sCCR5：一種潛在的HIV拮抗劑

曾張琴 綜述，董家書 審校

廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西柳州 545005

由人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，即艾滋病，在全球范圍內(nèi)廣泛流行，是一種至今尚無有效療法的致命性傳染病。現(xiàn)有的抗病毒藥物雖然在某種程度上可以緩解病情，但AIDS的治療問題還是沒有解決：藥物本身的毒性作用與昂貴價(jià)格，長(zhǎng)期用藥導(dǎo)致的耐藥病毒株，整合到宿主基因組中的病毒基因等[1-2]。針對(duì)傳統(tǒng)藥物的上述弊端，尋找新的治療靶點(diǎn)成為HIV藥物研究的重要方向[3]。

1 HIV侵染機(jī)制

HIV可分為HIV-1和HIV-2兩種亞型，其中HIV-1致病性強(qiáng)，是引起AIDS的主要病原體。HIV-1感染機(jī)體免疫細(xì)胞除了需要CD4受體外，還需要CC趨化因子受體5(CCR5)或CXC趨化因子受體4(CXCR4)作為輔助受體。HIV侵染機(jī)體細(xì)胞主要包括3個(gè)步驟[4]：病毒包膜糖蛋白gp120與細(xì)胞表面蛋白受體CD4結(jié)合，病毒吸附在細(xì)胞表面；隨后病毒gp120再與細(xì)胞表面輔助受體CCR5或CXCR4結(jié)合，病毒的第2個(gè)包膜蛋白gp41暴露出來；最后，病毒的gp41構(gòu)象發(fā)生一系列改變，其N末端片段插入細(xì)胞膜，導(dǎo)致病毒包膜與細(xì)胞膜發(fā)生融合，病毒內(nèi)容物RNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。HIV-1通過何種途徑感染細(xì)胞決定于病毒的嗜性。T細(xì)胞嗜性的病毒株主要通過CXCR4感染細(xì)胞，稱為X4嗜性；單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞嗜性的病毒株主要通過CCR5感染機(jī)體細(xì)胞，稱為R5嗜性；而R5/X4嗜性的病毒既可以通過CCR5也可以通過CXCR4感染細(xì)胞。此外，在感染的不同階段，病毒利用的輔助受體也有所不同。一般在感染早期階段，病毒主要通過CCR5感染機(jī)體細(xì)胞，隨著病程延長(zhǎng)，HIV-1由R5嗜性逐漸向R5/X4雙嗜性轉(zhuǎn)變，感染晚期以X4嗜性病毒株占主導(dǎo)，而單一的CXCR4途徑一般不會(huì)導(dǎo)致機(jī)體感染[5]。

2 CCR5的分子機(jī)制

2.1CCR5簡(jiǎn)介 趨化因子是一類具有趨化活性的小分子細(xì)胞因子，它能募集細(xì)胞表面具有G蛋白耦聯(lián)受體的細(xì)胞聚集在一起，參與機(jī)體免疫平衡作用。迄今發(fā)現(xiàn)的趨化因子家族共有50多種成分，根據(jù)其N-末端2個(gè)半胱氨酸殘基位置的不同可分為4大類：CXC(或α)、CC(或β)、C(或γ)和CXC3C(或δ)。CCR5是CC亞族趨化因子(RANTES、MIP-α和MIP-β)的受體，主要表達(dá)在記憶性T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及未成熟的樹突狀細(xì)胞等細(xì)胞膜上，其表達(dá)量可被促炎癥因子上調(diào)[6]，具有調(diào)控T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞遷移、增殖及免疫反應(yīng)的功能。CCR5基因位于人3q21.3上，其mRNA長(zhǎng)約3.6 Kb，共編碼352個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為40.6×103。CCR5具有G蛋白耦聯(lián)受體家族所特有的呈α螺旋的7個(gè)跨膜區(qū)(TM),在結(jié)構(gòu)上包括以下幾個(gè)部分：胞外N-末端、3個(gè)胞外環(huán)(ECL1-3)、3個(gè)胞內(nèi)環(huán)、7個(gè)跨膜α螺旋及胞內(nèi)C-末端?？缒^(qū)的氨基酸具有高度保守性，ECL1和ECL2以二硫鍵相連，以維持蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，其N-末端和ECL2對(duì)于CCR5與HIV的gp120結(jié)合起著關(guān)鍵的作用，目前研發(fā)的很多CCR5拮抗劑都是針對(duì)上述幾個(gè)位點(diǎn)[7-10]。

對(duì)CCR5研究發(fā)現(xiàn)，其基因發(fā)生多個(gè)突變的個(gè)體能有效抵抗HIV的感染，其中以編碼區(qū)CCR5Δ32研究最為廣泛[11-13]。CCR5Δ32是指CCR5基因編碼區(qū)的32個(gè)堿基發(fā)生缺失突變，即在CCR5等位基因編碼第185個(gè)氨基酸密碼子后的32個(gè)堿基發(fā)生缺失，導(dǎo)致讀碼框架錯(cuò)位，ECL3結(jié)構(gòu)缺失，CCR5結(jié)構(gòu)不完整而喪失其輔助受體功能，因此，HIV無法通過gp120與CCR5結(jié)合侵襲細(xì)胞。CCR5Δ32是在歐洲人群中比較常見，而在黑種人、日本人和中國人中卻很少發(fā)現(xiàn)這種缺失突變型[11]。其突變包括CCR5Δ32/CCR5Δ32純合子型和CCR5/CCR5Δ32雜合子型，其中純合子只占小部分，絕大部分是雜合子型。純合子基因型對(duì)HIV感染有高度抵抗性，但也并非是絕對(duì)的；而雜合子基因型人群感染率也比一般人群低35%，其AIDS發(fā)病也較緩慢，一般可延長(zhǎng)2～4年。并且CCR5突變?nèi)笔蛽碛姓Ｃ庖吖δ芎脱仔苑磻?yīng)，因此，關(guān)于CCR5位點(diǎn)的拮抗劑成為目前HIV藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。

2.2CCR5拮抗劑 傳統(tǒng)的抗HIV-1藥物主要為反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，主要通過和底物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶或者與酶分子結(jié)合使其變性，進(jìn)而破壞HIV-1的生活周期，從而達(dá)到抑制病毒復(fù)制的作用。這種藥物雖然在一定程度上推遲了病情的惡化，但同時(shí)也產(chǎn)生一些問題，如長(zhǎng)期用藥導(dǎo)致病毒耐藥性的產(chǎn)生、昂貴的藥物價(jià)格、藥物的不良反應(yīng)等。因此，迫切需要研發(fā)新的、與以往藥理機(jī)制不同的抗HIV-1藥物[2]。目前，關(guān)于CCR5拮抗劑的藥物研究成為研究者們關(guān)注的熱點(diǎn)。總的來說，以CCR5為靶點(diǎn)的HIV-1受體拮抗劑主要包括以下幾大類:趨化因子衍生物、非肽類小分子化合物、單克隆抗體及肽類化合物等。

2.2.1CC類趨化因子 CC類趨化因子(如RANTES、MIP-α和MIP-β)作為CCR5的天然配體是HIV-1受體的天然拮抗劑，其作用機(jī)制主要是誘導(dǎo)CCR5內(nèi)吞作用。雖然低水平CC趨化因子在一定程度上可以保護(hù)細(xì)胞抵抗HIV-1感染，但由于天然趨化因子半衰期短，同時(shí)能誘導(dǎo)炎性反應(yīng)等缺陷而不適合臨床應(yīng)用[14]。與之相比，趨化因子衍生物不激活信號(hào)通路，通過誘導(dǎo)CCR5內(nèi)吞而減少HIV-1與受體結(jié)合，因此更具優(yōu)越性，其中主要以AOP-RANTER、重組人趨化因子CCL14(HCC-1)和vMIP-Ⅱ等為代表。AOP-RANTER是將AOP基團(tuán)耦聯(lián)到RANTES氨基末端而產(chǎn)生的強(qiáng)CCR5拮抗劑。它可誘導(dǎo)細(xì)胞膜表面的CCR5不可逆的被內(nèi)吞，減少R5型HIV-1 gp120與CCR5結(jié)合，從而抑制病毒感染，并且AOP-RANTES不會(huì)產(chǎn)生趨化作用而引起相關(guān)不良反應(yīng)。HCC-1的蛋白水解產(chǎn)物通過促進(jìn)細(xì)胞Ca2+釋放和CCR5內(nèi)吞作用，能使細(xì)胞膜上的CCR5表達(dá)量減少75%，具有較強(qiáng)的CCR5拮抗作用。vMIP-Ⅱ是由人單純皰疹病毒8編碼的趨化因子，能與大量CC類和CXC類細(xì)胞因子受體高親和力結(jié)合，能同時(shí)抑制由CCR5和CXCR4介導(dǎo)的HIV-1入侵，此類大分子拮抗劑主要由于生產(chǎn)成本高、口服利用度差等缺點(diǎn)而限制了其發(fā)展。

2.2.2非肽類小分子化合物 非肽類小分子化合物主要通過與跨膜區(qū)的關(guān)鍵氨基酸殘基組成的袋狀結(jié)構(gòu)結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)ECL2發(fā)生構(gòu)象改變，使HIV-1 gp120無法與CCR5結(jié)合，從而阻斷了HIV-1侵襲細(xì)胞[15-16]。目前，研究的小分子化合物主要包括吡咯烷類化合物、托品烷類化合物、哌啶類化合物、螺環(huán)二酮哌嗪類化合物等。TAK-220是吡咯烷類化合物，其作用于CCR5跨膜α螺旋4、5、6，選擇性抑制RANTES和MIP-α與CCR5結(jié)合，不抑制MIP-β與CCR5作用，其口服生物利用度較好，與其他抗HIV-1藥物一起使用具有協(xié)同作用，具有較強(qiáng)的抗高耐藥性活性。SCH-C是小分子肟哌啶類化合物，也是第一個(gè)進(jìn)入臨床使用的小分子CCR5拮抗劑，它與CCR5的1、2、3、7跨膜區(qū)結(jié)合，從而改變CCR5胞外區(qū)的構(gòu)象，可以有效地抑制R5型病毒株在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。對(duì)這類小分子化合物增加或修飾某些基團(tuán)能明顯增強(qiáng)其抑制病毒作用和藥物吸收率。由于小分子化合物的生產(chǎn)成本較小分子蛋白少，能有效抑制HIV-1感染，同時(shí)不引起炎性反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，目前這類藥物在CCR5拮抗劑研究中占主導(dǎo)地位，但小分子化合物不能下調(diào)細(xì)胞表面CCR5的表達(dá)，口服或注射藥物后易出現(xiàn)頭暈、嘔吐等不良反應(yīng)[17]，同時(shí)其藥效作用也受細(xì)胞類型和細(xì)胞表面CCR5水平的影響。

2.2.3單克隆抗體 CCR5的胞外結(jié)構(gòu)包括N-末端和ECL1-3，理論上可以為單克隆抗體提供多個(gè)抗原表位識(shí)別位點(diǎn)，但目前報(bào)道有效的單克隆抗體并不多，僅有PRO140、mAb004等幾種[18]。根據(jù)識(shí)別位點(diǎn)的不同，可將單克隆抗體分為以下3類：第1類，識(shí)別CCR5的N-末端；第2類，識(shí)別ECL2；第3類，識(shí)別CCR5多個(gè)胞外位點(diǎn)。其中，第二類單克隆抗體抑制病毒感染細(xì)胞的功效最強(qiáng)。雖然單克隆抗體具有高度靶向?qū)Ｒ恍浴胨テ谳^長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，但由于它容易誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗抗體、引起過敏反應(yīng)、不能下調(diào)細(xì)胞表面CCR5表達(dá)等缺陷，因此極大地限制了其發(fā)展。

2.2.4CCR5肽類拮抗劑 CCR5肽類拮抗劑與單克隆抗體相似，主要通過與CCR5胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合而產(chǎn)生抑制病毒感染作用，但它不同于小分子拮抗劑產(chǎn)生的毒性作用，安全性較好。目前主要通過噬菌體肽庫篩選技術(shù)篩選出與靶蛋白特異性結(jié)合且具有高度親和力的多肽[19]。其具有制備成本低，制備的多肽活性高、組織穿透性較好、不易誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。但由于多肽本身在體內(nèi)不穩(wěn)定，容易被機(jī)體消化降解。

2.3sCCR5拮抗HIV-1感染的推測(cè) 盡管上述4種CCR5拮抗劑都可有效抑制HIV-1感染，遏制AIDS的流行，但各自都有其缺陷，且由于其作用機(jī)制和作用位點(diǎn)較為單一，因此容易導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生。近年來，研究者在人血清中檢測(cè)到一種sCCR5蛋白分子的存在，其相對(duì)分子質(zhì)量約為22.0×103，大概是膜表面CCR5蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的一半。針對(duì)膜受體特征性結(jié)構(gòu)的一系列單克隆抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，sCCR5蛋白包含N-末端、ECL1、ECL2及ECL2近C-末端尾部等結(jié)構(gòu)，且在血清中的濃度與血清中CCR5配體MIP-β濃度呈正相關(guān)[20]。通過提取PBMCs的RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)和核酸測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物為單一的cDNA，且核苷酸序列與之前公布的CRR5 cDNA序列完全一致，因此推測(cè)出機(jī)體內(nèi)并不存在表達(dá)sCCR5的單獨(dú)DNA，sCCR5同樣來源于體內(nèi)CCR5的編碼序列，可能是膜CCR5在第5跨膜區(qū)的裂解產(chǎn)物[20]。DOI等[21]通過對(duì)合成的ECL2近C-末端的一段多肽檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其在有無CD4分子的情況下均能抑制R5和X4 HIV-1感染。與作用于單一位點(diǎn)的CCR5拮抗劑相比，sCCR5具有多個(gè)抗HIV-1感染結(jié)構(gòu)(N-末端、ECL2及ECL2近C-末端尾部結(jié)構(gòu))，由于sCCR5是天然存在于人血清中的蛋白質(zhì)分子，因此具有半衰期較長(zhǎng)、毒性作用小、不易誘發(fā)機(jī)體不良反應(yīng)及中和抗體等優(yōu)點(diǎn)。

sCCR5潛在的功能目前尚不明確，推測(cè)sCCR5可通過以下幾個(gè)方面拮抗HIV-1感染：其一，sCCR5可通過與膜表面CCR5分子競(jìng)爭(zhēng)HIV-1 gp120來抑制HIV-1感染作用。由于sCCR5包含N-末端、ECL2及ECL2近C-末端尾部結(jié)構(gòu)，因此具有與gp120結(jié)合的多個(gè)位點(diǎn)，可在gp120與CCR5作用的多個(gè)步驟中與gp120結(jié)合，引起其構(gòu)象發(fā)生改變，阻斷病毒包膜與細(xì)胞膜發(fā)生融合，使病毒的核酸物質(zhì)無法進(jìn)入細(xì)胞。其二，sCCR5可通過阻斷膜表面CD4分子來抑制HIV-1感染機(jī)體細(xì)胞。KIM等[22]發(fā)現(xiàn)，無論gp120存在與否，裂解的膜表面CCR5均可與CD4分子形成復(fù)合物，且這種sCCR5和CD4在水平極低的情況下，復(fù)合物依然可形成。其三，sCCR5可間接通過CC類趨化因子來抑制HIV-1感染。由于血清中sCCR5與CC趨化因子存在正相關(guān)關(guān)系，推測(cè)二者可能存在促進(jìn)對(duì)方表達(dá)分泌機(jī)制。如前所述，CC類趨化因子具有抑制HIV-1感染效應(yīng)，其作用機(jī)制主要包括2個(gè)方面:一方面，CC趨化因子作為CCR5的天然配體，可以與gp120競(jìng)爭(zhēng)膜表面CCR5分子；另一方面，趨化因子還具有誘導(dǎo)CCR5內(nèi)吞作用，通過減少細(xì)胞膜上CCR5的數(shù)量從而達(dá)到抑制HIV-1感染作用。

3 小 結(jié)

綜上所述，sCCR5由于具有多個(gè)gp120結(jié)合位點(diǎn)及多條途徑拮抗HIV感染，且作為天然存在于人血清中的蛋白分子，具備安全性好、半衰期較長(zhǎng)、不易誘發(fā)中和抗體及不良反應(yīng)等特點(diǎn)，因此是一種新穎的、理想的HIV-1拮抗劑。針對(duì)目前HIV-1流行的嚴(yán)重性和致命性，可用藥物的單一性及耐藥現(xiàn)象的普遍性等現(xiàn)狀，研制sCCR5并明確其作用機(jī)制對(duì)于HIV-1的預(yù)防和治療具有重要意義。