cfDNA 含量測定在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥中的應(yīng)用

凌寅杰，陳冬嬋，鮑婷婷，潘皆慰，袁琛

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（ICP）是一種妊娠期內(nèi)較為常見的并發(fā)癥，極易導(dǎo)致早產(chǎn)、宮內(nèi)窘迫，增加圍產(chǎn)兒的死亡率，同時對孕婦的健康造成一定的損害[1]。近年來研究表明，患有ICP 的孕婦外周血及其新生兒臍血膽汁酸水平明顯升高，膽汁酸的毒性作用會影響胎兒心臟功能[2]，還會導(dǎo)致胎兒胰腺內(nèi)分泌功能的異常。外周血游離DNA（cfDNA）的相關(guān)檢測在產(chǎn)前診斷和腫瘤研究中已經(jīng)取得了很多研究進(jìn)展[3]，而對于cfDNA和ICP及新生兒血清總膽酸（TBA）、膽汁酸（CA）之間的關(guān)系的研究尚未有報道。本研究探討cfDNA 含量與ICP 的關(guān)系，同時對于孕婦外周血cfDNA 含量與新生兒TBA、CA 濃度的相關(guān)性進(jìn)行分析，為臨床診斷及預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014 年7 月至2019 年6 月浙江省湖州市婦幼保健院收治的妊娠期膽汁淤積癥（ICP）377 例為研究組，另選取同期正常孕婦105 例作為對照。研究組均符合《妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥診療指南（2015）》[4]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，年齡20 ～42 歲，平均（28.8±1.3）歲；孕周30 ～40 周；其中初產(chǎn)婦204例，經(jīng)產(chǎn)婦173 例。對照組年齡19 ～39 歲，平均（27.5±1.5）歲；孕周31 ～41 周；其中初產(chǎn)婦61 例，經(jīng)產(chǎn)婦44 例。兩組一般資料差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05），入選孕婦及家屬均簽署了知情同意書，本研究經(jīng)湖州市第一人民醫(yī)院及湖州市婦保院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 TBA、CA水平檢測 孕婦臨產(chǎn)后于清晨空腹采靜脈血1ml，胎兒娩出后采臍動脈血1ml。及時離心分離血清（2500 r/min，5min），利用HXD02 貝克曼A全自動生化分析儀測定血清TBA和CA水平。

1.2.2 cfDNA濃度及完整性檢測 孕婦臨產(chǎn)后抽取肘靜脈血1 ml，胎兒娩出后采臍動脈血1 ml，將所采外周靜脈血置于EDTA 管中，離心（2 500 r/min，5 min）后取血清，利用FirePure Circulating Free DNA Mini Kit 試劑盒（蘇州）提取cfDNA，每個標(biāo)本最終洗脫體積為50 l。提取的DNA 經(jīng)NanoDrop ND-1000 核酸定量儀測定吸光度（A260/A280），取比值為1.6 ～1.8 的樣本并對各樣本濃度進(jìn)行測定。cfDNA 完整性檢測采用RT-PCR 技術(shù)測定血漿ALU115 基因（115bp）和ALU247 基因（247bp）濃度，以ALU115/ALU247 表示cfDNA 的完整性。ALU247 及ALU115 引物設(shè)計、合成及RT-PCR 方法見參考文獻(xiàn)[5]。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 檢驗；相關(guān)系數(shù)利用Correl 方程[6]計算。＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦和新生兒血清TBA、CA水平比較 研究組孕婦血清TBA、CA水平均高于對照組（均＜0.05）。研究組新生兒臍靜脈血TBA、CA 高于對照組（均＜0.05）。見表1 ～2。

表1 兩組孕婦血清TBA、CA 濃度檢測 mol/L

表2 兩組胎兒臍靜脈血TBA、CA 濃度檢測 mol/L

2.2 兩組孕婦、新生兒cfDNA 水平 兩組孕婦cfDNA完整度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（≤1.549，均＞0.05）；兩組新生兒臍靜脈血cfDNA 完整度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（≥2.766，均＜0.05）。研究組孕婦cfDNA 含量（33.14±5.07）ng/ml，新生兒的cfDNA含量（30.15±4.20）ng/ml；對照組孕婦cfDNA含量（18.54±3.05）ng/ml，新生兒的cfDNA 含量（15.00±2.18）ng/ml。研究組產(chǎn)婦、新生兒cfDNA含量均高于對照組（=4.456、3.045，均＜0.05）。見表3。

表3 各組血漿cfDNA 完整度比較

2.3 孕婦cfDNA水平與新生兒TBA和CA 濃度之間的相關(guān)性 研究組孕婦cfDNA 水平與新生兒TBA 濃度與新生兒CA 濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系（=0.9805、0.9926，均＜0.05）。

3 討論

ICP在我國較為高發(fā)，已被認(rèn)為屬于高危妊娠，臨床醫(yī)生可以通過孕期檢查及時診斷、孕期密切監(jiān)護(hù)患者及胎兒宮內(nèi)情況、積極保肝治療及適時終止妊娠等方式降低ICP 患者的并發(fā)癥，降低圍產(chǎn)兒病死率[7]。ICP 臨床表現(xiàn)為血清TBA、CA增高，可達(dá)數(shù)倍甚至數(shù)10 倍[8]。CA的淤積會導(dǎo)致胎兒心肌損傷、心功能異常，而TBA 的升高會影響胎兒胰腺分泌功能變化，影響胎兒的生長發(fā)育[9]。本研究結(jié)果顯示ICP孕婦血清TBA、CA水平明顯高于正常孕婦，CA 增高達(dá)20 倍以上，研究組新生兒TBA、CA 水平也顯著增高。這證明母體發(fā)生ICP 可使胎兒發(fā)生高膽汁酸血癥。但目前臨床仍對ICP的發(fā)病機(jī)制不甚明了，可能由環(huán)境因素、多胎妊娠、營養(yǎng)狀態(tài)、免疫功能狀態(tài)以及遺傳代謝等多因素作用導(dǎo)致[10]。

cfDNA 檢測在疾病的監(jiān)控、胎兒的產(chǎn)前診斷及腫瘤的研究中已經(jīng)有了很多應(yīng)用，但是其含量測定與ICP 的關(guān)系研究甚少。本研究結(jié)果顯示研究組孕婦和新生兒臍靜脈血cfDNA 含量較對照組顯著升高，且研究組孕婦外周血cfDNA含量與新生兒TBA、CA 存在正相關(guān)。這提示ICP 患者的cfDNA 水平升高可能是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和新生兒膽汁淤積的一個重要原因。由于cfDNA 的產(chǎn)生來源于細(xì)胞凋亡，故推測ICP 的機(jī)制是否和妊娠期細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。目前研究表明，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的異常凋亡可能與ICP 的發(fā)生及病程的進(jìn)展密切相關(guān)[11]。這也從間接證明本研究的正確性。但直接的證據(jù)需要侵入性的操作獲得，這就限制了進(jìn)一步的臨床研究。今后的研究方向更需進(jìn)一步觀察cfDNA 水平的異常和孕婦病情及新生兒健康程度的相關(guān)性。

綜上所述，ICP對母嬰特別是對胎兒危害極大，若處理不及時會導(dǎo)致新生兒并發(fā)癥、甚至病死。因此，臨床應(yīng)早期診斷、早期處理，以達(dá)到緩解瘙癢癥狀、恢復(fù)肝功能、降低膽汁酸水平、降低cfDNA含量，同時要注意胎兒宮內(nèi)的監(jiān)護(hù)，及時發(fā)現(xiàn)胎兒異常癥狀并采取相關(guān)措施，以改善妊娠結(jié)局。