2型糖尿病患者GCKR基因多態(tài)性及巨噬細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)的研究

褚 璐,任建華,于曉忠

(開灤總醫(yī)院趙各莊醫(yī)院，河北 唐山063101)

2型糖尿病(T2DM)占全部糖尿病患者數(shù)的90%左右，是由于機(jī)體存在胰島素抵抗(IR)導(dǎo)致血糖升高而形成的疾病[1-4]。T2DM的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，不過其發(fā)病具有很強(qiáng)的家族聚集性。GKRP是糖異構(gòu)酶家族成員，為一種不耐熱的化學(xué)分子蛋白質(zhì)。GCKR可與肝臟中的葡萄糖激酶(GCK)結(jié)合成GKRP-GCK復(fù)合物，維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)肝臟葡萄糖代謝和胰島素釋放，抑制GCK的活性[5-6]。GCKR的基因多態(tài)性位點(diǎn)rs780094的T等位基因與T2DM 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的降低和血糖水平的降低有關(guān)[7]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞之一，在外在因素的刺激下可分泌多種分子誘導(dǎo)免疫耐受，從而誘發(fā)相關(guān)疾病的發(fā)生[8]。信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)是一種脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白，存在于胞質(zhì)中，能進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合，從而發(fā)揮調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能[9]。STAT3是STAT3蛋白家族的重要成員，阻斷小鼠巨噬細(xì)胞的STAT3可刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的炎性細(xì)胞因子，發(fā)揮促炎作用[10-11]。本文通過檢測(cè)T2DM患者GCKR基因多態(tài)性及巨噬細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)情況，希望為T2DM的免疫治療尋找新的途徑、靶點(diǎn)和藥物提供參考。現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

采用回顧性的研究方法，研究時(shí)間為2014年5月到2018年2月，選擇在開灤總醫(yī)院趙各莊醫(yī)院內(nèi)分泌科進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)篩查的健康人156例(對(duì)照組)、T2DM患者56例(T2DM組)與血糖調(diào)節(jié)受損(IGR)患者120例(IGR組)，納入標(biāo)準(zhǔn)：醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了此次研究；無嚴(yán)重的急慢性疾病、腎病及其他嚴(yán)重疾病；臨床資料完整；年齡20-75歲；患者簽署了知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：TIDM及繼發(fā)性糖尿病者；心、肝功能不良者；妊娠、哺乳期者；患急性感染性疾病者；腫瘤、心腦血管意外患者。

1.2 GCKR基因多態(tài)性檢測(cè)

所有入選者在晨起空腹取舒適體位，肘前靜脈無菌采血5-8 ml后，采用QIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒提取外周血淋巴細(xì)胞的DNA。使用DNA MAN軟件設(shè)計(jì)待測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物，rs780094 引物序列為：正向引物：5′-ACGTTGGATGAGGGCCCCAGTT-TTTTAGAC-3′，反向引物：5′-ACGTTGGATGCCCGGCCTCAACAAATGTAT-3′。探針和引物由大連TAKARA公司設(shè)計(jì)和提供，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)說明進(jìn)行操作。5 μl反應(yīng)體系：2×Mix 2.5 μl，40×Mix Kit 0.115 μl，模板DNA 1 μl，ddH2O 1.385 μl。PCR條件：40個(gè)循環(huán)，95℃ 10 min，92℃ 15 s，60℃ 1 min。擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為186 bp。

1.3 Western blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)情況

從患者的肘前靜脈血中收集單核細(xì)胞，與巨噬細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，37℃孵箱共培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。裂解細(xì)胞，離心取蛋白，采用BCA法定量蛋白濃度，上樣SDS-PAGE膠，轉(zhuǎn)膜后，一抗稀釋兔抗鼠Stat3抗體(×1000，Santa Cruz公司)與鼠抗鼠β-Actin抗體(×1000，Santa Cruz公司)，使用人HRP標(biāo)識(shí)的二抗稀釋液(×10000，北京中杉金橋公司)，放入自動(dòng)顯像系統(tǒng)，曝光讀取。

所有入選者的血糖、血脂指標(biāo)由檢驗(yàn)科統(tǒng)一檢測(cè)(奧林巴斯全自動(dòng)生化分析儀)，同時(shí)記錄所有入選者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)等資料。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 基本特征對(duì)比

三組入選者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)等對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，T2DM組的空腹血糖、LDL-C、TG值顯著高于對(duì)照組，HDL-C和TC值低于對(duì)照組，T2DM組的空腹血糖高于IGR組，對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 GCKR基因型與等位基因分布

三組入選者的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡(P>0.05)，rs780094位點(diǎn)的三種基因型CC、CT、TT和等位基因C、T在T2DM組、對(duì)照組、IGR組之間的頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 三組入選者的基本特征對(duì)比

表2 三組入選者的rs780094位點(diǎn)基因型及等位基因分布對(duì)比(n)

2.3 STAT3蛋白表達(dá)量對(duì)比

T2DM組的巨噬細(xì)胞STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組和IGR組，IGR組也高于對(duì)照組，對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 三組STAT3蛋白表達(dá)量對(duì)比

2.4 相關(guān)性分析

采用二元logistics回歸模型，在校正了年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、血糖、血脂等混雜因素后，與C等位基因相比，T等位基因入選者T2DM患病OR值為0.992；與CC 基因型相比，攜帶CT、TT、CT+TT基因型的入選者T2DM患病OR值為0.872、0.983和0.911。見表3。

在T2DM患者中，在校正了年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、血糖、血脂后，GCKR rs780094的CT、TT基因型患者與CC基因型患者相比，T等位基因患者與C等位基因患者相比，巨噬細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。見表4。

表3 不同GCKR基因型入選者的T2DM患病風(fēng)險(xiǎn)

表4 T2DM患者GCKR基因型與巨噬細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)的相關(guān)性(n=56)

3 討論

全基因組關(guān)聯(lián)研究顯示T2DM的易感候選基因接近300種，但是尚無一種或幾種基因能解釋T2DM遺傳變異情況[12]。全基因組掃描顯示GCKR基因長(zhǎng)27kb，定位于染色體2p23.2-3，包含19個(gè)外顯子和18個(gè)內(nèi)含子。血糖降低可讓GKRP與GCK特異性地結(jié)合，使GCK在細(xì)胞核內(nèi)保持失活狀態(tài)，促使血糖升高[13]。血糖升高可使GCK-GKRP 解離，促進(jìn)肝糖原合成，導(dǎo)致血糖降低。特別是過量表達(dá)的GKRP與更多的GCK 于核內(nèi)結(jié)合，可發(fā)揮調(diào)節(jié)糖代謝的作用[14]。GCKR的基因多態(tài)性位點(diǎn)rs780094，早期研究顯示GCKR rs780094位點(diǎn)的T等位基因與T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有一定的相關(guān)性[15]。本研究顯示兩組入選者的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡(P>0.05)，rs780094位點(diǎn)的三種基因型CC、CT 、TT和等位基因C、T在T2DM組、對(duì)照組、IGR組之間的頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。相關(guān)研究顯示白種人群中，rs780094 T等位基因降低了T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；非裔人中rs780094 T等位基因與T2DM的相關(guān)性較小[16-17]。本次研究也表明兩者無顯著相關(guān)性，可能與我國(guó)人群遺傳因素、生活方式、飲食習(xí)慣及其交互作用有關(guān)。不過本研究顯示T2DM組的空腹血糖、LDL-C、TG值顯著高于對(duì)照組，HDL-C和TC值低于對(duì)照組，T2DM組的空腹血糖高于IGR組，對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。從機(jī)制上分析，GCK水平的升高伴隨著游離型和結(jié)合型的GCK的活性均升高，可使肝臟葡萄糖酵解通量增加、葡萄糖的利用增加，導(dǎo)致脂肪酸合成酶的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了糖原的合成，并且促進(jìn)脂肪酰輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)DL-C和TG[18]。為此有研究表明GCKR基因rs780094的T等位基因具有對(duì)空腹血糖濃度降低和對(duì)TG濃度升高的作用[19-20]。

STAT3的酪氨酸殘基磷酸化可形成同源或異源二聚體，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)與誘導(dǎo)基因表達(dá)[21]。巨噬細(xì)胞的STAT3激活能增加白介素-10的分泌而誘導(dǎo)免疫抑制，特異性地阻斷小鼠巨噬細(xì)胞的STAT3，能促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生高水平的炎性細(xì)胞因子，刺激細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的增殖。STAT3也可參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞凋亡抑制基因的表達(dá)，STAT3的活化能誘導(dǎo)其靶基因Survivin的表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[22]。本研究顯示T2DM組的巨噬細(xì)胞STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組和IGR組，IGR組也高于對(duì)照組(P<0.05)。相關(guān)研究也表明酪氨酸磷酸化可募集胞漿內(nèi)的STAT3，從而誘發(fā)炎癥性疾病的發(fā)生[23]。

GCK是葡萄糖氧化過程中的限速酶，能感受葡萄糖水平，參與調(diào)控肝臟糖原合成和葡萄糖異生，調(diào)節(jié)胰島素分泌。GCKR能競(jìng)爭(zhēng)性抑制葡萄糖與GCK 結(jié)合，從而抑制GCK 活性，使血糖水平升高。本研究二元logistics回歸模型顯示與C等位基因相比，T等位基因入選者T2DM患病OR值為0.992；與CC 基因型相比，攜帶CT、TT、CT+TT基因型的入選者T2DM患病OR值為0.872、0.983和0.911。當(dāng)前也有研究表明rs780094AA基因型在T2DM患者和代謝綜合征患者中空腹血糖水平較其他基因型者低[24]。

巨噬細(xì)胞可以分泌多種炎性因子，其中JAK-STAT途徑目前被認(rèn)為是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生命活動(dòng)。STAT3蛋白不僅對(duì)于腫瘤細(xì)胞的直接作用，還能在腫瘤微環(huán)境中對(duì)血管新生以及免疫逃避起到抑制作用。本研究顯示GCKR rs780094的CT、TT基因型患者與CC基因型患者相比，T等位基因患者與C等位基因患者相比，巨噬細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。GCKR rs780094基因型對(duì)巨噬細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)量的影響機(jī)制還不明確。有研究顯示，STAT3是炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，炎癥因子也通過抑制巨噬細(xì)胞的免疫功能，特別是能抑制巨噬細(xì)胞的抗原呈遞能力。GCKR rs780094基因多態(tài)性可激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，從而減低STAT3活化狀態(tài)，使巨噬細(xì)胞增殖活性降低[25]。

綜上所述，T2DM患者可表現(xiàn)為GCKR基因多態(tài)性，可導(dǎo)致T2DM的患病風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生變化，與巨噬細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)有顯著相關(guān)性，從而調(diào)節(jié)T2DM的發(fā)生與發(fā)展。