多重RT-PCR與毛細(xì)電泳聯(lián)用技術(shù)在兒童下呼吸道感染病原體檢測中的應(yīng)用*

馮星星，李 明，賀曉麗

云南省昆明市兒童醫(yī)院/云南省兒童重大疾病研究重點實驗室：1.檢驗科；2.呼吸內(nèi)科；3.云南省兒科研究所，云南昆明 650028

急性下呼吸道感染(ALRTI)是臨床兒童最為常見的感染性疾病，病原學(xué)復(fù)雜，對兒童健康造成嚴(yán)重威脅，其中病毒是嬰幼兒和學(xué)齡前兒童最為主要的ALRTI病原[1]。在兒童ALRTI中明確感染的病原體，對于疾病早期診斷和特異性抗病毒治療，選擇合理治療方案非常重要。目前，國內(nèi)實驗室開展檢測較多的是采用直接免疫熒光法(DFA)檢測7種常見的呼吸道病毒抗原：呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、甲型流感病毒(InfA)、乙型流感病毒(InfB)、副流感病毒1、2、3(PIVⅠ、PIVⅡ、PIVⅢ)，但是在ALRTI中常見的鼻病毒(HRV)、冠狀病毒(HCOV)和近年來新發(fā)現(xiàn)的偏肺病毒(HMPV)、博卡病毒(HBOV)等也被證實是引起兒童呼吸道感染的重要病原，這幾種病毒均不能采用DFA進行常規(guī)檢測。為了滿足臨床診治的需要，近年來核酸檢測技術(shù)的應(yīng)用成為呼吸道病原體外診斷的新方向，采用多重RT-PCR技術(shù)可同時檢測RSV、HRV等在內(nèi)的13種呼吸道病原體，因此，本研究應(yīng)用多重RT-PCR技術(shù)和DFA同時對38例兒童ALRTI痰液標(biāo)本進行呼吸道病原體檢測，比較兩種方法的檢測結(jié)果，探討多重RT-PCR技術(shù)在兒童ALRTI檢測中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年12月至2020年1月昆明市兒童醫(yī)院因呼吸道感染收治入院患兒38例。其中男22例，女16例，年齡12 d至7歲。收集其痰液標(biāo)本38份。

1.2儀器與試劑 3500Dx基因分析儀和PCR基因擴增儀是購自美國ABI公司；Olympus-BX65熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司；13種病原體多重檢測試劑盒是購自寧波海爾施科技有限公司，各病毒擴增核酸片段大小信息見表1；核酸提存或純化試劑，備案號：浙甬械備2015 0006號；7項呼吸道病毒檢測試劑盒(免疫熒光法)購自美國Diagnostic Hybrids公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 患兒入院后由專業(yè)護士用一次性吸痰管抽吸痰液1.0～2.0 mL置于無菌培養(yǎng)管中，不得傾斜或顛覆，標(biāo)本采集后2 h內(nèi)送檢，將標(biāo)本分成2份，分別進行多重RT-PCR實驗和DFA實驗。

1.3.2多重RT-PCR

1.3.2.1樣本前處理 在痰液中加入等體積生理鹽水，徹底混勻，吸取上清液進行核酸提取。

1.3.2.2核酸提取 使用核酸提取或純化試劑(備案號：浙甬械備2015 0006號)進行手動核酸提取，向每份參與提取的標(biāo)本(包括ResP陽性對照和陰性對照)中加入2 μL的RT-PCR內(nèi)參共同提取。13種呼吸道病原體多重檢測試劑盒所檢測的病原體對應(yīng)擴增片段如下：InfA，105.2 nt;ADV，112.7/114.7 nt;Boca，121.1 nt;HRV，129.5 nt;人RNA內(nèi)參(huRNA)，147.0 nt;甲型流感病毒H1N1(2009)(09H1)，158.6 nt;PIV，179.1 nt;衣原體(Ch)，188.2 nt;HMPV，199.9 nt;InfB，207.0 nt;肺炎支原體(Mp)，212.3 nt;人DNA內(nèi)參(huDNA)，232.5 nt;甲型流感病毒H3N2(H3N2)，241.0 nt;HCOV，261.7 nt;RSV，276.7 nt;RT-PCR內(nèi)參(IC)，313.0 nt。

1.3.2.3配制RT-PCR體系 (1)對ResP預(yù)混液進行徹底渦旋，瞬時離心10 s；將RT-PCR酶混合液瞬時離心10 s后豎直置于冰上。(2)計算樣品數(shù)目N(N=陽性對照1個+陰性對照1個+臨床待檢樣品數(shù)目)，在1.5 mL離心管中依次加入以下體積試劑：14 μL ×(N+1)的ResP預(yù)混液和1 μL ×(N+1)的RT-PCR酶液。將離心管中的混合液顛倒混勻并瞬時離心后，豎直置于冰上。(3)取15 μL的混合液分裝至各個PCR管中，瞬時離心10 s，將PCR管豎直置于冰上，由于混合液較黏稠，為確保分裝準(zhǔn)確，建議采用反向移液法(吸液時先將移液器按壓至第2檔，之后放松移液器以吸取混合液，推液時壓至第1檔結(jié)束)。

1.3.2.4RT-PCR擴增 在上述PCR管中按順序分別加入陽性對照、陰性對照和待檢測的核酸樣品各5 μL，完成加樣后，將PCR管瞬時離心10 s，并置于冰上。為避免污染，建議先加入陰性對照，再加入待檢測核酸，最后加入陽性對照。PCR擴增條件：25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，95 ℃，2 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共6個循環(huán)；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共29個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.3.2.5毛細(xì)電泳儀熒光信號強度的測量 (1)配置毛細(xì)電泳液：使用標(biāo)準(zhǔn)品測量毛細(xì)電泳平臺中所有毛細(xì)管的熒光信號強度，配置標(biāo)準(zhǔn)品電泳液，Hi-DiTMFormamide 9 μL × 8孔SIZE-500 Plus 0.25 μL × 8孔，標(biāo)準(zhǔn)品1 μL × 8孔。(2)加樣：將配制好的標(biāo)準(zhǔn)品電泳液渦旋混勻后，分別取10 μL加入到每道毛細(xì)管對應(yīng)的96孔板上進行電泳分離，得到每道毛細(xì)管中標(biāo)準(zhǔn)品的峰高度。(3)PCR產(chǎn)物的毛細(xì)電泳分離：制備電泳樣品，Hi-DiTMFormamide 9 μL/孔，SIZE-500 Plus 0.25 μL/孔，PCR產(chǎn)物1 μL/孔。3500Dx遺傳分析儀毛細(xì)電泳分離樣品，選擇“Fragment”電泳分離方法(參照3500Dx基因分析儀使用說明書)。

1.3.2.6樣品檢測結(jié)果判斷 檢測樣品的峰型圖中同時出現(xiàn)人RNA內(nèi)參、人DNA內(nèi)參，且峰高度高于該道毛細(xì)管中標(biāo)準(zhǔn)品高峰，說明樣品取樣成功，未發(fā)生明顯降解且核酸提取成功；若出現(xiàn)內(nèi)置RT-PCR內(nèi)參的特征峰，且峰高度高于該道毛細(xì)管中標(biāo)準(zhǔn)品高峰，其監(jiān)控整個操作流程，說明實驗流程正常。由于競爭擴增原因，該峰可能降低甚至消失。(1)以ResP陽性對照為模板的峰型圖中必須出現(xiàn)16個特征峰，且16個特征峰的峰高度均高于該道毛細(xì)管中標(biāo)準(zhǔn)品高峰。以陰性對照為模板的峰型圖中必須出現(xiàn)人DNA內(nèi)參和RT-PCR內(nèi)參的特征峰(也有可能出現(xiàn)人RNA內(nèi)參的特征峰)，且這2個特征峰的峰高度均高于該道毛細(xì)管中標(biāo)準(zhǔn)品高峰。(2)擴增產(chǎn)物中的目標(biāo)位點峰高度低于該道毛細(xì)管標(biāo)準(zhǔn)品峰低峰(NegS)的，判該位點陰性。(3)擴增產(chǎn)物中的目標(biāo)位點峰高度高于該道毛細(xì)管標(biāo)準(zhǔn)品峰高峰(PosS)的，判該位點陽性。(4)擴增產(chǎn)物中的目標(biāo)位點高于該道毛細(xì)管標(biāo)準(zhǔn)品低峰，但低于標(biāo)準(zhǔn)品高峰的，判斷該點灰區(qū)；峰高度落在灰區(qū)的樣品建議重新提核酸進行檢測，若樣品仍在灰區(qū)或落在陽性區(qū)域的，判陽性。若重復(fù)檢測落在陰性區(qū)域的，判陰性。

1.3.3DFA 痰液標(biāo)本中加入磷酸鹽緩沖液(PBS)5～10 mL,在渦旋混勻器上輕微混勻，以1 500 r/min離心5 min，去除上清留取沉淀，再用PBS洗滌沉淀1～2 次，洗滌要徹底，避免殘留黏液產(chǎn)生非特異性熒光。最后，將沉淀液溶解在0.5～1.0 mL PBS中，吸管輕輕吹打使其成為細(xì)胞懸液，移液器吸取25 μL細(xì)胞懸液于玻片上點樣共7點，分別用于檢測RSV、ADV、InfA、InfB、PIVⅠ、PIVⅡ、PIVⅢ。玻片空氣中室溫干燥后，冷丙酮固定10 min。玻片上每個細(xì)胞點加1滴相應(yīng)的熒光抗體，必須完全覆蓋待測標(biāo)本，將載玻片放在濕盒中置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，然后用事先配置好的PBS浸泡洗滌。干后用封閉液封片，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察，以200倍視野見到≥2個蘋果綠熒光細(xì)胞為陽性，否則為陰性。試劑盒提供的陽性對照按同樣方法處理。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率表示，組間比較采用配對四格表McNemar檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1多重RT-PCR病原體檢測結(jié)果 38例住院下呼吸道感染患兒的痰液標(biāo)本中，多重RT-PCR檢出至少一種病原體陽性36份，檢出率94.7%(36/38)，其中InfB陽性最多，為20例(52.6%)，其次檢出RSV陽性14例(36.8%)，09H1陽性8例(21.0%)，HRV陽性6例(15.8%)，PIV陽性4例(10.5%)。其中檢出2種或2種以上呼吸道病原體混合感染14份，檢出率為36.8%(14/38)，分別檢出2種呼吸道病毒混合感染12份，3種病毒混合感染2份，混合感染中最常見的病毒為InfB，占31.6%(12/38)。另有8種病原體未檢出陽性樣本。

2.2多重RT-PCR和DFA檢測結(jié)果比較 選取與DFA檢測相同的RSV、ADV、InfA、InfB、PIVⅠ、PIVⅡ、PIVⅢ 7種病毒進行比較，RT-PCR檢出陽性36份，檢出率94.7%(36/38)，DFA檢出陽性16份，檢出率42.1%(16/38)，多重RT-PCR陽性率高于DFA法陽性率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

急性下呼吸道感染是全球嬰幼兒感染性疾病發(fā)病和死亡的一個重要原因，大多數(shù)感染由呼吸道病毒引起，由于這些病毒感染的臨床表現(xiàn)和流行特點相似，因此難以用臨床癥狀和常規(guī)檢測方法進行病原鑒定區(qū)分[2]。多重RT-PCR與毛細(xì)電泳聯(lián)用技術(shù)一次性檢測13種呼吸道病原體，該平臺特異度強，靈敏度高，與熒光定量PCR檢測結(jié)果的一致率達97.5%[3]。本研究中檢出InfB最多，陽性率為52.6%(20/38)。InfB是引起流行性感冒發(fā)生和流行的主要病原體之一，近年來兒童在流感高發(fā)季節(jié)感染率呈上升趨勢[4]，所以要警惕在冬春季由于InfB引起的流感暴發(fā)流行對兒童身體健康帶來的危害。本研究檢出RSV陽性14例(36.8%)、HRV陽性6例(15.8%)，RSV感染是誘發(fā)或加重嬰幼兒哮喘的重要危險因素，HRV是引起ALRTI患兒喘息的重要病毒病原可誘發(fā)兒童哮喘急性發(fā)作[5]，兒童感染HSV與RSV引起的臨床表現(xiàn)相類似，故應(yīng)重視區(qū)分由HSV和(或)HRV感染引起的ALRTI。本研究中檢出8例(21.0%)InfA全部為09H1亞型，通過本研究可鑒別InfA的09H1和H3N2兩個亞型，為兒童流感預(yù)防接種和流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)。本研究檢出2種或2種以上呼吸道病毒混合感染14例，檢出率為 36.8%(14/38)，目前普遍認(rèn)為混合感染的流行病學(xué)特點和臨床特征與單一感染有所不同[6]，多重RT-PCR具有更廣病原譜，有助于發(fā)現(xiàn)ALRTI患兒病原體混合感染情況。本次研究受制于樣本量關(guān)系有8種病原體未能檢出，隨后將進一步研究。

DFA是目前實驗室檢測呼吸道病毒抗原的常規(guī)方法，它用熒光標(biāo)記單克隆抗體對7種呼吸道病毒抗原直接進行檢測，是一種特異性及敏感性較高的診斷呼吸道病毒感染的方法[7]。本研究中，多重RT-PCR病毒陽性檢出率顯著高于DFA(P<0.01)，與相關(guān)文獻報道相符[8]。原因可能為RT-PCR法靈敏度高于DFA，同時DFA技術(shù)手工操作易受到標(biāo)本采集的影響，導(dǎo)致檢測細(xì)胞數(shù)量不夠，影響陽性檢出率，在結(jié)果判斷上依賴技術(shù)人員的主觀判斷，也會影響結(jié)果判斷。

綜上所述，多重RT-PCR與毛細(xì)電泳聯(lián)用技術(shù)是一種快速和準(zhǔn)確的高通量分析的新型技術(shù)，可同時檢測常見的13種病原體，實驗在一個擴增管中進行一步法RT-PCR擴增，采用毛細(xì)管分離不同長度擴增產(chǎn)物得到病原體檢測結(jié)果，通過對樣品中人RNA和人DNA同時檢測進行質(zhì)量控制，整個實驗具有封閉體系，可有效防止產(chǎn)生氣溶膠，可以檢測多重感染，能為規(guī)范兒童ALRTI實驗室快速診斷和臨床治療提供有力保證。