荊州地區(qū)玉米鞘腐病病原菌鑒定及生物學(xué)特性分析

周雙針，王 康，杜何為，2，黃 敏*

（1.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025；2.長江大學(xué)主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北荊州 434025）

玉米（Zea maysL.）是我國重要的糧食作物，據(jù)國家統(tǒng)計局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，2019 年我國玉米的年產(chǎn)量為2.61億噸，播種面積為4 128萬公頃，是我國第一大糧食作物［1］。隨著秸稈還田、免耕直播、地膜覆蓋等耕作栽培方式的廣泛運用，玉米品種更新?lián)Q代及全球氣候變暖，導(dǎo)致玉米病蟲害持續(xù)加重，給玉米產(chǎn)量造成嚴(yán)重?fù)p失［2］。玉米鞘腐病是玉米生長發(fā)育過程中的主要病害之一，該病主要在玉米開花期至乳熟期發(fā)生，為害玉米葉鞘部位，發(fā)病時往往出現(xiàn)不規(guī)則形狀的糜爛狀病斑，顏色以褐色為主，嚴(yán)重時可蔓延至整個葉鞘，致使葉鞘干腐死亡，嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量［3-4］。分離玉米鞘腐病的致病原菌，探明其生物學(xué)特性，對玉米鞘腐病的防治具有重要意義。

玉米鞘腐病最早在美國報道，該病在玉米抽絲期發(fā)生，侵染葉鞘［5］。2008年，徐秀德等通過采集遼寧省、吉林省和黑龍江省的自然病株，采用常規(guī)的植物病理學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，將該病的病原菌鑒定為層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum）［6］。隨后，胡蘭等對該病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其生長的最適溫度為28 ℃，最適pH 值為5～6，分生孢子萌發(fā)適溫為25～30 ℃［7］。玉米不同種群對玉米鞘腐病的抗性不同，2019年，渠清等從玉米16個自交系所在的種群中發(fā)現(xiàn)，蘭卡斯特群和唐四平頭群對玉米鞘腐病表現(xiàn)為抗?。?］。

近年來，湖北地區(qū)玉米鞘腐病的發(fā)病程度越來越嚴(yán)重。本研究通過采集湖北荊州長江大學(xué)試驗地（東經(jīng)112°14′，北緯30°35′ ）中的玉米鞘腐病病株，采用基本的植物病理學(xué)方法鑒定病原菌種類，探究荊州玉米鞘腐病病原的生物學(xué)特性，為該地區(qū)玉米鞘腐病的綜合防治和深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2019 年6 月，從湖北省荊州市長江大學(xué)玉米試驗地采集表現(xiàn)出典型玉米鞘腐病癥狀的玉米病株，用于病原菌分離。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）［9］，查氏培養(yǎng)基（Czapek）［9］，綠豆煎汁培養(yǎng)基（LD，用于誘導(dǎo)大型分生孢子的產(chǎn)出）［10］。

1.3 病原菌分離與純化

參考曹興等的方法［11］，將采集的玉米葉鞘沿病健交界處剪成2～3 mm2大小，表面消毒后置于PDA平板上，25 ℃恒溫倒置培養(yǎng)3～5 d。挑取組織周圍菌絲，轉(zhuǎn)接于另一新的PDA 平板上。培養(yǎng)一周后，用無菌水制成孢子懸浮液，進(jìn)行單孢分離并純化。將純化好的真菌分離物用直徑為5 mm 的打孔器打成菌餅，轉(zhuǎn)入裝有1 mL 25%甘油的1.5 mL離心管中，置于-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

參考盧維宏等的方法［12］，將分離的菌株接種在9 mm 的PDA 平板上，25 ℃下培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)；在顯微鏡下觀察分生孢子形狀及大小，并拍照記錄。參照孫華等的方法［13］，確定菌株的屬和種。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定

參考張穎慧等改良的絲狀真菌DNA 提取方法［14］，挑取在PDA 平板上生長6 d的病原菌菌絲，采用CTAB法提取真菌DNA。對rDNA-ITS序列進(jìn)行擴增，選擇的引物為：ITS1（5′ -TTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ ）和ITS4（5′ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ ）［15］。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.gov）中進(jìn)行同源性檢索，采用MEGA7.0 軟件的Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹［16］。

1.5 致病性測定

將普通牙簽高溫滅菌并去除有毒物質(zhì)后接種，轉(zhuǎn)入Fg-1 的PDA 平板上，25 ℃培養(yǎng)至真菌長滿整個牙簽備用。根據(jù)柯赫氏法則，在玉米試驗田中，采用牙簽接種法［17］，以開花期的玉米植株作為接種對象，用無菌穿刺器在其葉鞘部位穿刺后，將長滿菌絲的牙簽直接插入孔中，保濕培養(yǎng)，以沾滿無菌水的牙簽做空白對照，每處理5次重復(fù)。3 d后觀察接種部位的發(fā)病情況并拍照記錄。將接種真菌和接無菌水（對照）的葉鞘均按照“1.3”節(jié)的步驟獲得再分離菌株，并觀察再分離菌株和原接種病菌的形態(tài)差異。

1.6 病原菌生物學(xué)特性測試分析

1.6.1 溫度對菌絲體生長和大型分生孢子萌發(fā)的影響

參考李俊香等的方法［18］，將保存在-70 ℃冰箱中的病原菌轉(zhuǎn)接于PDA 平板上，置于25 ℃恒溫暗培養(yǎng)5 d，沿著菌落的邊緣打取直徑5 mm 的菌餅，接種在9 mm 的PDA 平板中央，依次放入溫度為5、10、15、20、25、28、30、35、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每個處理設(shè)3 個重復(fù)，從第1 天開始，每天同一時間觀察菌絲的生長情況及菌落的顏色、形態(tài)等，第5 天用十字交叉法測量菌落直徑。

將活化后的病原菌用直徑為5 mm 的無菌打孔器沿著菌落邊緣打取菌餅，取5 片菌餅置于100 mL 綠豆煎汁液體培養(yǎng)基中，25 ℃，150 r·min-1暗培養(yǎng)3 d，然后用4 層無菌紗布過濾菌絲，濾液即為分生孢子液［19］。血細(xì)胞計數(shù)板測定孢子懸浮液的濃度，用無菌水將孢子懸浮液的濃度調(diào)至106個/mL。參考李俊香等的方法［18］，將孢子懸浮液充滿血細(xì)胞計數(shù)板的計數(shù)區(qū)，用顯微鏡觀察并計算計數(shù)區(qū)的大型分生孢子總數(shù)，然后將其放置在溫度為5、10、15、20、25、28、30、35、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，保濕培養(yǎng)。每處理3次重復(fù)。暗培養(yǎng)8 h 后，用顯微鏡觀察并計算計數(shù)區(qū)的已萌發(fā)的大型分生孢子數(shù)目。計算大型分生孢子萌發(fā)率，公式如下：

1.6.2 pH對菌絲體生長的影響

參考李俊香等的方法［18］，用1 mol·L-1NaOH 溶液和1 mol·L-1HCl 溶液將PDA 培養(yǎng)基的pH 值依次調(diào)節(jié)為4.0、6.0、7.0、8.0、9.0、11.0。將病原菌菌餅依次接種至不同pH 值的PDA 平板中央，每處理3 次重復(fù)。第5 天用十字交叉法測量菌落的直徑，計算菌絲的日生長量，觀察菌絲的生長情況及菌落的顏色、形態(tài)等。

1.6.3 碳源對病原菌的影響

參考李俊香等的方法［18］，以察氏培養(yǎng)基（Czapek）為基本培養(yǎng)基，分別用等量的可溶性淀粉、麥芽糖、木糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖和牛肉膏作為7 種不同的碳源進(jìn)行碳源替換。將活化的病原菌菌餅依次接種至不同碳源的察氏培養(yǎng)基中央，每處理3次重復(fù)。從第1天開始，每天同一時間觀察菌絲的生長情況及菌落的顏色、形態(tài)等，第5天用十字交叉法測量菌落直徑。

1.6.4 氮源對病原菌的影響

方法同“1.6.3”節(jié)所述，分別用等量的硝酸鉀、硫酸銨、氯化銨、尿素、蛋白胨、酵母膏作為6 種不同的氮源對察式培養(yǎng)基中的氮源進(jìn)行替換。將活化的病原菌菌餅依次接種至不同碳源的察氏培養(yǎng)基中央，每個處理設(shè)3 個重復(fù)。從第1 天開始，每天同一時間觀察菌絲的生長情況以及菌落的顏色、形態(tài)等，第5天用十字交叉法測量菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

自然條件下，玉米在大喇叭口期開始發(fā)病，發(fā)病初期，葉鞘出現(xiàn)零星褐色小點，后逐漸擴展，多個病斑匯合形成不規(guī)則形斑塊，蔓延至整個葉鞘（見圖1a），葉鞘內(nèi)側(cè)褐變重于葉鞘外側(cè)，伴隨著葉片上有零星斑點，主葉脈出現(xiàn)褐色病斑，并不斷延伸，最終布滿整個主葉脈（見圖1b）。在玉米感病植株中，病斑由下至上，發(fā)病后期可蔓延至雄穗，導(dǎo)致植株干腐死亡（見圖1c）。

2.2 病原菌分離鑒定

2.2.1 病原菌分離及形態(tài)學(xué)鑒定

圖1 玉米鞘腐病田間癥狀

通過10 個發(fā)病葉鞘樣品的病菌分離，共得到8 個菌株，菌落形態(tài)完全一致，經(jīng)單孢純化后得到1 株鐮孢菌菌株（Fg-1）。Fg-1 在PDA 平板上25 ℃培養(yǎng)5 d，菌落呈圓形，菌絲生長旺盛，分泌粉紅色色素，后期中央菌絲體由白色轉(zhuǎn)為淡黃色（見圖2a、2b）；分生孢子無色，呈鐮刀狀，有2～5個隔膜，中間寬兩頭尖，大型分生孢子大小為（3～6）μm×（14～35）μm，平均4.3 μm×24 μm；沒有觀察到小型分生孢子的出現(xiàn)；無厚垣孢子（見圖2c）。

圖2 Fg-1菌落及分生孢子形態(tài)

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

采用真菌通用引物ITS1 和ITS4 對Fg-1 的16S rD?NA-ITS 區(qū)域進(jìn)行PCR 擴增，1.0%凝膠電泳后，在500 bp 處得到一條清晰的條帶（見圖3）。經(jīng)測序，菌株Fg-1 的ITS 片段長度為521 bp，GenBank 中的登錄號為MW133760。將菌株Fg-1的ITS序列與GenBank中的已知序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與Fusarium graminearum（KY272768.1）相似度為99.42 %。用MEGA 7.0 中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖4），F(xiàn)g-1 與F.graminearumFUS89（MK630106.1）、F.graminearumHS42（KY426428.1）聚在同一個分支上。綜上所述，明確將菌株Fg-1 鑒定為禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）。

圖3 rDNA-ITS序列PCR結(jié)果

2.3 致病性測定

將分離得到的Fg-1菌株經(jīng)田間活體植株回接至玉米葉鞘上，接種5 d 后，在接種部位均出現(xiàn)發(fā)病癥狀，病斑呈褐色不規(guī)則形，中央腐爛變干，與田間癥狀類似，對照不發(fā)?。ㄒ妶D5）。從發(fā)病組織中均能再次分離得到與初分離菌株相同的分離物，符合柯赫氏法則，證明Fg-1菌株是引起玉米鞘腐病的致病原菌。

圖4 基于rDNA-ITS序列分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 Fg-1接種至玉米葉鞘的侵染情況

2.4 Fg-1生物學(xué)特性測定

2.4.1 溫度對菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響

溫度試驗結(jié)果表明，在10～35 ℃范圍內(nèi)，菌株Fg-1均能生長，在20～30 ℃范圍內(nèi)生長較快，第5天菌落直徑大于6.0 cm，其中25 ℃菌落直徑為8.5 cm，說明25 ℃時Fg-1生長速度最快（見圖6）。5～10 ℃菌絲體生長緩慢，35～40 ℃基本停止生長。將5 ℃培養(yǎng)5 d 的菌株Fg-1 恢復(fù)至25 ℃培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)菌絲能繼續(xù)生長；而40 ℃下培養(yǎng)5 d 的菌株移至25 ℃培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)菌絲停止生長，說明低溫只是延緩菌絲生長，而高溫則容易導(dǎo)致菌株死亡。

在5～35 ℃，菌株Fg-1 的分生孢子均能萌發(fā)，在20～28 ℃，萌發(fā)率較高（＞25%），最適萌發(fā)溫度為25 ℃，萌發(fā)率達(dá)32%；而高于40 ℃時，分生孢子無法萌發(fā)。在一定溫度范圍內(nèi)，升高溫度對Fg-1的孢子萌發(fā)有促進(jìn)作用，但是溫度超過35 ℃，分生孢子的萌發(fā)將會受到嚴(yán)重抑制（見圖6）。

2.4.2 pH對菌絲生長的影響

試驗結(jié)果顯示，病菌在pH 值4.0～11.0 范圍均能生長，在pH 值為6.0～9.0菌絲的生長情況較好，其中最適生長pH 值為7.0，菌落在第5 天直徑為8.37 cm，菌絲日生長量1.67 cm，菌落飽滿，菌絲密度最大；過酸（pH=4.0）與過堿（pH=11.0）時，菌絲生長較CK極顯著減緩，菌落厚度較薄（見表1）。說明菌株Fg-1生長的最適pH值為7.0。

表1 不同pH條件下Fg-1的生長情況

2.4.3 碳源對Fg-1菌絲體生長的影響

由圖7 可以看出，菌株Fg-1 在供試的7 種碳源培養(yǎng)基上均可生長，但生長速度存在顯著差異。以牛肉膏為碳源時，菌絲生長速度最快，菌絲生長最旺盛，第5 天菌落直徑達(dá)8.5 cm。以木糖為碳源時，菌絲生長最慢，菌落直徑只有3.75 cm，菌落厚度偏薄。以蔗糖、可溶性淀粉為碳源時，菌絲生長速度較慢，菌落直徑為7 cm 左右，菌落厚度較厚，顏色為白色，色素積累較少。即Fg-1菌株對牛肉膏的吸收效率最高，對木糖的吸收效率最低。

圖7 菌絲在不同碳源培養(yǎng)基上的生長

2.4.4 氮源對Fg-1菌絲體生長的影響

由圖8 可以看出，菌株Fg-1 在供試的6 種氮源培養(yǎng)基上均能生長，其生長速度和菌落形態(tài)均存在顯著差異。其中，以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基更有利于Fg-1的生長，第5 天菌落直徑達(dá)7.9 cm，菌絲生長速度達(dá)1.56 cm·d-1，菌絲濃密，菌落較厚，分泌色素為淡粉色；其次是以硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基，其菌落直徑為6.5 cm，菌絲生長速度1.3 cm·d-1，菌絲稀疏，菌落較薄，無色素分泌；以氯化銨為氮源的培養(yǎng)基，菌絲生長速度最慢，只有0.9 cm·d-1，菌落出現(xiàn)水漬狀的形態(tài)，且菌絲稀疏，菌落較薄。

圖8 菌絲在不同氮源培養(yǎng)基上的生長

3 結(jié)論與討論

3.1 湖北荊州玉米鞘腐病病原菌的分離與鑒定

本課題組從湖北荊州地區(qū)采集到的玉米鞘腐病組織中分離得到1株真菌Fg-1，經(jīng)致病性驗證、形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)鑒定，確定為禾谷鐮孢菌（Fusariumgraminearum）。2008 年，徐秀德等從遼寧、吉林和黑龍江等地采集到玉米鞘腐病的病株，首次將玉米鞘腐病的病原菌鑒定為層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum），該真菌的氣生菌絲為絨毛狀至粉末狀，培養(yǎng)基背面為橙黃色，有大小型分生孢子［6］。從玉米鞘腐病組織中分離得到禾谷鐮孢菌，本文屬首例報道。據(jù)文獻(xiàn)報道，禾谷鐮孢菌分布廣泛，可為害多種植物，在小麥中，禾谷鐮孢菌主要引起赤霉病的發(fā)生，在開花期侵染穗部小花，在籽粒灌漿成熟過程中不斷繁殖［20］；在玉米中，該菌還可侵染根部［21］、莖部［22］、穗部［13］，造成侵染部位的腐爛，影響植株的正常生長，導(dǎo)致產(chǎn)量降低。

3.2 病原菌Fg-1的生物學(xué)特性

據(jù)報道，引起茭白采后腐爛的禾谷鐮孢菌最適生長溫度為25 ℃，致死溫度為55 ℃，最適產(chǎn)孢pH 值為6.0［23］；百合鱗莖禾谷鐮孢菌的最適生長溫度為30 ℃，最適生長pH 值為8.0［24］；四川雅安玉米青枯病致病菌禾谷鐮孢菌的最適生長溫度為25～30 ℃，35 ℃生長受到抑制，最適pH 值為7.0，察氏培養(yǎng)基最適碳源為葡萄糖，最適氮源為蛋白胨，其次是以硝酸鉀和尿素為氮源［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，玉米鞘腐病致病菌禾谷鐮刀菌（Fg-1）的最適生長溫度為25 ℃，致死溫度為40 ℃，最適pH 值為7.0，察氏培養(yǎng)基最適碳源、氮源分別為牛肉膏、酵母膏。由此可見，相同培養(yǎng)條件下的禾谷鐮孢菌，在不同寄主和不同地區(qū)，其生物學(xué)特性有所不同，可能與該菌的寄主及其地區(qū)不同有關(guān)。

3.3 病害防治

湖北荊州地區(qū)的菌株Fg-1 在5～35 ℃均能存活并且在pH 值為4.0～11.0 的條件下均能生長，說明荊州的禾谷鐮孢菌在玉米鞘腐病病殘體上可以安全越過冬夏，成為下一季植物的侵染源，并且荊州氣候潮濕，在夏季梅雨期更有利于禾谷鐮孢菌的萌發(fā)和生長。隨著秸稈還田、免耕直播等技術(shù)的廣泛推廣及應(yīng)用，更會加重病菌在田間的繁殖。建議在發(fā)生病害的田間，不要采用秸稈還田、免耕直播等耕作方法。據(jù)報道，氰烯菌酯、氟唑菌酰羥胺、丙硫菌唑及氟環(huán)唑等殺菌劑均可以對禾谷鐮孢菌產(chǎn)生毒性，但是為了延緩抗藥性的產(chǎn)生，延長殺菌劑的使用年限，高效防治禾谷鐮孢菌病害，建議在防治過程中輪換使用藥劑，或者將不同作用靶標(biāo)的藥劑混配使用［26］。