bcl-2、bax在膝關節(jié)骨性關節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展中的作用

柯俊泉，董 忠 ，潘廷明，汪偉劍

（福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003）

膝關節(jié)骨性關節(jié)炎（KOA）是中老年人的常見病和多發(fā)病。有調查報告指出，60 歲以上的老年人KOA 的患病率為50%，75 歲以上的老年人KOA 的患病率為80%[1-2]。該病主要的臨床特點為關節(jié)軟骨組織退變、軟骨丟失、軟骨下骨改變及滑膜炎等關節(jié)組織病變。該病可導致患者出現(xiàn)患側膝關節(jié)腫痛、膝關節(jié)活動受限等，甚至可發(fā)生嚴重的關節(jié)畸形。隨著臨床上對KOA 病理機制研究的不斷深入，相關的研究人員越來越關注軟骨細胞凋亡與KOA 進展之間的關系[3]。軟骨組織中的細胞凋亡是一種由基因控制的細胞自主有序的死亡，屬于細胞的程序性死亡。軟骨細胞凋亡的發(fā)生機制非常復雜，但其凋亡過程具有獨特性。軟骨細胞的凋亡過程與基質降解具有緊密的關聯(lián)性[4-5]。當某些病理因素作用于軟骨細胞時，細胞凋亡機制可被啟動。細胞的過度凋亡可間接導致基質合成相應減少，軟骨細胞失去維持內環(huán)境穩(wěn)定的功能，從而可形成惡性循環(huán)。bcl-2 基因是參與關節(jié)軟骨細胞凋亡的相關原癌基因之一。bcl-2 家族中有許多可促進軟骨細胞凋亡和抑制軟骨細胞凋亡的成員，包括bcl-2、bax 和bcl-x 等。軟骨細胞的大量凋亡與bcl-2和bax 失衡有關[6]。

1 bcl-2、bax 在軟骨細胞凋亡中的作用

bcl-2 家族主要是通過表達蛋白的相互作用來實現(xiàn)調控軟骨細胞凋亡的目的。軟骨細胞凋亡是指在一定的生理或病理因素影響下，軟骨細胞自主啟動死亡程序。而當局部軟骨組織發(fā)生損傷或有相關的凋亡因子介入，迫使大量的軟骨細胞不得不啟動凋亡程序時，細胞外基質的合成與降解可失衡，凋亡小體的數(shù)量可增多，從而可使軟骨細胞無法維持內環(huán)境的穩(wěn)定。在bcl-2 家族中，bcl-2 和bax 是一組細胞凋亡調控基因。目前，醫(yī)學界對bcl-2 和bax 的結構和生理功能都有深度的研究。

軟骨細胞凋亡是一個有多種細胞因子、多種細胞信號轉導通路參與的復雜的病理過程。該過程主要涉及上游和下游信號通路。上游信號通路包括MAPKs、PI3K-Akt、JAKs/statl、Wnt/β-Catenin 和核因子kB。下游信號通路主要涵蓋死亡受體途徑，以及與bcl-2、bax 關系密切的線粒體途徑和內質網(wǎng)應激反應性凋亡途徑[7]。bcl-2 和bax 可通過表達的蛋白直接或間接參與到凋亡信號的轉導通路中，從而實現(xiàn)調節(jié)細胞凋亡的作用。bcl-2 可通過表達蛋白實現(xiàn)抗凋亡的作用，其表達的蛋白主要錨定于線粒體膜、內質網(wǎng)和核膜等。因此，bcl-2 蛋白可存在于內質網(wǎng)上，這種結構使其可阻斷Ca2+向細胞質的流動，間接促使Ca2+依賴性核酸內切酶失去活性，從而實現(xiàn)抑制細胞凋亡的目的。另外，bcl-2 蛋白還可改變線粒體巰基的氧化還原狀態(tài)，通過膜電位調節(jié)細胞的凋亡，并可通過抑制caspase 的激活及細胞色素c（cytc）、凋亡誘導因子（AIF）等重要蛋白的釋放，起到阻抑細胞凋亡的作用[8]。因此，bcl-2 蛋白結合相關因子常被用于評價bcl-2 家族基因在細胞凋亡中的作用。王振龍等[9]通過藥物干預的方式降低腫瘤細胞中bcl-2 的表達，增加其中bax 的表達，同時采用蛋白質印跡法（Western blot）檢測到腫瘤細胞中CHOP 的表達上調。CHOP 是內質網(wǎng)應激介導凋亡的重要促進因子。張鐵山等[10]通過進行氟誘導乳鼠軟骨細胞凋亡機制實驗發(fā)現(xiàn)，凋亡的軟骨細胞具有細胞核緊縮凝聚、內膜結構不清、內質網(wǎng)擴張的特點，并顯露大量的空泡，其中的bcl-2 蛋白表達也明顯降低。bax 表達的蛋白是一種整合膜蛋白，主要散落在細胞的內膜、細胞質和細胞核中，通過形成同型二聚體促進細胞的凋亡。bcl-2 蛋白可與bax 競爭性地結合，并形成更為穩(wěn)定的bcl-2/bax 異二聚體。bcl-2/bax 二聚體可阻抑bax/bax 誘導的細胞凋亡。因此，bcl-2/bax 可構成一個平衡系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，bcl-2 蛋白占優(yōu)勢時，細胞可生存，bax 蛋白大量表達則可加速細胞的凋亡[11]。二者的蛋白表達比值可控制細胞的生存與凋亡。

2 軟骨細胞凋亡對KOA 的影響

KOA 是由于機械和生物因素的長期累積作用，使軟骨細胞過度凋亡，細胞外基質的合成與代謝發(fā)生紊亂所導致的膝關節(jié)疾病[12]。軟骨細胞是成熟軟骨中唯一能維持內部環(huán)境平衡的細胞類型。這類細胞過度凋亡可加重KOA 的病情。因此，有研究認為，阻抑軟骨細胞的凋亡可在一定程度上改變KOA 的轉歸[13-14]。KOA 的發(fā)生和發(fā)展是一個漫長而緩慢的過程，這也與軟骨細胞的凋亡過程不同步有關。大量的實驗結果證實，在正常的膝關節(jié)軟骨組織中，凋亡細胞的檢出率很低，且多存在于軟骨表面。但在KOA 模型中，軟骨表面至中層都存在細胞凋亡的現(xiàn)象。當軟骨表面發(fā)生纖維化時，這種現(xiàn)象甚至可出現(xiàn)在軟骨深層。

近年來，關于軟骨細胞凋亡在KOA 中作用的研究越來越多。相關的動物實驗[15-16]、人體實驗（包含體外和體內實驗）[17]結果表明，在發(fā)生KOA 的軟骨組織中，細胞凋亡的發(fā)生率很高。軟骨細胞凋亡在KOA 的進展中具有重要的作用。目前，大多數(shù)的實驗研究均以動物KOA 模型為研究對象。末端脫氧核苷酸轉移酶介導的原位缺口末端標記測定法（TUNEL）是目前檢測軟骨細胞凋亡過程中染色體DNA 斷裂的常用方法。

3 預處理KOA 模型對bcl-2 和bax 蛋白表達的影響

軟骨細胞過度凋亡是KOA 發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)的一種病理變化過程。bcl-2 和bax 基因是參與軟骨細胞凋亡機制的一類相關因子。因此，通過影響bcl-2 和bax 的表達，阻抑軟骨細胞的凋亡，闡明預處理在KOA 治療中的有效性成為近年來臨床上研究的重點。具體而言，即運用各種檢測bcl-2 和bax 蛋白的手段、預處理方法可明顯減少KOA 患者軟骨組織中的凋亡細胞。而且，運用檢測bcl-2 和bax 蛋白的手段發(fā)現(xiàn)bcl-2 的表達增加、bax 的表達降低可在一定程度上闡釋預處理在KOA 治療中的有效性。

邢恩福等[18]將rhil-1 受體拮抗劑注入兔KOA 模型的膝關節(jié)腔內，并采用TUNEL 染色法在光鏡下觀察兔膝關節(jié)軟骨組織中細胞凋亡的情況，結果顯示，與模型組兔相比，實驗組兔軟骨組織中的凋亡細胞明顯減少。該研究結果表明，采用rhil-1 受體拮抗劑對兔KOA 模型進行預處理可降低其軟骨細胞的凋亡率。進行Western blot 檢測的結果表明，與模型組兔相比，實驗組兔軟骨組織中bcl-2 蛋白的表達明顯增加，bax 蛋白的表達顯著降低。進行逆轉錄- 聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測的結果顯示，實驗組兔軟骨組織中bcl-2 蛋白的信使核糖核酸（mRNA）增強，bax 蛋白的mRNA 減弱。近年來，張媛媛等[19]、張宇標等[20]、胡炯等[21]分別采用電針、甲基蓮心堿和染料木素對大鼠KOA 模型進行預處理后發(fā)現(xiàn)，與KOA 模型組大鼠相比，實驗組大鼠軟骨組織中凋亡阻抑蛋白bcl-2 的表達升高，促凋亡蛋白bax的表達降低。此外，中藥在減輕KOA 的嚴重程度中顯示出良好的作用。何曉瑾等[22]研究骨痹方對KOA 大鼠軟骨細胞結構和功能的影響后發(fā)現(xiàn)，該方可促進其軟骨組織中Akt和Bcl-2 蛋白的表達，抑制其軟骨細胞的凋亡。李成付等[23]對兔KOA 模型軟骨組織中bcl-2/bax、Akt 的表達進行研究后發(fā)現(xiàn)，牛膝乙醇提取物可有效增加兔軟骨組織中bcl-2 和bax 蛋白的表達，阻抑其軟骨細胞的凋亡。

4 軟骨細胞凋亡與軟骨細胞自噬的關系

軟骨細胞的死亡可能包括凋亡和自噬兩種形式。這兩種形式可能存在于KOA 的不同病理階段。但自噬與凋亡、壞死不同。在軟骨細胞發(fā)生自噬的早期，其中的染色質可發(fā)生無序凝聚，高爾基體和內質網(wǎng)的數(shù)量可增加，吞噬小泡和細胞外基質小泡可發(fā)生聚集。西班牙拉科魯納的研究人員曾表示，增加KOA 患者軟骨細胞的自噬水平可防止其軟骨組織發(fā)生退化[24]。一項關于TUNEL 染色陽性的人骨關節(jié)炎軟骨細胞的研究表明，高爾基58 K 蛋白和caspase-2l重疊，這一研究結果證實了上述的觀點[25]。相關的研究報道表明，bcl-2 可作用于陽性的自噬調節(jié)因子beclin-1[26]。這些證據(jù)都提示，細胞凋亡與細胞自噬之間存在一定的關聯(lián)性。這二者之間的關聯(lián)性也為研究KOA 與軟骨細胞凋亡關聯(lián)性的人員提供了新的研究思路。

5 小結

KOA 的發(fā)病機制非常復雜。臨床上尚不清楚該病具體的發(fā)病機制。目前，對bax 和bcl-2 的研究主要集中在動物實驗和細胞實驗上。bax 和bcl-2 是兩種已明確可參與細胞凋亡信號轉導途徑的相關因子，可能存在于軟骨細胞凋亡的多個信號途徑中?，F(xiàn)今，關于軟骨細胞凋亡信號通路與KOA 發(fā)病關系的研究報道較少。今后，相關的研究人員可加強對bax 和bcl-2 蛋白的深入研究，并對各種途徑之間的聯(lián)系進行研究，從而為臨床上治療KOA 提供指導。