幼鼠與成鼠卵巢組織學研究

馬 越，郭桂蘭，高燕程，王 楠，張 棟，李明娜

（甘肅農業(yè)大學 動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070）

卵巢是雌性動物的性腺，通常左右成對存在于母畜的腹腔內。動物到達初情期后，在激素的調控下進入發(fā)情周期[1]。此后的卵巢周而復始地產生類固醇激素，排出卵子，形成黃體，從而使得母畜表現(xiàn)出周期性的發(fā)情狀態(tài)[2]，以便飼養(yǎng)管理人員及時配種。母畜的生產性能主要表現(xiàn)在產仔、哺乳等與繁殖相關的活動中，然而卵巢的機能在很大程度上決定著母畜的生產性能[3]。具體來說，卵巢活動的正常與否決定著母畜性成熟的早晚、發(fā)情周期的長短、排卵數目的多少、卵子受精能力的高低、妊娠、分娩及哺乳能力的高低等多環(huán)節(jié)[4]。因此卵巢在雌性動物生產中扮演重要角色，研究卵巢的組織結構對了解其生理功能至關重要。

小鼠具有個體小、生長快、繁殖力強、飼養(yǎng)方便等特點，被廣泛應用于藥理學實驗、疾病模型等方面的研究，尤其是胚胎生物學和胚胎工程方面的研究[5]。本研究基于模式動物小鼠，進行幼齡和成年小鼠卵巢組織形態(tài)學比較，旨在深入了解不同年齡卵巢中各級卵泡、黃體的形態(tài)差異，剖析卵巢生理功能，為后續(xù)家畜繁殖性能的研究提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗小鼠

10只4周齡和10只8周齡成年SPF級KM白鼠（全雌），購自蘭州獸醫(yī)研究所。飼養(yǎng)于甘肅農業(yè)大學動物場，室溫條件，自由飲食進水。3天無異常表現(xiàn)后用于后續(xù)試驗。

1.2 試劑耗材

實驗所用蘇木精、伊紅染液、中性樹膠等均為索萊寶公司購買；載玻片、蓋玻片自世泰實驗器材公司購買；石蠟自上海華靈康復器械廠購買；刀片為德國萊卡；4%甲醛、無水乙醇、二甲苯等其他試劑購自國藥集團。

1.3 常用儀器

本實驗常用儀器有萊卡RM2235輪轉式切片機、科迪 KD-TS3A自動脫水機、科迪KD-P攤片機、科迪KD-H烘片機、萊卡光學顯微鏡等。

1.4 實驗步驟

1.4.1 取材與固定 飼養(yǎng)3 d后選取體重相近的4周齡小鼠（體重24.25±2.65 g）和8周齡小鼠（體重32.42±2.75 g）各6只。將所有小鼠做好標記，頸部脫臼處死。剪開皮膚，用鑷子拉出小鼠左右兩側子宮和卵巢，用鑷子及手術刀將卵巢與其他組織器官分割開并清除卵巢上的脂肪。后迅速將卵巢浸入4%甲醛溶液內固定，防止細胞死亡后自溶或細菌分解。

1.4.2 脫水與透明 將卵巢組織從固定液中取出，放在微水流中流水沖洗12 h。后用不同濃度酒精（從低到高）作為脫水劑，逐步脫去組織中的水分，再將組織置于二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織中的酒精。具體溶液的濃度與時間見表1。

表1 脫水與透明所用溶液濃度及時間

1.4.3 浸蠟與包埋 將自動脫水機內的組織取出，按合適的方位置于模具中，緩慢倒入已經融化好的石蠟，放入熔蠟箱保溫，待石蠟完全浸入組織后進行包埋。整個過程要求迅速穩(wěn)當。

1.4.4 切片與貼片 將包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成厚度為5 um薄片。切下的薄片往往過于皺褶，需放在加熱至25 ℃攤片機上攤平，再貼到載玻片上（注意不要產生氣泡），后置于45℃的烘片機上烘干。

1.4.5 脫蠟與染色 本實驗采用HE染色，先經2次二甲苯將切片上的石蠟脫盡，用吸水紙吸干液體。脫蠟后經不同梯度乙醇下行至流水；蘇木精染液染色，后用蒸餾水洗掉多余的染料；入分化液（1%鹽酸+99%乙醇）分色，分色后用蒸餾水洗；入0.5%伊紅染液染色，后用80%酒精對伊紅進行分色；再以梯度酒精脫水，二甲苯透明。其溶液的濃度與時間見表2。

表2 脫蠟與染色所用溶液濃度與時間

1.4.6 封片 用玻璃棒蘸取適量中性樹膠于載玻片上，蓋上蓋玻片待凝固后觀察結果。

1.5 數據分析

采用CaseViewer軟件測量每個卵泡面積、數量、直徑、含膜面積（三級至成熟卵泡）、膜厚（三級至成熟卵泡），及黃體面積、數量和直徑。SPSS 18.0軟件對數據進行獨立樣本T檢驗。GraphPad Prism 8作圖。每組5個個體，數據以“平均值±標準差”方式表示。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠卵巢的組織結構觀察

在生物顯微鏡可以觀察到細胞核為藍紫色，細胞質、透明帶、卵泡液、基膜、膠原纖維等被伊紅染成不同程度的紅色，卵巢的原始、初級、次級、三級、成熟等各期卵泡結構能清楚地觀察到。

如圖1A所示，原始卵泡排列在卵巢皮質外周，呈卵圓形，由中央的卵母細胞和外周呈扁平狀的卵泡細胞構成；卵母細胞呈卵圓形，HE染色胞質呈紅色，胞核呈藍色，胞核大而圓位于卵母細胞中央。

如圖1B所示，初級卵泡排列在卵巢皮質外周，體積略大于原始卵泡，外周卵泡細胞由扁平狀發(fā)育為單層立方狀細胞，此時卵泡膜尚未形成，同時也無卵泡腔。

隨著卵泡的發(fā)育，初級卵泡移向卵巢皮質中央，形成次級卵泡（圖1C）。單層立方狀卵泡細胞增殖形成多層柱狀細胞，此時的卵泡細胞稱之為顆粒細胞；當卵母細胞被2～3層顆粒細胞包圍時，于卵母細胞和卵泡細胞之間出現(xiàn)透明帶，HE染色呈淡紅色。

隨著卵泡的進一步發(fā)育，顆粒細胞層數進一步增加，層數達到4～5層時，形成完整的透明帶，HE染色呈紅色；同時顆粒細胞層出現(xiàn)分離而形成不規(guī)則的腔隙，其間充滿著由顆粒細胞分泌的卵泡液，各小腔隙進一步合并形成月牙形的卵泡腔，此時的卵泡稱為三級卵泡（圖1D）。此時卵泡直徑增加明顯，卵母細胞移位于卵泡的一側，與周圍的顆粒細胞共同形成卵丘，靠近透明帶的顆粒細胞形成放射冠，卵泡膜分化為內外兩層。隨著三級卵泡的繼續(xù)生長，卵泡腔增大，卵泡液增多，卵泡擴展到整個卵巢皮質部而突出于卵巢的表面，形成成熟卵泡。

圖1E為黃體。卵泡排卵后，卵泡內膜細胞和顆粒細胞先形成紅體，之后二者逐步黃體化形成顆粒黃體細胞和膜黃體細胞，隨著黃體的進一步發(fā)育，顆粒黃體細胞體積增大呈橢圓形HE染色胞質呈紅色，胞核呈淺藍色；膜黃體細胞主要分布黃體的外周部。

圖1F為閉鎖卵泡。哺乳動物出生后，99%原始卵泡在發(fā)育過程中自發(fā)性退化，稱為卵泡閉鎖。

圖1 各級卵泡形態(tài)

表3 各組小鼠卵巢中卵泡及黃體數量比較

2.2 幼鼠與成鼠卵泡與黃體數量、直徑和面積比較

如表3所示，成鼠黃體數量極顯著高于幼鼠，這是因為幼鼠還沒有進入發(fā)情周期，沒有黃體存在。有腔卵泡數，成鼠與幼鼠差異不顯著。無腔卵泡數，成鼠極顯著高于幼鼠組。

3 討論

幼鼠與成鼠卵巢切片比較，結果顯示幼鼠卵巢中沒有黃體，但存在處于生長發(fā)育階段的各級卵泡。成年卵巢中各級卵泡、黃體均存在，且無腔卵泡數量顯著高于幼鼠。表明動物達到成年后，在完善的發(fā)情周期調控下，卵巢中的各級卵泡生長發(fā)育較幼鼠快，數量多，并且有正常排卵現(xiàn)象。切片中觀察到，成年卵巢和幼年卵巢中成熟卵泡較少，表明所有小鼠沒有處于將要排卵的階段。另外，因成熟卵泡與三級卵泡沒有明顯的界線，因此在文章中沒有分開做統(tǒng)計，綜合統(tǒng)計為有腔卵泡的數量。結果發(fā)現(xiàn)成鼠組和幼鼠組有腔卵泡數差異不顯著，這可能與實驗樣本量較少有關。今后的實驗中有待進一步擴大樣本量進行統(tǒng)計分析。

哺乳動物出生后，99%原始卵泡在發(fā)育過程中自發(fā)性退化稱為卵泡閉鎖[6],卵泡閉鎖是毛細血管、上皮細胞、顆粒細胞、卵母細胞以及卵泡液中激素等組分系列變化的結果[7]。生長卵泡的閉鎖存在兩種不同形態(tài)，分別是實心卵泡和囊狀卵泡，實心卵泡的顆粒層和卵泡膜都向內增生而占據整個卵泡腔；囊狀卵泡的顆粒層和卵泡膜會萎縮，而卵泡腔內不發(fā)生變化。與健康卵泡相比，閉鎖卵泡孕酮（P4）濃度較高而雌二醇（E2）濃度較低[8]；卵泡閉鎖時，近腔顆粒細胞凋亡急劇增多并落入卵泡腔內，甚至卵丘卵母細胞復合體也逐漸脫落［6,9］。卵泡閉鎖影響哺乳動物的繁殖性能，近年來越來越多的學者從分子遺傳學角度來研究卵泡閉鎖的原因。

4 結論

本研究初步對卵巢進行組織形態(tài)學分析，區(qū)分了不同發(fā)育階段的卵泡和黃體，并明確了各自特征。比較發(fā)現(xiàn)幼鼠卵巢中沒有黃體存在，成熟無腔卵泡數量顯著高于幼鼠，有腔卵泡數量差異不明顯。下一步將從各級卵泡面積、占卵巢總面積之比及各級卵泡超微結構入手深入挖掘幼齡和成年小鼠卵巢組織結構差異，為今后家畜繁殖性能的提高提供理論參考。