香雪蘭精油體外抗白色念珠菌的機(jī)制初探

鄭海洋，張譯同，曹東慧，王 麗

(1.東北師范大學(xué)遺傳與細(xì)胞學(xué)研究所，教育部分子表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130024；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院臨床研究部，吉林 長(zhǎng)春 130021)

白色念珠菌(Candidaalbicans)是一種常見(jiàn)的條件致病真菌.在正常情況下，白色念珠菌以酵母態(tài)存在于人體表面和黏膜上，不會(huì)引起感染癥狀.但是，當(dāng)人體的免疫力低下時(shí)，白色念珠菌會(huì)迅速繁殖并轉(zhuǎn)換為菌絲態(tài)，侵襲人體的口腔、皮膚和陰道，引起感染[1-2].由白色念珠菌引起的血液感染，即使進(jìn)行了治療，死亡率仍然高達(dá)70%[3-4].臨床上常用的抗真菌藥如氟康唑和兩性霉素B等具有廣譜抗真菌作用，但長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致病原菌耐藥性的增加.因此，開(kāi)發(fā)新的抗真菌藥成為公共衛(wèi)生安全的迫切愿望[5-6].

中國(guó)地大物博，有許多藥用植物與芳香植物，加之我國(guó)擁有悠久的中草藥應(yīng)用歷史，因此藥用植物成為開(kāi)發(fā)新的抗真菌藥物的寶庫(kù).自然界中大部分植物都具有獨(dú)特的氣味，這些氣味由植物中多種小分子揮發(fā)性物質(zhì)(萜類、苯環(huán)/苯丙素類和脂肪族衍生物)混合而成[7-8].這些揮發(fā)性物質(zhì)不僅在植物的生長(zhǎng)和繁殖中發(fā)揮重要作用[9]，還被發(fā)現(xiàn)具有抗真菌活性[10-11].

香雪蘭(Freesiahybrida)是鳶尾科的多年生球莖花，它具有濃郁的香氣，包含多種揮發(fā)性物質(zhì)，尤其是大量的萜類化合物.本課題組前期從香雪蘭RedRiver?花朵中提取了精油，隨后通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)測(cè)量了精油中的成分和各成分含量.課題組之前的研究表明，香雪蘭精油對(duì)多種微生物都有抑制作用[12]，但是對(duì)白色念珠菌的抗真菌作用及其可能的作用機(jī)制尚不清楚.為此，本文檢測(cè)了精油的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，研究了精油對(duì)白色念珠菌增殖的影響，并通過(guò)膜完整性、氧化還原平衡和線粒體功能進(jìn)一步探討了其作用機(jī)理，以為抗真菌感染藥物的開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

香雪蘭RedRiver?購(gòu)自遼寧省朝陽(yáng)市凌源市.取花朵提取精油.

白色念珠菌ATCC10231取自東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，用酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)培養(yǎng).芳樟醇購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))，其余試劑購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司.

1.2 濾紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)量精油及其成分的抗真菌能力

挑取白色念珠菌單克隆，接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，置于30℃搖床140 r/min培養(yǎng)16 h左右.將菌懸液與含瓊脂的培養(yǎng)基混合均勻后平鋪在制備好的固體培養(yǎng)基表面，取直徑6 mm的無(wú)菌濾紙片分別在二甲基亞砜(DMSO)、兩性霉素B、精油及精油組分中完全浸潤(rùn)，放置在含菌平板上，培養(yǎng)24 h后觀察并測(cè)量抑菌圈大小.其中，DMSO為陰性對(duì)照，兩性霉素B為陽(yáng)性對(duì)照.

1.3 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

調(diào)整菌濃度至1×106個(gè)/mL左右，分裝至15 mL離心管中.使用DMSO做中間溶劑，稀釋精油并加入菌懸液中，使精油終濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為0.4%，0.25%，0.125%，0.1%，0.05%，0.025%，0.005%，0.30℃培養(yǎng)24 h后觀察溶液，肉眼觀察無(wú)渾濁的為最低抑菌濃度.在超凈臺(tái)中從每管吸取100 μL溶液涂布至YPD平板上，繼續(xù)過(guò)夜培養(yǎng)，無(wú)菌落生長(zhǎng)的為最低殺菌濃度.

1.4 白色念珠菌生長(zhǎng)曲線繪制

調(diào)整菌濃度為(0.1～1)×106個(gè)/mL，將菌液分為4組，分別使用不同濃度精油(0.125%，0.1%，0.05%)和DMSO進(jìn)行處理，每組3個(gè)平行.每隔1 h測(cè)量菌液D值，繪制白色念珠菌生長(zhǎng)曲線.

1.5 觀察香雪蘭精油對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞形態(tài)的影響

取活性良好的菌懸液，經(jīng)PBS洗滌后用不同濃度的香雪蘭精油分別處理2 h和4 h.處理完成后10 000 r/min離心10 min，取上清測(cè)量其在260和280 nm處的吸光值，確定白色念珠菌大分子物質(zhì)泄漏情況，判斷細(xì)胞膜通透性變化.

收集不同濃度的精油處理過(guò)的白色念珠菌，PBS洗滌后重懸，移入裝有玻璃片的24孔培養(yǎng)板中，靜置1 h使菌液沉淀至玻璃片上.小心除去上清液，2.5%戊二醛固定并用系列叔丁醇脫水干燥.取干燥的樣品進(jìn)行金屬濺射涂層，用S-570掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài).

1.6 檢測(cè)白色念珠菌氧化還原狀態(tài)

離心收集精油處理后的白色念珠菌，用DCFH-DA探針測(cè)定活性氧(ROS)含量.設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè).根據(jù)(Fsample-Fblank)/(FDMSO-Fblank)×100%將實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)換為百分比.式中，F(xiàn)DMSO，F(xiàn)sample，F(xiàn)blank分別是DMSO處理組、精油處理組和PBS處理組的熒光值.用JC-1染色工作液測(cè)定白色念珠菌線粒體膜電位變化.設(shè)置激發(fā)光波長(zhǎng)490 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)530 nm檢測(cè)JC-1單體；設(shè)置激發(fā)光波長(zhǎng)525 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)590 nm檢測(cè)JC-1聚合物.線粒體膜電位表示為聚合物與單體的比.

離心收集精油處理后的白色念珠菌，液氨研磨破碎細(xì)胞，用PBS溶解并離心，取上清作為待測(cè)樣品.按碧云天總SOD活性檢測(cè)試劑盒(WST-8法)說(shuō)明書(shū)、過(guò)氧化氫酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)和脂質(zhì)氧化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定白色念珠菌超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)酶活性和丙二醛(MDA)含量.

1.7 抗氧化基因表達(dá)分析

通過(guò)Trizol法提取白色念珠菌RNA，轉(zhuǎn)化為cDNA，并使用SYBR Green PCR Master mix專用試劑通過(guò)Real time-qPCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá).引物序列如下：

ACT正向引物序列，5′-CGATGGAAGTTTGAGGCAATA-3′，反向引物序列，5′-CTCTCGGCC AAGGCTTATACT-3′；SOD2正向引物序列，5′-CGCAACTACCCGTGCTACTTT-3′，反向引物序列，5′-TGGTTCAGTAGCGGAGAATTCA-3′；SOD6正向引物序列，5′-GACCCCGACCCACCTCAACAA-3′，反向引物序列，5′-GGGTAGCAAGGAGTGCCGGT-3′；CAT正向引物序列，5′-CCACCCCAGCTGATTTCAAA-3′，反向引物序列，5′-ACACTCTGTCTTGGATAGCAGCAT-3′.

2 結(jié)果與分析

2.1 精油及其成分對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的抑制能力

表1顯示了香雪蘭精油及其主要成分對(duì)白色念珠菌的抗真菌作用.DMSO作為陰性對(duì)照對(duì)白色念珠菌沒(méi)有明顯的抑制作用.兩性霉素B作為抑制白色念珠菌的陽(yáng)性對(duì)照，抑菌圈的直徑為(1.283±0.029)cm，這意味著白色念珠菌對(duì)其具有中度敏感性.精油對(duì)白色念珠菌的抑制作用強(qiáng)于兩性霉素B，抑菌圈直徑為(2.267±0.208)cm，說(shuō)明白色念珠菌對(duì)精油極度敏感.在精油的主要成分中，芳樟醇與精油具有相似的作用，松油醇、香葉醇和橙花醇具有中度或高度的抑制作用，而羅勒烯、環(huán)檸檬醛、紫羅蘭酮和二氫-β-紫羅蘭酮幾乎沒(méi)有抑菌作用，因此，選擇精油和芳樟醇來(lái)檢查對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的影響.檢測(cè)結(jié)果表明，它們的抗真菌作用都是劑量依賴性的.此外，0.1%的精油顯著抑制了白色念珠菌的生長(zhǎng)(P<0.05)，而0.1%的芳樟醇沒(méi)有明顯的抑制作用(見(jiàn)圖1(A))，表明精油具有顯著的抑制作用，抗真菌作用比其組分要強(qiáng).

表1 香雪蘭配制精油及其主要成分對(duì)白色念珠菌的抑制作用

當(dāng)白色念珠菌懸液沒(méi)有肉眼可見(jiàn)的渾濁時(shí)，精油達(dá)到最小抑菌濃度(MIC).當(dāng)精油濃度為0.1%時(shí)，液體沒(méi)有渾濁，D(600)值接近空白對(duì)照，因此，判斷精油的MIC為0.1%.繼續(xù)培養(yǎng)后，當(dāng)精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.25%時(shí)，平板上沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，精油的MFC為0.25%(見(jiàn)圖1(B)).綜合考慮MIC和MFC，在以下實(shí)驗(yàn)中選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%，0.1%和0.125%的精油探究抑菌殺菌機(jī)制.

圖1 精油對(duì)白色念珠菌的抑制作用

用不同濃度的精油和芳樟醇處理白色念珠菌細(xì)胞24 h(A).在去除精油的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，測(cè)得MFC(B).數(shù)據(jù)代表3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值.

2.2 精油對(duì)白色念珠菌增殖和形態(tài)的作用

檢查精油對(duì)白色念珠菌20 h內(nèi)增殖的劑量影響，結(jié)果見(jiàn)圖2.由圖2(A)可見(jiàn)，0.05%的精油在最初的8 h內(nèi)對(duì)白色念珠菌的生長(zhǎng)具有抑制作用，而其抗真菌作用在隨后的12 h內(nèi)逐漸降低.但是，在整個(gè)20 h內(nèi)，0.1%和0.125%精油處理的白色念珠菌都沒(méi)有生長(zhǎng)趨勢(shì)，表明0.1%和0.125%的精油抗真菌作用是持續(xù)的.對(duì)白色念珠菌的進(jìn)一步形態(tài)學(xué)觀察表明：DMSO組白色念珠菌的形狀規(guī)則，背景干凈；0.05%處理組細(xì)胞黏附無(wú)明顯改變；0.1%處理組細(xì)胞融合在一起，輪廓模糊，背景中存在一些細(xì)胞碎片；在0.125%的處理組中，可以發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞碎片(見(jiàn)圖2(B)).

為了檢測(cè)精油是否會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，在不同處理組中檢測(cè)大分子物質(zhì)的泄漏情況，結(jié)果(見(jiàn)圖2(C))表明，精油處理2 h后，大量核酸和蛋白質(zhì)從細(xì)胞中流出，隨著精油處理時(shí)間的延長(zhǎng)，大分子物質(zhì)的泄漏程度也在增加.

(A)生長(zhǎng)曲線；(B)細(xì)胞形態(tài)變化；(C)核酸泄漏和蛋白質(zhì)泄漏情況

2.3 精油誘導(dǎo)白色念珠菌的氧化還原失衡

正常細(xì)胞代謝產(chǎn)生的活性氧會(huì)被抗氧化酶(如超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶)迅速分解為無(wú)害物質(zhì)[13].為了了解白色念珠菌中活性氧(ROS)的產(chǎn)生和積累情況，檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)ROS水平以及SOD、CAT的活性，結(jié)果見(jiàn)圖3.由圖3(A)可見(jiàn)，ROS水平在0.05%精油處理組略有增加，而在0.1%和0.125%處理組極顯著增加.為了檢查ROS的積累是否能引起脂質(zhì)過(guò)氧化水平的提高，檢測(cè)了丙二醛的含量.與ROS的結(jié)果類似，0.1%和0.125%處理組中丙二醛的含量有所增加(見(jiàn)圖3(B)).對(duì)線粒體膜電位的測(cè)量結(jié)果如圖3(C)所示，當(dāng)用0.1%和0.125%的精油處理白色念珠菌時(shí)，線粒體膜電位極顯著降低.這表明ROS積累與粒體功能障礙有關(guān).此外，在蛋白質(zhì)和mRNA水平觀察精油處理后白色念珠菌超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的變化情況，SOD和CAT酶活性和基因表達(dá)水平均呈下降趨勢(shì)(見(jiàn)圖3(D)，(E)，(F)).

(A)ROS的積累情況；(B)MDA含量變化；(C)線粒體膜電位變化；(D)超氧化物歧化酶活性；

3 討論與結(jié)論

白色念珠菌嚴(yán)重威脅著艾滋病、癌癥和器官移植等免疫薄弱的患者的安全[14-15].傳統(tǒng)抗真菌藥物的使用具有局限性，為此人們迫切尋找新的藥物替代或協(xié)助治療白色念珠菌感染.由于毒性低且易于獲取，多種植物代謝產(chǎn)物引起了科學(xué)家的關(guān)注[16-18].1969—2015年，多達(dá)142種具備抗真菌作用的天然產(chǎn)物被記錄發(fā)表[19].本實(shí)驗(yàn)采用香雪蘭RedRiver?花朵提取精油，通過(guò)濾紙片瓊脂擴(kuò)散法得到香雪蘭精油對(duì)白色念珠菌的抑菌圈直徑為22.67 mm，藥物敏感程度為極度敏感.芳樟醇、松油醇和香葉醇等主要成分單獨(dú)實(shí)驗(yàn)時(shí)也表現(xiàn)出抑菌作用，這與Pinto E.，Carson C.和Riley T.等人的研究結(jié)果[20-21]一致.但本實(shí)驗(yàn)中單一成分的抑菌圈直徑小于香雪蘭精油本身，證明香雪蘭精油的抑菌效果優(yōu)于單一成分.常量稀釋法測(cè)定的香雪蘭精油對(duì)白色念珠菌的MIC和MFC分別為0.1%和0.25%.生長(zhǎng)曲線的結(jié)果與之相符，MIC及更高濃度的香雪蘭精油能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)阻礙白色念珠菌的生長(zhǎng)，而更低濃度的精油只能起到延緩生長(zhǎng)、降低真菌活性的作用.與國(guó)內(nèi)一些其他精油相比，如朱梅芳等[22]提取的五味子-薄荷-連翹混合精油，香雪蘭精油的MIC更小，對(duì)白色念珠菌抑菌作用更強(qiáng).

精油抗真菌的機(jī)制包括破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、影響細(xì)胞分裂、破壞DNA/RNA和蛋白質(zhì)合成以及阻礙線粒體功能等[10-11，23-25].在本實(shí)驗(yàn)中，利用分光光度計(jì)探測(cè)菌液上清中核酸及蛋白質(zhì)的含量可以發(fā)現(xiàn)，精油處理后上清液吸光值上升，白色念珠菌細(xì)胞膜通透性增加導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏.掃描電鏡下也觀察到精油導(dǎo)致白色念珠菌形態(tài)改變，相互粘連.對(duì)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)顯示，精油處理后白色念珠菌的線粒體膜電位喪失、ROS大量積累、脂質(zhì)過(guò)氧化水平加強(qiáng)，表明精油導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制可能與線粒體功能障礙有關(guān).線粒體是細(xì)胞的重要細(xì)胞器，它們的損傷會(huì)導(dǎo)致大量活性氧的產(chǎn)生[26]，進(jìn)一步誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化作用加強(qiáng)，產(chǎn)生以MDA為代表的終產(chǎn)物.MDA能引起大分子(如蛋白質(zhì)和核酸)的交聯(lián)聚合，并且具有細(xì)胞毒性[27-28].此外，香雪蘭精油抑制了具有清除ROS作用的抗氧化酶SOD和CAT的活性.抗氧化酶的缺乏導(dǎo)致活性氧和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的大量積累，進(jìn)一步破壞了生物膜結(jié)構(gòu).根據(jù)以上結(jié)果，香雪蘭精油影響白色念珠菌的機(jī)制包括破壞細(xì)胞膜導(dǎo)致內(nèi)溶物泄露以及誘導(dǎo)線粒體功能障礙導(dǎo)致氧化還原失衡，這也表明不同的作用機(jī)制在精油抑制白色念珠菌的過(guò)程中并非單獨(dú)發(fā)生，而是共同起作用.

香雪蘭精油對(duì)白色念珠菌有良好的抑制作用，該作用具有時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng).這種抑制機(jī)制造成細(xì)胞膜損傷與線粒體功能障礙，使細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡，細(xì)胞不能正常生長(zhǎng)生存.香雪蘭精油富含多種萜烯類化合物，成分復(fù)雜，可能比傳統(tǒng)單一成分的抗真菌藥更難產(chǎn)生耐藥性現(xiàn)象.另外，香雪蘭精油氣味清新，容易為患者所接受.有關(guān)香雪蘭精油的產(chǎn)品值得進(jìn)一步研究，為開(kāi)發(fā)天然抗真菌藥物奠定基礎(chǔ).