新一代分子診斷技術(shù)在輸入性傳染病快速檢測中的應用*

趙揚陽，許 穎，常曉松

1.成都醫(yī)學院(成都 610500)；2.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 檢驗科(成都 610500)；3.四川國際旅行衛(wèi)生保健中心成都海關(guān)口岸 門診部(成都 610042)

近年來國際傳染病形勢嚴峻，嚴重威脅著全球經(jīng)濟和人類健康。輸入性傳染病病原體檢測作為衛(wèi)生檢疫防控工作中的重要一環(huán)，對于減輕傳染病風險至關(guān)重要。目前，病原體鑒定的金標準是病原體的分離培養(yǎng)，常用的檢查技術(shù)是免疫學診斷和分子診斷。傳統(tǒng)的檢測技術(shù)各有利弊，尚無法滿足當下對更快速、準確、靈敏檢測病原體技術(shù)的需要。隨著高新技術(shù)的發(fā)展和醫(yī)學科學的進步，新一代分子診斷技術(shù)成為快速檢測輸入性傳染病病原體的新趨勢。本綜述結(jié)合相關(guān)文獻，總結(jié)新一代分子診斷技術(shù)在即時診斷輸入性傳染病方面的應用，闡述其作為傳染病診斷技術(shù)的應用前景，為輸入性傳染病快速檢驗提供新的策略。

1 輸入性傳染病

1.1 我國主要輸入性傳染病

隨著經(jīng)濟全球化的推進，各國人員頻繁往來和國際間密切的貿(mào)易合作，使來自世界各地的傳染病可以輸入到中國。我國目前主要的輸入性傳染病包括呼吸道傳染病、蟲媒傳染病、消化道傳染病等[1]。

其中，輸入性呼吸道傳染病由于呼吸道與外界相通易受病原體侵襲，人群易受感染，是我國口岸確診第一位的輸入性傳染病[1]。輸入性呼吸道傳染病病原體主要包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒等。2020年新型冠狀病毒肺炎疫情爆發(fā)使其成為全球重點關(guān)注的呼吸道傳染病，目前我國新冠病毒肺炎病例以輸入性為主。輸入性蟲媒傳染病是由病媒生物傳播的自然疫源性疾病，常見的病原體如黃熱病毒、登革熱病毒、寨卡病毒、瘧原蟲、基孔肯雅病毒等，都會引起危害性較強的傳染病[2]。輸入性消化道傳染病是由感染者或攜帶者排泄物中的病原體直接或間接污染手、水或食品食具，經(jīng)口進入體內(nèi)而引起消化道感染，主要包括霍亂、腸出血性大腸桿菌感染、手足口病等[1]。

1.2 病原體的常規(guī)檢測技術(shù)

在面臨重大輸入性傳染病時，及時性和準確率是國境口岸病原體檢測最重要的考慮因素。目前，輸入性傳染病病原常規(guī)檢測方法主要采用分子診斷、免疫學診斷、病原體分離培養(yǎng)等。其中，病原體分離培養(yǎng)方法是病原體確診經(jīng)典的方法，但該方法操作復雜、耗時長，難以滿足快速檢測的需求[3]。免疫學診斷技術(shù)常用膠體金、酶聯(lián)免疫吸附實驗和化學發(fā)光等技術(shù)，具有成本低、操作簡便、檢測速度快等優(yōu)勢，但主要存在抗體陽性不能代表現(xiàn)癥感染、靈敏度低、對窗口期有要求等問題[4]。分子診斷技術(shù)是用分子生物學方法通過檢測各種病原體遺傳物質(zhì)的表達和結(jié)構(gòu)，進而實現(xiàn)對疾病的預測和診斷[5]。其中熒光定量聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)是近年來發(fā)展較為迅速的分子診斷技術(shù)，在傳染病診治中起到了重要作用，現(xiàn)已成為實驗室檢測的金標準[6]，具有準確、靈敏的特點，但成本高、操作復雜、對實驗平臺和人員要求高，導致大范圍應用難度大。目前常規(guī)的檢測技術(shù)在操作步驟、設(shè)備需求、準確性和檢測周期等方面仍存在各自的缺陷，這使得這些方法難以在疫情現(xiàn)場、口岸等場景下快速準確鑒定輸入性傳染病種類。

近年來，經(jīng)過飛速發(fā)展，新一代分子診斷技術(shù)具備了特異性高、靈敏性強、快速檢測等特點，并不斷突破現(xiàn)有檢測技術(shù)對人員、場所的限制，簡化操作步驟、提升檢測通量，能滿足在疫情現(xiàn)場、口岸等更多場景對輸入性傳染病病原體快速精準診斷的需求。

2 新一代分子診斷技術(shù)

為有效提高輸入性傳染病的檢測效率和防疫能力，快速診斷技術(shù)一直是輸入性傳染病病原體檢測方面研究的熱點。目前應用于快速診斷的分子診斷技術(shù)主要包括微流控芯片技術(shù)、恒溫擴增技術(shù)、成簇規(guī)律間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats,CRISPR)技術(shù)、納米孔測序技術(shù)等。

2.1 微流控芯片技術(shù)

微流控芯片是將生命科學應用分析的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元集合到一塊芯片上的微型化整合技術(shù)，加入少量的樣本體積即可實現(xiàn)短時間內(nèi)數(shù)個樣品的平行自動分析[7]。微流控芯片具有快速準確、操作簡便、多功能集成、高通量的特點，在輸入性傳染病檢測中獲得了大量的研究，以微流控芯片為基礎(chǔ)建立快速精準便捷的診斷技術(shù)，可實現(xiàn)即時診斷[8]。隨著微流控芯片技術(shù)的不斷發(fā)展，目前已經(jīng)誕生了紙基微流控芯片、數(shù)字微流控芯片、電泳分析微流控芯片、POC微流控芯片等多種微流控芯片[9-11]。

微流控芯片技術(shù)作為交叉學科用于檢測輸入性傳染病，對病原體檢測技術(shù)的發(fā)展有著突破性意義。目前微流控芯片在輸入性傳染病快速檢測領(lǐng)域的研發(fā)主要與其他各類技術(shù)結(jié)合，如與 PCR技術(shù)、恒溫擴增技術(shù)等，應用于檢測多種輸入性蟲媒傳染病病原體[12-14]以及輸入性消化道[15]、呼吸道傳染病病原體的多重檢測[16-17]。在多種類型的微流控芯片中，紙微流控芯片具有低成本、易攜帶和一次性使用的優(yōu)點[18]，在病原體快速檢驗的領(lǐng)域獲得了越來越廣泛的關(guān)注。Teengam等[19]研發(fā)了一種納米顆粒聚集的比色紙基微流控系統(tǒng)可用于特異性檢測中東呼吸綜合征冠狀病毒DNA，檢測限值為1.53 nM。Kaarj等[20]開發(fā)出一種基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)的紙質(zhì)微流控芯片檢測寨卡病毒，經(jīng)過68 ℃、30 min的放大反應后比色法檢測，結(jié)果通過智能手機成像進行量化，檢測限低至1個拷貝/μL，同時還可用于識別基孔肯雅病毒、登革熱病毒等其他傳染性病原體的快速鑒定。

微流控芯片相比傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)對輸入性傳染病的診斷，在各方面都有突破性的飛躍和創(chuàng)新。其主要特點是微型化、集成化和自動化，還可避免因傳統(tǒng)檢測方法功能的局限而帶來的損失與污染，縮短了檢測時間，降低了操作門檻；同時微流控芯片屬于DNA芯片，其發(fā)展拓寬了生物芯片的適用范圍，成為輸入性傳染病體外診斷未來發(fā)展依托的主要檢測平臺之一。

2.2 恒溫擴增技術(shù)

恒溫擴增是一種建立于PCR基礎(chǔ)上開發(fā)的核酸擴增手段。通過加入一些特殊設(shè)計的蛋白酶和引物，一個溫度即可完成擴增，無需反復升降溫。從20世紀90年代恒溫擴增技術(shù)被提出后，迄今為止全世界共有10多種常見的恒溫擴增技術(shù)，包括環(huán)介導恒溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、重組酶介導鏈替換核酸擴增技術(shù)(recombinase-aid amplification,RAA)、轉(zhuǎn)錄介導擴增技術(shù)(transcription mediated amplification,TMA)、酶促重組等溫擴增法(enzymatic recombinase amplification,ERA)等，其原理也不盡相同。

2.2.1 LAMP LAMP是根據(jù)序列保守區(qū)域設(shè)計引物特異性識別目標序列上的6個相應區(qū)域，在Bst聚合酶的作用下60 ℃～65 ℃恒溫內(nèi)，60 min內(nèi)大量擴增目標DNA片段，同時伴隨副產(chǎn)物白色焦磷酸鎂沉淀的產(chǎn)生[21]。LAMP具有靈敏、穩(wěn)定、快速且特異的優(yōu)點，已經(jīng)實現(xiàn)對細菌、病毒和寄生蟲等病原微生物的快速檢測，應用于輸入性傳染病的診斷[22]。目前LAMP已經(jīng)發(fā)展為普通LAMP、RT-LAMP、實時濁度定量LAMP等。

LAMP在病毒快速檢測領(lǐng)域發(fā)展迅速[23]，可對基孔肯亞病毒、登革病毒、SARS病毒和中東呼吸綜合征冠狀病毒等[24-27]多種輸入性病毒進行準確鑒定，是一種前景廣闊的快速診斷技術(shù)。近年來，基于LAMP的檢測技術(shù)向可視化發(fā)展，更利于現(xiàn)場快速診斷輸入性傳染病。Huang等[28]建立了一種結(jié)合RT-LAMP和垂直流動顯示條的可視化技術(shù)檢測中東呼吸綜合征冠狀病毒 N基因，可檢測10拷貝/μL的RNA，35 min內(nèi)快速完成檢測。此外，Xu等[29]開發(fā)了一種基于紙折紙的全血診斷瘧疾的可視化方法，試驗可在50 min內(nèi)完成，可檢測出98%的瘧疾感染者，使患者的全血樣本中檢測瘧疾成為可能。

2.2.2 RAA RAA是一種利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白、DNA聚合酶在39 ℃恒溫條件下完成擴增的技術(shù)[30]，具有反應快速、操作簡單等特點，RAA和進一步發(fā)展的逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導檢測方法(reverse transcription-recombinase-aid amplification, RT-RAA)目前已應用于輸入性傳染病的檢測。陳淑丹等[31]利用RAA技術(shù)建立了快速檢測呼吸道腺病毒的方法，用不同拷貝數(shù)hexon基因片段的重組質(zhì)粒進行RAA擴增，在20 min內(nèi)即可得到擴增結(jié)果，最低檢測限為10拷貝/μL，特異性高。此外，Yan等[32]通過RT-RAA檢測柯薩奇病毒A6 和柯薩奇病毒A10，30 min內(nèi)完成擴增，成本低且分析靈敏度遠高于商業(yè)RT-PCR[32]。

相比于常用的PCR技術(shù)，恒溫擴增技術(shù)只需要一個溫度即可完成擴增反應，縮短了核酸擴增的時間，并具備靈敏特異、操作簡便、不需昂貴儀器的優(yōu)勢，能夠?qū)崿F(xiàn)實時檢測。隨著分子診斷技術(shù)的不斷進步，恒溫擴增技術(shù)與微流控芯片技術(shù)的結(jié)合使用將使各個反應模塊實現(xiàn)封閉化，解決交叉污染的問題，全自動化、全集成的檢驗操作正逐步實現(xiàn)，使得操作流程更加簡易。

2.3 CRISPR技術(shù)

CRISPR及其相關(guān)基因(CRISPR associated gene,CRISPR/Cas)系統(tǒng)能在向?qū)NA指引下，通過一種CRISPR相關(guān)酶(Cas)裂解目標DNA或RNA[33]。CRISPR系統(tǒng)具有穩(wěn)定、快速、準確、靈敏的特點，可作為檢測病原體的核酸和生物標志物超靈敏方法，目前已用于開發(fā)輸入性傳染病的快速分子診斷試劑盒。常用于分子診斷的Cas酶包括Cas9、Cas12、Cas13和Cas14，這些酶具有高特異性和附帶活性，目前在基于不同Cas酶的CRISPR檢測平臺中最具代表性的是SHERLOCK和DETECR[34]。

2.3.1 SHERLOCK SHERLOCK平臺由張峰研究組開發(fā)基于Cas13的核酸檢測。在RNA底物逆轉(zhuǎn)錄之后，恒溫擴增后的模板在體外使用T7轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生的模板被Cas13-向?qū)NA復合物識別并切割，Cas13輔助活性會使熒光標記物降解，隨后通過檢測熒光而指示目標的存在[35]。SHERLOCK適用于RNA病毒的快速檢測，許多常見或致命的輸入性傳染病病原體都是RNA病毒，SHERLOCK已應用于快速靈敏檢測患者樣本中的寨卡病毒、登革熱病毒和黃熱病毒等[35-36]。2020年Joung等[37]報道了基于SHERLOCK的新冠病毒檢測技術(shù)STOPCovid.V2的流程，檢驗結(jié)果能夠達到93.1%的靈敏度和98.5%的特異性，陽性樣本只需15～45 min就能獲得結(jié)果。

2.3.2 DETECR DETECR是由Jennifer團隊開發(fā)的檢測平臺，其工作原理與SHERLOCK相似，不同之處在于使用Cas12a通過向?qū)NA靶向特定的DNA序列，將單鏈DNA-熒光淬滅基團加入反應中，在單鏈DNA降解時產(chǎn)生信號，適用于任何基于DNA檢測的快速診斷[38]，在對新冠病毒檢測的應用研究[39]顯示，基于DETECR平臺整個病毒檢測過程可在1 h內(nèi)完成。

CRISPR/Cas檢測平臺具有快速、靈敏特異、易構(gòu)建、便攜性等特點。CRISPR/Cas系統(tǒng)與恒溫擴增、免疫層析等其他技術(shù)相結(jié)合可建立更加便捷的快速診斷方法，在輸入性傳染病病原體快速檢測中有著開闊的發(fā)展前景。

2.4 納米孔測序技術(shù)

第三代測序技術(shù)是以單分子測序及納米孔測序為代表，其中納米孔測序技術(shù)是基于電信號的測序技術(shù)，通過電流信號的特征性改變，來確定正在通過該孔的DNA或RNA的堿基序列。納米孔測序能夠邊解鏈邊測序，具有便攜化、長片段讀長、小型化、易集成、時效性強等優(yōu)勢，目前在輸入性傳染病病原體檢測應用中已有大量研究，納米孔測序技術(shù)也被公認為是未來測序發(fā)展的一大方向[40]。

目前已經(jīng)商業(yè)化推廣的納米孔測序方案不多，2014年第一個商品化的便攜式納米孔測序儀MinION發(fā)布，標志著納米孔測序正式進入基因測序技術(shù)[41]。MinION作為第三代測序的代表平臺之一，憑借快速測速和方便攜帶，能夠?qū)崟r分析DNA或RNA序列，在傳染病、臨床微生物和宏基因組學等研究中具有廣闊前景[42-44]。Hoenen等[45]通過評估在西非埃博拉病毒爆發(fā)條件下MinION的可行性，證明其作為快速檢測工具的潛力。新冠疫情爆發(fā)后，武漢大學團隊研發(fā)的納米孔靶向測序技術(shù)，通過檢測出不同病毒的序列，實現(xiàn)了4 h內(nèi)同時準確檢測新冠病毒及其他十大類呼吸道病毒，還可同時對檢測病毒突變情況進行分型[46]。

納米孔測序技術(shù)的優(yōu)勢使現(xiàn)場基因測序成為可能。其能夠提供動態(tài)、實時的測序，支持在短時間內(nèi)同時獲得不同病原體鑒定及分型，其快速采樣到出結(jié)果周轉(zhuǎn)時間短，未來在輸入性傳染病、實地動態(tài)監(jiān)測疫情暴發(fā)以及其他診斷方面都具有巨大潛力。

3 應用前景與局限

快速鑒定病原體是有效實施輸入性傳染病防控策略的關(guān)鍵。當前輸入性傳染病快速診斷的主要困擾包括靈敏度、成本以及設(shè)備和熟練技術(shù)人員的需求。傳統(tǒng)的分子診斷要求具備生物安全二級及以上實驗室條件及相應的個人防護，對應用場景有較高要求，限制了應用推廣。同時傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)的樣本周轉(zhuǎn)時間較長，在輸入性傳染病集中爆發(fā)期有較大局限性。而新一代分子診斷技術(shù)可克服上述缺陷，結(jié)合納米孔測序技術(shù)、微流控技術(shù)和設(shè)備制造等多學科交叉技術(shù)，為快速精準診斷平臺的成功開辟了新的前景。在擁有準確性的前提下，可突破實驗室條件限制，凸顯便捷、高效、低培訓成本、可同時排查多種輸入性傳染病的優(yōu)勢，使其能應用于疫情現(xiàn)場、口岸等場景下對輸入性傳染病的快速檢驗。目前輸入性傳染病快速分子診斷技術(shù)尚在不斷改進中，但依然存在尚未滿足經(jīng)濟實惠的要求、檢驗質(zhì)量控制缺乏規(guī)范和標準、臨床管理不夠完善等實際問題，需要進一步研發(fā)與應用評價。

4 展望

新一代分子診斷技術(shù)的應用，對輸入性傳染病快速診斷、臨床實驗室的應用乃至社會傳染病的高效防控等帶來重大機遇。隨著科學技術(shù)的進步及多學科的融合交叉，更多先進的快速檢驗技術(shù)將進入輸入性傳染病檢測的應用階段。但同時需要意識到，分子診斷技術(shù)對病原體的檢測在質(zhì)量控制和臨床管理方面仍存在諸多挑戰(zhàn)，未來需要建立更多的應用科學研究、衛(wèi)生經(jīng)濟學評價及相適應的質(zhì)量體系等，支撐分子診斷在輸入性傳染病領(lǐng)域的持續(xù)性創(chuàng)新發(fā)展。