夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法與PCR 法對(duì)檢測(cè)牛I 型皰疹病毒結(jié)果的比較研究

張光磊，魏田田，高 月，梁云坤

吉林省敦化市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局畜牧站，吉林敦化 133700

牛I 型皰疹病毒是在α-皰疹病毒亞科中水痘類病毒的成員，屬于皰疹病毒科家族。該病毒發(fā)病伴隨多種臨床表現(xiàn),包括：牛傳染性鼻氣管炎、外陰道炎、龜頭包皮炎、流產(chǎn)、結(jié)膜炎以及普通性的全身感染。最主要的經(jīng)濟(jì)影響是在妊娠后半段牛傳染性氣管炎流產(chǎn)所產(chǎn)生的損失，并且常常沒(méi)有任何其他的臨床征兆。BHV-1 病毒可潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)的感覺(jué)神經(jīng)元中，主要感染源是鼻腔滲出物和飛沫、生殖分泌物、精子以及肽液。BHV-1 病毒感染主要通過(guò)PCR 分離病毒和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行診斷，常用血清中和檢測(cè)法進(jìn)行試驗(yàn)，但該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力缺乏敏感性。在本研究中，我們論述了夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)檢測(cè)牛I 型皰疹病毒的結(jié)果，使之能夠簡(jiǎn)單、快速、有效地檢測(cè)出BHV-1 病毒感染。

1 材料與方法

1.1 病毒和細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2 病毒濃度和純度測(cè)定。

1.3 兔和豚鼠抗體血清的制備。

1.4 ELISA 檢測(cè)。

1.5 抗體最佳稀釋濃度的測(cè)定。

1.6 過(guò)氧化物結(jié)合物最佳稀釋濃度測(cè)定。

2 結(jié)果

最佳抗體稀釋濃度用滴定盤確定，兔抗血清在稀釋比例為1:1 000、1:2 000、1:4 000 時(shí)，吸光度（A490）要高于同稀釋比例豚鼠的檢測(cè)抗體血清（高于1.5）；而在兔和豚鼠抗體中更高的稀釋比例（1:8 000,1:16 000，1:64 000.1:128 000）顯示吸光度（A490）顯著下降至1.5 以下，抗體稀釋濃度比例為1:128 000 時(shí)，吸光度值甚至低于0.1。因此，在ELISA 準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)前用1:4 000 稀釋比例為最佳稀釋濃度。

通過(guò)對(duì)比PCR 檢測(cè)結(jié)果來(lái)測(cè)定該方法的臨界點(diǎn)，用共95 個(gè)檢測(cè)樣本，58 個(gè)PCR 陰性樣本作為陰性標(biāo)準(zhǔn)。臨界值算法用PCR 陰性樣本的OD 值加三倍標(biāo)準(zhǔn)差。因此，陽(yáng)性反應(yīng)的臨界值確定為0.143，約為0.15。陰性樣本中陽(yáng)性與陰性的比值為1.3。

表1 Sandwich ELISA 法與PCR 法檢測(cè)BHV-1 病毒結(jié)果的比較

通過(guò)PCR 法和ELISA 法檢測(cè)95 個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本，在37 個(gè)PCR 陽(yáng)性樣本中采取ELISA 法檢測(cè)出3個(gè)陰性樣本；在58 個(gè)PCR 陰性樣本中用ELISA法檢測(cè)出4 個(gè)陽(yáng)性樣本。敏感性：（34/34+3）×100%=91.9%；特異性：(54/4+54)×100%=93.1%。

3 討論

本研究的目的在于探討夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法能否檢測(cè)牛BHV-1 病毒。在任何一種新型ELISA系統(tǒng)里，最佳實(shí)驗(yàn)條件是通過(guò)不同參數(shù)的變化來(lái)確定的。兔以及豚鼠的抗血清是通過(guò)密度梯度離心純化的BHV-1 病毒收集的，如果顛倒順序就會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合物的產(chǎn)生。在一些通過(guò)采取高純度的IgG 分泌物獲得的抗血清在一些實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出無(wú)特異性，可能是因?yàn)檠逯蠭gG 的片段里參雜了一些未被排除的IgM 片段，從而使實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。