細胞和CD8+T細胞克隆數(shù)明顯增多，而調節(jié)性T細胞幾乎沒有變化[36]。Subudhi等對比患者T細胞TCR的β鏈測序結果發(fā)現(xiàn)：在irAEs發(fā)生之前，CD8+T細胞克隆數(shù)會增加，當CD8+T細胞克隆數(shù)超過55意味著可能發(fā)生嚴重的irAEs[37]。對T細胞庫的監(jiān)測也能預測irAEs的發(fā)生。

3.4 遺傳標志物

自身免疫疾病的發(fā)生與遺傳因素密切相關，同樣，遺傳因素與irAEs的發(fā)生也有關系。研究顯示，HLA-DRB1*11:01單體型與皮膚瘙癢irAEs有關。HLA-DQB1*03:01與結腸炎irAEs有關[38]。HLA-B*52:01和HLA-C*12:02與ICIs導致的關節(jié)炎有關[39]。HLA-B*4002與nivolumab治療霍奇金淋巴瘤出現(xiàn)的1型糖尿病有關[40]。HLA-DRB1*09:01-DQB1*03:03則與nivolumab治療腎癌出現(xiàn)的甲狀腺炎有關[41]。

除HLA分子外，CTLA-4和PD-1的相關基因突變也與irAEs有關。經ipilimumab治療的MM患者，其CTLA-4基因發(fā)生1661 A＞G突變時，出現(xiàn)內分泌性irAEs的概率升高[42]。這可能是由于突變后產生的1661 G/G基因型能從翻譯水平改變CTLA-4異構體的長度和可溶性，增強了其對T細胞的活化能力。Bins等收集了161個nivolumab治療的NSCLC患者，檢測其PD-1信號通路中相關基因的SNP位點，包括PD-1及其下游蛋白的編碼基因PDCD1、PTPN11、ZAP70及IFNG等。他們發(fā)現(xiàn)PDCD1 804C＞T突變與降低nivolumab毒副作用有關，而IFNG 1616 T＞C突變增加了nivolumab的風濕毒性[43]。這些研究結果表明免疫相關基因SNP位點的突變及特定的HLA單體型對于預測irAEs有重要作用，對患者進行HLA分型及相關基因測序對預防irAEs有重要意義。

3.5 腸道微菌群

鑒于腸道微菌群在自身免疫性疾病中的作用，對irAEs的研究也不能忽略腸道微菌群。腸道菌群主要為柔嫩梭菌屬（Faecalibaterium）和其他一些厚壁菌屬（Firmicutes）的黑色素瘤患者，在ipilimumab治療后更容易出現(xiàn)結腸炎性irAEs，相反，腸道含有擬桿菌屬（Bacteroidetes）的患者則完全沒有出現(xiàn)結腸炎性irAEs[35]。Dubin等進一步證實，擬桿菌屬的存在確實對ipilimumab導致的結腸炎有預防作用[44]。這可能是由于擬桿菌屬分泌的多糖A能刺激抗結腸炎調節(jié)T細胞的增長和相關細胞因子的分泌[45]。此外，羅伊氏乳桿菌，屬于益生菌的一種，通過減少腸黏膜中天然淋巴細胞3（ILC3）的數(shù)量，在對ICIs治療過程中出現(xiàn)的結腸炎也有一定的預防作用[46]。

4 與irAEs相關的其他指標

4.1 性別

研究顯示，女性患者出現(xiàn)irAEs的概率顯著高于男性患者[47]。值得注意的是女性自身免疫疾病的患病率同樣也高于男性。這可能是由于男女性激素水平的差異，對人體免疫系統(tǒng)產生不同的調節(jié)作用。這種差異性導致免疫疾病的發(fā)病在性別上多傾向于女性。

4.2 腫瘤類型

irAEs的不同臨床表現(xiàn)不僅僅是因為使用不同的ICIs藥物，與患者的腫瘤類型也有關系。最近一項Meta分析發(fā)現(xiàn)：與NSCLC患者相比，MM的患者出現(xiàn)皮膚和胃腸類irAEs的幾率高；與腎癌患者相比，MM患者多出現(xiàn)皮炎、關節(jié)炎和肌痛，而肺炎和呼吸困難較少見[48]。雖然具體機制尚不清楚，但MM患者的irAEs傾向性可能是因為特定的腫瘤細胞與正常組織存在某些交叉抗原。這類研究結果雖然不能預測irAEs，但在irAEs的鑒別診斷中有很大的幫助。

5 展望

irAEs的出現(xiàn)對癌癥患者而言有利有弊。雖然越來越多的證據表明irAEs與ICIs的有效性相關，但嚴重的irAEs會對患者造成不可逆轉的傷害，甚至威脅患者的生命。這就要求臨床工作者嚴格把控，對ICIs治療患者定期監(jiān)測、主動預防，爭取及時診斷irAEs。目前臨床上一般通過實驗室檢查如生化常規(guī)、肌酐清除率、甲狀腺功能檢測、皮質醇、胰島素生長因子等來監(jiān)測特定類型的irAEs。但當這些指標出現(xiàn)異常時，往往意味著器官組織已經遭到破壞。尋找更早期可以預測irAEs的標志物并加以提前干預對患者更有價值。

令人欣慰的是，從irAEs出現(xiàn)至今，短短幾年內國內外學者已在微生物學、遺傳學、血清學等多個領域找到許多可能成為irAEs預測標志物的候選指標。這些標志物大部分都易獲取，檢測周期也不長，適用于大規(guī)模的篩查。多種檢測方法的聯(lián)合應用可能是未來irAEs預測的趨勢。對irAEs的預測不僅能指導用藥，也能進一步保障患者的安全。將irAEs控制在溫和且可治愈的狀態(tài)，既能有效規(guī)避嚴重的不良反應，提高患者生存質量，也能提高ICIs的治療效果，為腫瘤患者帶來更長久的受益。多方位、全面的生物標志物對irAEs的早期識別和治療干預意義重大。

然而，這些新的生物標志物的研究也面臨許多困難，如實驗結果眾多且存在不一致性、其準確性無法在臨床實踐中得到證實等，一定程度上限制著這些生物標志物的研究進展。我們期望在未來的研究中能夠篩選出精確可靠而又經濟便捷的理想生物標志物，并通過大規(guī)模多中心的臨床試驗來驗證其臨床實際應用價值。