基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討腦出血方治療腦出血的作用機(jī)制

楊子奇，趙德喜

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腦病科，長春 130021）

腦出血（ICH）占全部腦卒中的10%～15%[1-2]，具有發(fā)病急，病情重，病死率和致殘率較高的特點(diǎn)，預(yù)后不良?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)腦出血的治療一直沒有明確的藥物支持，2015年AHA/ASA發(fā)布的《自發(fā)性腦出血診療指南》中，對(duì)腦出血內(nèi)科治療未推薦針對(duì)性藥物，亦不推薦外科治療[3]。中醫(yī)治療ICH 具有豐富的臨證經(jīng)驗(yàn)，可以提高患者的存活率，降低致殘率、病死率，值得深入挖掘。

腦出血屬于中醫(yī)中風(fēng)病的范疇，其病位在肝，病機(jī)屬“肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)”，多因痰火、飲食、情志因素致病。近代以來，醫(yī)家對(duì)腦髓的認(rèn)知逐漸清晰，對(duì)于中風(fēng)的病位傾向于腦，其病機(jī)為內(nèi)外因素刺激下導(dǎo)致的腦竅病變，如唐容川提出以下法治療腦部及目系疾病，以“離經(jīng)之血即為瘀血”及“瘀血不去新血不生”[4]；張錫純提出“腦充血”的概念，以大量活血藥治療腦出血，其論述已接近于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)腦出血的病位診斷。國醫(yī)大師任繼學(xué)教授總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)過廣泛深入的研究和觀察，原創(chuàng)性地提出了“破血化瘀，泄熱醒神，豁痰開竅”的治療大法，并創(chuàng)立了腦出血方。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，腦出血方可能通過抑制MMP-2/MMP-9 蛋白表達(dá)，能效降低ICH 后腦水含量，拮抗腦水腫的發(fā)生[5]；研究[6]表明，腦出血方可能通過上調(diào)腦出血血腫周圍損傷組織中BDNF 及受體TrkB 蛋白表達(dá)，顯著改善腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損。此外，臨床證實(shí)該方可以促進(jìn)腦出血急性期血腫吸收，明顯改善患者神經(jīng)功能缺損，提高生活質(zhì)量[7]。然而，目前腦出血方治療ICH 的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路仍未完全明晰，有待進(jìn)一步的研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以生物系統(tǒng)與藥理學(xué)為知識(shí)框架，能結(jié)合多個(gè)靶點(diǎn)、生物過程、信號(hào)通路等系統(tǒng)分析藥物間協(xié)同作用[8]，為運(yùn)用中醫(yī)整體觀念指導(dǎo)下的中藥配對(duì)應(yīng)用研究提供參考。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘腦出血方對(duì)ICH 干預(yù)與影響的相關(guān)成分與靶點(diǎn)，從整體探討藥物對(duì)ICH 的調(diào)控作用，探索中醫(yī)藥治療ICH 的新靶點(diǎn)與信號(hào)通路，為后續(xù)研究提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)成分的收集與篩選 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)（TCMSP）、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID 和Batman-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數(shù)據(jù)庫收集腦出血方各單味藥（水蛭、虻蟲、生大黃、蒲黃、三七、石菖蒲、瓜蔞、龜板）主要化學(xué)成分，并使用PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）對(duì)其化合物名稱和分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行核對(duì)。以口服利用度（oral bioavailability,OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 為篩選條件，對(duì)化合物進(jìn)行篩選。

1.2 腦出血方靶點(diǎn)、腦出血靶點(diǎn)和腦出血方治療靶點(diǎn)研究 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)（TCMSP）中醫(yī)藥綜合數(shù)（TCMI）及Batman-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數(shù)據(jù)庫，檢索水蛭、虻蟲、大黃、蒲黃、三七、石菖蒲、瓜蔞和龜板的主要化學(xué)成分可能作用靶點(diǎn)并整合。以“cerebral hemorrhage”為關(guān)鍵詞在OMIM 數(shù)據(jù)庫和Genecards 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，獲取全部的腦出血靶點(diǎn)。使用“Venny”將腦出血方靶點(diǎn)與腦出血作用靶點(diǎn)取交集得到重腦出血方治療靶點(diǎn)，用于后續(xù)研究。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將“1.2”中獲取的腦出血方治療靶點(diǎn)上傳至String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）對(duì)腦出血方治療靶點(diǎn)蛋白間的相互關(guān)系進(jìn)行分析。物種選擇為“Homo sapiens”，并設(shè)置條件“minimum required interaction score=0.9”和“hide disconnected nodes in the network”，隨后導(dǎo)入輸出文件和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。此外，利用Cytoscape 3.6.2 軟件構(gòu)建藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并利用Network Analyzer 進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)中介中心度和節(jié)點(diǎn)度來度量節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性。通過藥物與化合物及化合物與靶點(diǎn)連接情況，篩選出腦出血方治療靶點(diǎn)作用于腦出血的關(guān)鍵化合物和靶點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合現(xiàn)有報(bào)道文獻(xiàn)進(jìn)行分析。

1.4 基因本體（gene ontology，GO）功能與KEGG 通路富集分析 為進(jìn)一步闡述腦出血方在生物學(xué)角度不同的科學(xué)內(nèi)涵，本研究擬采用DAVID v6.8 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)腦出血方治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。隨后分析結(jié)果，進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 腦出血方候選化合物的篩選 運(yùn)用TCMSP、TCMID 和Batman-TCM 數(shù)據(jù)庫檢索水蛭、虻蟲、大黃、蒲黃、三七、石菖蒲、瓜蔞和龜板，得到化合物成分，設(shè)置篩選條件為OB ≥30%，DL ≥0.18，并去掉不同數(shù)據(jù)中的相同部分，僅保留唯一。經(jīng)整合后共得到48個(gè)活性化合物（不包括重復(fù)的化合物），其中水蛭13個(gè)、虻蟲2個(gè)、大黃7個(gè)、蒲黃5個(gè)、三七7個(gè)、石菖蒲3個(gè)、瓜蔞9 個(gè)和龜板6 個(gè)。

2.2 腦出血方靶點(diǎn)、腦出血靶點(diǎn)和腦出血方治療靶點(diǎn)收集 對(duì)篩選出的48 個(gè)化合物，通過TCMSP、TCMID 和Batman-TCM 分析平臺(tái)，檢索水蛭、虻蟲、大黃、蒲黃、三七、石菖蒲、瓜蔞和龜板的主要化學(xué)成分可能作用靶點(diǎn)并整合，共得到705 個(gè)靶點(diǎn)。通過對(duì)OMIM 和Genecards 數(shù)據(jù)庫，使用“cerebral hemorrhage”作為關(guān)鍵詞，整合得到腦出血基因靶點(diǎn)3 605 個(gè)。將腦出血相關(guān)靶點(diǎn)和腦出血方活性成分靶點(diǎn)分別導(dǎo)入在線工具Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）進(jìn)行分析，得到341 個(gè)靶點(diǎn)，此即為腦出血方與腦出血的共同靶點(diǎn)。

2.3 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將腦出血方治療靶點(diǎn)基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，設(shè)置篩選條件為智人，設(shè)置條件“minimum required interaction score=0.9”和“hide disconnected nodes in the network”，保存得到的相應(yīng)結(jié)果文件，得出292 個(gè)PPI 網(wǎng)絡(luò)的基因，篩選排名前10 位的靶點(diǎn)分別是：MAPK1、AKT1、JUN、TNF、RELA、CXCL8、IL6、MAPK8、BDKRB2、PRKCA，提示這些靶點(diǎn)在腦出血方對(duì)腦出血的治療中可能具有重要作用。

2.4 腦出血方藥物-化合物-治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Cytoscape 來獲得腦出血方單味藥-化合物-治療靶點(diǎn)交集，根據(jù)中介中心度和節(jié)點(diǎn)度來度量節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性。藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)總共包括397個(gè)節(jié)點(diǎn)（48 個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)、341 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，其中8個(gè)單味藥節(jié)點(diǎn)），依照交集結(jié)果，各單位藥度值排名為（從大到?。浩腰S（51）、生大黃（27）、水蛭（13）、瓜蔞（9）、三七（7）、龜板（6）、石菖蒲（3）、虻蟲（2）。排名前3 位的化合物為槲皮素（quercetin）、熊果酸（ursolic acid）、苯丙氨酸（phenylalanine）；度值排名前5 位的靶點(diǎn)為PTGS1、PGR、PTGS2、PPARG、AR。預(yù)測這些關(guān)鍵化合物和靶點(diǎn)在腦出血方對(duì)腦出血的治療調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著至關(guān)重要的作用。

2.5 GO 富集與KEGG 通路富集分析 將341 個(gè)腦出血方治療靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8 在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 富集分析，選擇人類作為研究物種，篩選條件設(shè)置為細(xì)胞的組成（cellular component），分子的功能（molecular function），生物的過程（biological process），可獲取分析結(jié)果。可分析出生物過程主要涉及藥物反應(yīng)、乙醇反應(yīng)、RNA 聚合酶II 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、脂多糖反應(yīng)、缺氧反應(yīng)等。細(xì)胞組成主要涉及細(xì)胞外間隙、線粒體、膜筏、胞漿、質(zhì)膜等方面。分子功能主要涉及酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性、藥物結(jié)合等。KEGG 富集結(jié)果顯示主要涉及HIF-1 信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路。由此可知腦出血方可能作用于這些通路來達(dá)到治療作用。

3 討論

腦出血方以《傷寒論》記載的抵擋湯為基礎(chǔ)方，以水蛭、大黃為君藥，水蛭味苦，咸，平，有小毒，歸肝經(jīng)，有破血逐瘀，通經(jīng)活絡(luò)之用，腦出血時(shí)形成血腫，水蛭以蟲類之軀而入血分，通達(dá)腦竅；大黃味苦寒，歸肝、脾、胃、大腸、心包經(jīng)，泄下攻積，泄火解毒，主通行六腑，二藥為君，使在上之瘀血下成下行之勢，緩腦府之急。蒲黃、虻蟲、瓜蔞為臣藥，蒲黃味甘平，歸肝、心包經(jīng)，有化瘀、止血、通淋之功效，蒲黃生于水中，引熱以下行，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究[9]證實(shí)，其有較強(qiáng)的凝血作用。虻蟲味苦，微咸，歸肝經(jīng)，破血通經(jīng)、逐瘀消癥，與水蛭相比，其作用迅猛，常與水蛭同用，故為臣藥。瓜蔞味甘，苦，歸肺、胃、大腸經(jīng)，有清熱滌痰，寬胸散結(jié)之功效，很多腦出血的患者都有高血壓、高脂血癥等病史，或平素嗜好肥甘厚味及嗜酒，均為腦出血發(fā)生的危險(xiǎn)因素，其人多煩亂而熱，符合中醫(yī)論述的“痰火”為病，瓜蔞清熱化痰，補(bǔ)活血藥之不逮。三七、龜板、菖蒲為佐使藥，三七味甘，苦，歸肝、胃經(jīng)，散瘀止血，可以通神。菖蒲味辛、苦，溫，歸心、胃經(jīng)，又名九空子，二藥可以開竅醒神。龜板味甘、咸，歸心、肝、腎經(jīng)，滋陰潛陽，益腎強(qiáng)骨，養(yǎng)血補(bǔ)心，因腦出血時(shí)，人體氣血奔沖，有升無降，龜板鎮(zhèn)靜、潛斂，又為血肉有情之品，可以補(bǔ)精氣以充腦髓。

本研究中，Degree 排名前3 位的單位藥為蒲黃、生大黃、水蛭，該結(jié)果與現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)君臣佐使的配伍原則大致相符，而蒲黃擁有最高的Degree，可能跟研究過程中使用不同的數(shù)據(jù)庫有關(guān)。以上結(jié)果表明，在藥物的配伍過程中應(yīng)該更加注重生大黃和水蛭的地位，同時(shí)蒲黃也予以考慮。

本研究結(jié)果顯示，腦出血方單味藥-化合物-治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，PTGS1、PGR、PTGS2、PPARG、AR均為重要靶點(diǎn)。目前，環(huán)氧化酶抑制劑是針對(duì)腦出血后炎癥反應(yīng)的治療措施之一，Park HK等[10]研究發(fā)現(xiàn)，腦出血患者于48 h 內(nèi)服用抗炎藥物塞來昔布具有減輕腦水腫的作用。基于此推測，腦出血方可能通過靶向抑制PTGS1 和PTGS2 發(fā)揮治療腦出血作用，減輕腦水腫。PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果表明，MAPK1、AKT1、JUN、TNF、RELA、CXCL8、IL6、MAPK8、BDKRB2、PRKCA 等靶點(diǎn)蛋白Degree 值大于平均值8.6，表明其可能是腦出血方治療腦出血的重要靶點(diǎn)群。分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）又稱細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2（ERK2），是ERK 信號(hào)通路中的重要調(diào)節(jié)因子，也是MAPK 信號(hào)通路的重要成員，具有調(diào)控細(xì)胞的生長與分化和調(diào)節(jié)炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)作用[11]。腦出血模型大鼠血腫周圍磷酸化ERK1/2 蛋白表達(dá)顯著增加[12]。此外，郭孝龍[13]研究發(fā)現(xiàn)，ERK 可介導(dǎo)AQP4 的不同表達(dá)，對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠腦水腫產(chǎn)生影響。以上結(jié)果表明腦出血方可能靶向ERK2 并降低其表達(dá)，達(dá)到減輕腦出血患者腦水腫的目的。綜上所述，腦出血方可以靶向多個(gè)靶點(diǎn)群，通過多途徑、多機(jī)制發(fā)揮治療腦出血藥理作用。然而，腦出血方單味藥-化合物-治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)并不一致，其不一樣的結(jié)果可能是由于不同數(shù)據(jù)庫的局限性所造成的，有待進(jìn)一步研究。

GO 富集結(jié)果表明，腦出血方治療靶點(diǎn)主要涉及藥物反應(yīng)、乙醇反應(yīng)、細(xì)胞外間隙、線粒體、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等，表明其治病靶點(diǎn)分布于不同分子組成，結(jié)構(gòu)功能各異。KEGG 通路結(jié)果表明，341 個(gè)腦出血方治療靶點(diǎn)主要參于HIF-1信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等。

HIF-1 是一種異源二聚體，主要由HIF-1α 和HIF-1β 兩個(gè)亞單位組成。其中HIF-1β 為結(jié)構(gòu)亞單位，HIF-1α 是活性亞基，發(fā)揮主要功能。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，腦出血模型大鼠血清HIF-1α 較對(duì)照組表達(dá)上升[14]。此外，臨床研究[15]證實(shí)，HIF-1α 在急性腦出血患者中表達(dá)升高，且其升高水平可反應(yīng)腦出血病情進(jìn)展及預(yù)后[16]。上述結(jié)果表明，腦出血方可能通過干預(yù)HIF-1 活性亞基發(fā)揮治療作用。

cAMP 是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，廣泛分布于各種體液和生物細(xì)胞中，其主要通過激活下游的PKA 而發(fā)揮相應(yīng)的生物效應(yīng)[17]。研究[18-19]表明，腦出血模型大鼠或腦出血患者cAMP 水平升高，其可能于血腦屏障破壞有關(guān)。腦出血方可能通過抑制cAMP表達(dá)水平，修復(fù)血腦屏障，發(fā)揮治療作用。

MAPK 通路一種典型的三級(jí)激酶模式，其可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞病理生理過程。MAPK 主要包括3 個(gè)亞族：ERK、JUN 和p38MAPK，其分別對(duì)應(yīng)ERK 信號(hào)通路、JUN 信號(hào)通路和p38MAPK 信號(hào)通路?，F(xiàn)代研究表明，ICH 大鼠模型MAPK 相關(guān)蛋白（ERK、JUN 和p38MAPK）在病灶周圍腦組織表達(dá)增加[20]，崔振文[21]發(fā)現(xiàn)MAPK 通路可調(diào)節(jié)腦出血后神經(jīng)凋亡。MAPK 可通過胞外信號(hào)使ERK、JUN 和p38MAPK 發(fā)生磷酸化促進(jìn)表達(dá)炎癥因子（IL-1β 和TNF-α）的產(chǎn)生，介導(dǎo)腦出血相關(guān)病理生理過程[22-23]。研究證實(shí)，通過直接減少體內(nèi)炎性介質(zhì)（IL-1β 和TNF-α）的表達(dá)，可減輕神經(jīng)功能損傷[24-26]，減輕腦血管疾病后的氧化反應(yīng)，從而起到腦保護(hù)作用[27]。本研究中，IL-1β和TNF-α 均是腦出血方治療靶點(diǎn)，且均在MAPK 信號(hào)通路中富集。基于此，我們推測腦出血方可能通過介導(dǎo)MAPK 信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白（ERK、JUN 和p38MAPK）調(diào)節(jié)IL-1β、TNF-α 的表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)ICH 神經(jīng)凋亡發(fā)揮對(duì)腦出血治療效果。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)腦出血方治療腦出血的作用機(jī)制進(jìn)行初步理論探討，研究結(jié)果表明腦出血方48 個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)341 個(gè)治療靶點(diǎn)中，其中MAPK1、AKT1、JUN、TNF 可能為腦出血方治療腦出血得關(guān)鍵靶點(diǎn)，其可能通過調(diào)節(jié)HIF-1活性亞基；抑制cAMP 水平，修復(fù)血腦屏障；調(diào)控MAPK 信號(hào)通路參與腦水腫的發(fā)生、減輕神經(jīng)凋亡，抑制ICH 病理過程，為進(jìn)一步深入探討腦出血方治療腦出血提供了理論基礎(chǔ)。