黑松松針多糖的復(fù)合酶法提取及其抑菌性研究

謝 瑋 ，郭宗明 ，葛勝菊 ，肖 川 ，陳 靜

（1.煙臺(tái)南山學(xué)院健康學(xué)院，山東 煙臺(tái) 265713；2.煙臺(tái)南山學(xué)院工學(xué)院，山東 煙臺(tái) 265713）

黑松是我國(guó)重要的景觀造林植物之一，松針是松科植物的針葉，是松樹(shù)重要的副產(chǎn)物之一，富含多種活性成分，如黃酮、木脂素、莽草酸、揮發(fā)油、多糖等[1]。松針的食用、藥用價(jià)值歷史悠久。徐瑞等[2]研究證實(shí)，在飼料中添加2%松針?lè)鄣攘刻娲熎せ蛑苯犹砑?%松針?lè)劬刑岣呱i生長(zhǎng)性能、降低咳嗽發(fā)生、提高機(jī)體免疫的效果。周思杰等[3]采用超聲波酶法優(yōu)化雪松松針多糖的提取工藝，并證實(shí)提取的松針粗多糖有較好的抗氧化性。將松針中的生物活性成分進(jìn)行提取后再添加到飼料中，有利于提高禽畜飼料轉(zhuǎn)化率，改善動(dòng)物的免疫機(jī)能，提高經(jīng)濟(jì)效益。目前，松針多糖的提取工藝有水提法、酸提法、堿提法、超聲法、微波法等[4-5]。本文采用分步加酶法研究復(fù)合酶法提取黑松松針多糖的工藝，并與同步加酶法進(jìn)行比較，優(yōu)化提取工藝，以期為提取黑松松針多糖的工藝優(yōu)化提供一定的參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

黑松松針，采自煙臺(tái)南山學(xué)院東海校區(qū)。纖維素酶，酶活力≥105U/mg，購(gòu)于和氏璧生物工程有限公司；果膠酶，酶活力≥2×104U/mg，購(gòu)于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；石油醚、無(wú)水乙醇、檸檬酸、磷酸二氫鈉、葡萄糖、硫酸等試劑均為分析純。試驗(yàn)用水均為蒸餾水。大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），均由本校食品系微生物試驗(yàn)室提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備

800 T 型粉碎機(jī)，永康市榮浩工貿(mào)有限公司；GZX-9240MBE 型恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司；FA2004 型電子天平，上海舜宇恒平科技儀器有限公司；HH-2 型恒溫水浴鍋，上海梅香儀器有限公司；722-P 型分光光度計(jì)，上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司；LDZX-30FBS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；MJ106B-Z 型培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 黑松松針的預(yù)處理工藝流程

采集松針→清洗→去除兩端末梢→80 ℃烘干→粉碎→松針?lè)圻^(guò)篩（依次 40 目、80 目、100 目過(guò)篩）→脫脂（石油醚）→烘干、備用

1.2.2 黑松松針多糖的提取工藝

稱取預(yù)處理好的松針?lè)?.0 g，以蒸餾水為提取劑，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在不同的液料比、酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH 條件下進(jìn)行酶解提取試驗(yàn)，以磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液來(lái)調(diào)節(jié)反應(yīng)液的酸性環(huán)境，酶解結(jié)束后沸水浴10 min 滅酶終止酶解反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH 至7.0，將酶解后的提取液進(jìn)行抽濾，合并濾液進(jìn)行濃縮處理，加入4 倍體積的95%乙醇，4 ℃條件下靜置12 h，以4 000 r/min 離心15 min，收集沉淀并冷凍干燥得黑松松針粗多糖。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)對(duì)提取出的黑松松針多糖分別選用纖維素酶和果膠酶進(jìn)行處理，依次考察液料比、酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH 對(duì)黑松松針多糖得率的影響。

1.2.3.1 液料比對(duì)黑松松針多糖得率的影響

精密稱取1.0 g 預(yù)處理好的黑松松針?lè)?，依次按照不同的液料比?0∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g））混合均勻，纖維素酶和果膠酶的添加量均為2%（設(shè)定提取劑體積為100%，下同），用50 ℃水浴酶解2 h，沸水浴10 min 滅酶終止酶解反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH 至7.0，提取黑松松針多糖，分別考察纖維素酶和果膠酶在不同液料比條件下提取的黑松松針多糖得率。

1.2.3.2 酶添加量對(duì)黑松松針多糖得率的影響

精密稱取1.0 g 預(yù)處理好的黑松松針?lè)?，按照液料?20∶1（mL/g）混合均勻，在不同酶添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）條件下，用 50 ℃水浴酶解2 h，沸水浴10 min 滅酶終止酶解反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH 至7.0，提取黑松松針多糖，分別考察纖維素酶和果膠酶在不同酶添加量時(shí)的黑松松針多糖得率。

1.2.3.3 酶解溫度對(duì)黑松松針多糖得率的影響

精密稱取1.0 g 預(yù)處理好的黑松松針?lè)?，按照液料?20∶1（mL/g）混合均勻，纖維素酶添加量 2.5%，果膠酶添加量 1.5%，在不同溫度（40、45、50、55、60 ℃）條件下水浴酶解2 h，沸水浴10 min 滅酶終止酶解反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH 至7.0，提取黑松松針多糖，分別考察纖維素酶和果膠酶在不同酶解溫度下提取的黑松松針多糖得率。

1.2.3.4 酶解時(shí)間黑松松針多糖得率的影響

精密稱取1.0 g 預(yù)處理好的黑松松針?lè)?，按照液料?20∶1（mL/g）混合均勻，纖維素酶添加量 2.5%，果膠酶添加量1.5%，于50 ℃條件下分別水浴酶解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，沸水浴 10 min 滅酶終止酶解反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH 至7.0，提取黑松松針多糖，分別考察纖維素酶和果膠酶在不同酶解時(shí)間下提取的黑松松針多糖得率。

1.2.3.5 pH 對(duì)黑松松針多糖得率的影響

精密稱取1.0 g 預(yù)處理好的黑松松針?lè)郏凑找毫媳?20∶1（mL/g）混合均勻后，在不同 pH（5.5，6.0，6.5，7.0，7.5）下，纖維素酶添加量 2.5%，果膠酶添加量在1.5%，50 ℃水浴酶解（纖維素酶酶解2 h，果膠酶酶解1.5 h），沸水浴10 min 滅酶終止酶解反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH 至7.0，提取黑松松針多糖，分別考察纖維素酶和果膠酶在不同pH 條件下提取的黑松松針多糖得率。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別選取纖維素酶、果膠酶，按照液料比、酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間5個(gè)因素，設(shè)計(jì)五因素四水平的正交試驗(yàn)L16（45），以確定最優(yōu)提取條件。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1 和表2。

表1 纖維素酶提取松針多糖的正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor and level of orthogonal test for extraction of pine needle polysaccharides by cellulase

表2 果膠酶提取松針多糖反應(yīng)的正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factor and level of orthogonal test for extraction of pine needle polysaccharides by pectinase

1.2.5 復(fù)合酶法提取黑松松針多糖

根據(jù)纖維素酶和果膠酶的正交試驗(yàn)結(jié)果，采用復(fù)合酶法（纖維素酶、果膠酶）來(lái)提取黑松松針多糖，同時(shí)研究?jī)煞N加酶方法對(duì)黑松松針多糖得率的影響。一種為同步加酶法，即將纖維素酶和果膠酶按照各自最適濃度一次性同時(shí)加入；另一種采用分步加酶法，即兩種酶分別在各自的最適條件下按照先a 后b（a→b）和先 b 后 a（b→a）的順序加入進(jìn)行提?。╝ 為纖維素酶、b 為果膠酶），探究不同加酶方法對(duì)黑松松針多糖得率的影響。

1.2.6 黑松松針多糖得率測(cè)定

采用苯酚-硫酸比色法[6]測(cè)定。制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光度為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸處理，得到回歸方程：y=7.768 7x+0.049 8，R2=0.999 3。結(jié)果表明，葡萄糖溶液在0～4.0 mg 范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.2.7 黑松松針抑菌性能研究

采用紙片擴(kuò)散法[7]，考察黑松松針多糖對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的體外抑菌效果，以無(wú)菌生理鹽水為空白對(duì)照，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h 后觀察并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果取平均值。采用Origin Pro 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)制圖，數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)黑松松針多糖得率的影響

由圖1 可見(jiàn)，隨著液料比的增加，纖維素酶、果膠酶提取黑松松針多糖的得率逐漸增加。這是因?yàn)橐毫媳鹊倪m當(dāng)增加，促進(jìn)提取液內(nèi)物質(zhì)的流動(dòng)，有利于多糖的溶解，進(jìn)而提高多糖得率。采用纖維素酶和果膠酶單一酶提取黑松松針多糖的最佳液料比均為20∶1（mL/g），其中使用纖維素酶提取的多糖得率稍高。但當(dāng)液料比繼續(xù)增加，酶濃度逐漸降低，導(dǎo)致酶與底物結(jié)合不充分，最終使多糖得率降低。這與周思杰等[3]、范文奇等[8]的研究結(jié)果相似。

圖1 液料比對(duì)黑松松針多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on polysaccharides yield from Pinus thunbergii needles

2.1.2 酶添加量對(duì)黑松松針多糖得率的影響

由圖2 可見(jiàn)，隨著酶添加量的增加，松針多糖得率均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。纖維素酶添加量為2.5%時(shí)，黑松松針多糖得率最高；果膠酶添加量為1.5%時(shí)，黑松松針多糖得率最高。推測(cè)原因是隨著酶添加量的增加，酶與底物接觸機(jī)會(huì)增多，使得多糖提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但當(dāng)酶添加量繼續(xù)增加時(shí)，底物濃度逐漸降低，酶對(duì)溶出的多糖也開(kāi)始起作用，最終導(dǎo)致多糖得率下降。

圖2 酶添加量對(duì)黑松松針多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration on polysaccharides yield from Pinus thunbergii needles

2.1.3 酶解溫度對(duì)黑松松針多糖得率的影響

由圖3 可見(jiàn)，隨著酶解溫度的升高，黑松松針多糖得率也不斷提高，使用纖維素酶和果膠酶單一酶提取的松針多糖均在酶解溫度50 ℃時(shí)其得率達(dá)到最高，其中酶解溫度對(duì)纖維素酶影響較大。這是因?yàn)殡S著溫度的升高，分子熱運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，多糖溶解速度加快，但是當(dāng)溫度繼續(xù)上升時(shí)，多糖得率不斷降低，推測(cè)是高溫使得酶蛋白變性，酶活力減弱，直至完全喪失，多糖得率隨之下降。這與蔣德旗等[9]的研究結(jié)果相近。

圖3 酶解溫度對(duì)黑松松針多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on polysaccharides yield from Pinus thunbergii needles

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)黑松松針多糖得率的影響

由圖4 可見(jiàn)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，使用纖維素酶提取的多糖得率受酶解時(shí)間的影響較大，酶解2 h時(shí)，松針多糖得率最高，推測(cè)原因，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，底物組織結(jié)構(gòu)充分破壞，多糖得以釋放出來(lái)；使用果膠酶提取的松針多糖在酶解1.5 h 時(shí)，酶與底物進(jìn)行充分反應(yīng)，松針多糖得率較好，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，果膠酶活性下降，部分多糖已破壞，使得多糖得率逐漸降低。這與吳龍?jiān)碌萚10]的研究結(jié)果相似。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)黑松松針多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on polysaccharides yield from Pinus thunbergii needles

2.1.5 pH 對(duì)黑松松針多糖得率的影響

pH 也是影響酶活性的重要因素之一。如圖5 所示，使用纖維素酶和果膠酶提取的松針多糖均在pH為6.5 時(shí)得率最高，這是因?yàn)閜H 的升高或降低直接影響酶活性。此外，極酸或者極堿環(huán)境會(huì)造成多糖中糖苷鍵的斷裂，使得多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞[11]。

圖5 pH 對(duì)黑松松針多糖得率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis pH on polysaccharides yield from Pinus thunbergii needles

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 纖維素酶提取黑松松針多糖工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

采用直觀分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，探究各個(gè)因素對(duì)松針多糖得率的影響程度，結(jié)果如表3 所示。液料比的極差最大，為1.305，表明液料比在黑松松針多糖提取過(guò)程中對(duì)多糖得率的影響最大，且最佳液料比為20∶1（mL/g）。各因素對(duì)黑松松針多糖得率的影響程度依次為：A＞C＞D＞E＞B，纖維素酶提取黑松松針多糖最優(yōu)條件為 A2B3C2D2E3，即液料比 20∶1（mL/g），纖維素酶添加量2.5%，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間2 h，pH 6.5。通過(guò)對(duì)最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)得到黑松松針多糖得率為4.73%，高出正交試驗(yàn)組的最佳組合。根據(jù)纖維素酶提取黑松松針多糖工藝正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果（表4）可知，液料比對(duì)黑松松針多糖得率影響顯著（P＜0.05）。

表3 纖維素酶提取黑松松針多糖工藝正交試驗(yàn)的結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test on polysaccharide extraction from Pinus thunbergii needles by cellulase

表4 纖維素酶提取黑松松針多糖工藝正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test for polysaccharide extraction from Pinus thunbergii needles by cellulase

2.2.2 果膠酶提取黑松松針多糖工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

果膠酶提取黑松松針多糖正交試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。各因素對(duì)黑松松針多糖得率的影響程度依次為：C’＞E’＞B’＞D’＞A’，果膠酶提取黑松松針多糖最優(yōu)條件為即液料比 20∶1（mL/g），果膠酶添加量1.5%，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間1.5 h，pH 6.5。通過(guò)對(duì)最佳組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)得出黑松松針多糖得率為3.62%。根據(jù)果膠酶提取黑松松針多糖工藝正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果（表6）可知，酶解溫度和pH 是松針多糖提取的顯著影響因素（P＜0.05）。

表5 果膠酶提取黑松松針多糖工藝正交試驗(yàn)的結(jié)果Table 5 Results of orthogonal test on polysaccharide extraction from Pinus thunbergii needles by pectinase

表6 果膠酶提取黑松松針多糖工藝正交試驗(yàn)方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal test for polysaccharide extraction from Pinus thunbergii needles by pectinase

2.3 復(fù)合酶法提取黑松松針多糖得率結(jié)果

根據(jù)上述正交試驗(yàn)結(jié)果，同步加酶法是將纖維素酶（酶添加量2.5%）和果膠酶（酶添加量1.5%）按照液料比 20∶1（mL/g），酶解溫度 50 ℃，纖維素酶酶解時(shí)間2 h、果膠酶酶解時(shí)間1.5 h，pH 6.5 條件下提取黑松松針多糖。分步加酶法，即兩種酶分別在各自的最適條件（正交的最優(yōu)條件）下按照先纖維素酶后果膠酶和先果膠酶后纖維素酶的順序分別加入進(jìn)行提取。結(jié)果如表7 所示。

表7 不同加酶法提取的松針多糖得率Table 7 Results of polysaccharides yied from Pinus thunbergii needles with different enzymatic methods 單位：%

由表7 可見(jiàn)，分步加酶法提取黑松松針多糖的效果優(yōu)于同步加酶法，與王艷等[12]的研究結(jié)果相似，這是由于分步加酶法是在各自酶的最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行的酶解反應(yīng)，使得兩種酶的酶解效率得到提高，且先加纖維素酶后加果膠酶的順序提取松針多糖的效果較好，松針多糖得率最高，為6.17%。植物細(xì)胞的細(xì)胞壁主要由纖維素、果膠等組成，多糖通常包裹在植物細(xì)胞壁內(nèi)，推測(cè)先加纖維素酶可以水解松針細(xì)胞壁的纖維素，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促進(jìn)多糖成分溶出，后加果膠酶對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)一步進(jìn)行降解，利于多糖的溶出，還可以降低提取液的黏度。

2.4 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

由圖6 可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)纖維素酶和果膠酶酶解提取的黑松松針多糖溶液對(duì)大腸桿菌（抑菌圈直徑為11.25 mm）和枯草芽孢桿菌（抑菌圈直徑為12.78 mm）有較好的抑菌效果。

圖6 黑松松針多糖的抑菌效果Fig.6 Bacteriostatic effects of polysaccharide from Pinus thunbergii needles

3 結(jié)論

黑松松針的細(xì)胞壁構(gòu)成主要是纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等，本試驗(yàn)選用纖維素酶和果膠酶，可以更加有效地破壞松針細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提高多糖成分的提取率。本試驗(yàn)先采用單酶的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定單酶提取多糖的最優(yōu)條件并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，再采用復(fù)合酶法進(jìn)行提取研究，證實(shí)分步加酶法提取的多糖得率較高。工藝參數(shù)為：液料比 20∶1（mL/g），酶解溫度50 ℃，pH 6.5，先添加2.5%纖維素酶，酶解時(shí)間2 h，后添加果膠酶1.5%，酶解時(shí)間1.5 h，該條件下提取的松針多糖得率最高，為6.17%。通過(guò)松針多糖的抑菌試驗(yàn)證實(shí)該方法提取的黑松松針多糖溶液對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有一定的抑制作用。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的復(fù)合酶分步加酶法提取黑松松針多糖提高了多糖得率，并且提取的多糖具有一定的抑菌效果，為植物性生物活性物質(zhì)的提取和黑松松針多糖的開(kāi)發(fā)利用了提供依據(jù)。