馬鈴薯Y病毒衣殼蛋白抗原表位分析及其快速ELISA檢測方法的建立

梁雨欣，吳建祥，李小宇，張春雨，侯吉超，周雪平,，王永志,

馬鈴薯Y病毒衣殼蛋白抗原表位分析及其快速ELISA檢測方法的建立

梁雨欣1,2，吳建祥3，李小宇2，張春雨2，侯吉超1，周雪平3,4，王永志2,4

1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，長春 130118；2吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，長春 130033；3浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所，杭州 310058；4中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，北京 100193

【】馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）是影響馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病毒之一，目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的防治藥劑，脫毒種薯的應(yīng)用是預(yù)防PVY危害的主要防治措施。建立靈敏度高、特異性強的PVY快速檢測方法，為脫毒種薯質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。將PVY衣殼蛋白（coat protein，CP）分段表達為有重疊部分的小段多肽，以其為抗原通過Western blot分析PVY-CP的抗原表位。以P/N值最大為標(biāo)準(zhǔn)，通過常規(guī)雙抗夾心ELISA（DAS-ELISA）對識別不同抗原表位的單克隆抗體（monoclonal antibody，MAb）進行配對試驗，篩選一組檢測效果最優(yōu)的配對單克隆抗體，并確認(rèn)捕獲抗體和檢測抗體。通過方陣滴定法確定捕獲抗體及檢測抗體的最佳工作濃度，通過控制變量法確定檢測抗體與抗原的最佳共同孵育時間。以不同濃度的PVY-CP蛋白為抗原，檢驗快速DAS-ELISA的靈敏度。以感染不同病毒的馬鈴薯樣品為抗原，檢測快速DAS-ELISA的特異性。同時通過快速DAS-ELISA與RT-PCR檢測50份田間采集的疑似感染PVY的馬鈴薯樣品，將二者結(jié)果相比較檢驗檢測方法的符合率。運用建立的快速DAS-ELISA對不同株系PVY感染的馬鈴薯樣品進行檢測。利用PVY-CP的6條分段表達多肽篩選到一組能進行DAS-ELISA的配對單克隆抗體（9G6和3D3），并以這對單抗為基礎(chǔ)建立了PVY快速DAS-ELISA檢測方法。以9G6為捕獲抗體包被酶標(biāo)板，檢測抗體3D3經(jīng)辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記后以2 μg·mL-1的工作濃度與抗原在37℃共同孵育5 min。該檢測方法檢測限為0.5 ng·mL-1，特異性分析結(jié)果顯示該法僅在檢測感染PVY的馬鈴薯樣品時呈陽性反應(yīng)，檢測馬鈴薯S病毒（potato virus S，PVS）、馬鈴薯M病毒（potato virus M，PVM）、馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf-roll virus，PLRV）等其他常見馬鈴薯病毒樣品均呈陰性反應(yīng)。通過快速DAS-ELISA與RT-PCR同時對50份田間采集的馬鈴薯樣品進行檢測，有48份樣品檢測結(jié)果一致，符合率達96%，且對PVYN及PVYO樣品檢測結(jié)果均呈陽性。建立的PVY檢測方法靈敏度高、特異性強，30 min即可完成檢測，方便快捷，為PVY的高通量檢測、脫毒種薯的生產(chǎn)提供了關(guān)鍵技術(shù)支持。

馬鈴薯Y病毒；單克隆抗體；抗原表位；雙抗夾心ELISA

0 引言

【研究意義】馬鈴薯是世界第四大糧食作物，2015年中國提出馬鈴薯主糧化發(fā)展戰(zhàn)略，目前中國是馬鈴薯第一大生產(chǎn)國[1-2]。已知能侵染馬鈴薯的病毒至少有53種，我國已發(fā)現(xiàn)10余種[3]。其中，馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）是侵染范圍最廣也是造成經(jīng)濟損失最嚴(yán)重的病毒之一[4-5]。PVY于1931年在馬鈴薯中首次被發(fā)現(xiàn)[6]，目前在世界各地均有發(fā)生[7-11]。在自然條件下PVY可通過蚜蟲以非持久性方式傳播，同時也可以通過汁液摩擦、嫁接等機械方式傳播。PVY單獨侵染馬鈴薯可引起葉面黃化褪綠、皺縮、葉脈壞死等癥狀，且由于帶毒薯塊自身無法清除病毒，病毒會逐代傳播積累最終導(dǎo)致馬鈴薯種質(zhì)退化，若與其他病毒復(fù)合侵染可造成馬鈴薯高達80%的減產(chǎn)[12-15]。由于尚未發(fā)現(xiàn)有效的病毒病防治藥劑，高質(zhì)量的脫毒種薯成為病毒病的重要防治措施，而快速、高效的病毒檢測技術(shù)是種薯質(zhì)量控制的關(guān)鍵?！厩叭搜芯窟M展】目前常用的PVY檢測方法主要有生物學(xué)檢測法、電子顯微鏡檢測法、分子生物學(xué)檢測法和血清學(xué)檢測法[16]。生物學(xué)檢測法和電子顯微鏡檢測法都需要培養(yǎng)或制備合適的觀察對象，耗時較長且結(jié)果判定較為主觀，并不適用于快速檢測。以高靈敏度為優(yōu)點的RT-PCR是近年來常用于PVY檢測的分子生物學(xué)檢測法，而CP基因以其高保守性成為RT-PCR擴增的首選基因，其表達的CP蛋白亦是血清學(xué)檢測法檢測的首選蛋白。李玉琦等[17]針對PVY-CP保守區(qū)設(shè)計一對特異性引物，建立了可以快速、準(zhǔn)確地檢測馬鈴薯帶病種薯和植株中PVY含量的RT-PCR檢測方法。雖然RT-PCR靈敏度高、特異性強，但在實際應(yīng)用時對RNA的提取、cDNA的反轉(zhuǎn)錄要求較高，不適用于高通量樣品檢測。ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）是目前最常用的血清學(xué)檢測方法之一，具有高通量、不依賴特定儀器設(shè)備，操作簡單穩(wěn)定性好等優(yōu)點。早在1981年，張鶴齡等[18]利用提取的PVY病毒免疫家兔，制備了PVY多克隆抗體，并檢測了煙草中的PVY，然而可檢測的感病汁液最高稀釋度僅為1﹕100；1993年，Singh等[19]制備了多株P(guān)VY抗體，并以特異性最佳的單克隆抗體為基礎(chǔ)建立了dot-ELISA，對馬鈴薯葉片中PVYN進行檢測，最高稀釋度為1﹕640；2008年，高方方等[20]通過PVYN株系分離物CP重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備了PVY兔血清，建立了PVY間接ELISA并對煙草中的PVY進行檢測，最高稀釋度為1﹕128；2016年，宋革等[21]制備了4株P(guān)VY單克隆抗體，以其為核心建立了ACP-ELISA、dot-ELISA、tissue blot-ELISA和IC-RT-PCR 4種血清學(xué)檢測方法，靈敏度極高但檢測步驟繁瑣?！颈狙芯壳腥朦c】前期雖有部分研究者制備了PVY特異性抗體，但甚少有應(yīng)用方面的報道。而已建立的血清學(xué)檢測方法，由于靈敏度較低，試驗流程較為繁瑣且耗時較長，無法滿足快速高通量的檢測需求?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過PVY-CP的分段表達多肽篩選到一組能進行夾心ELISA的配對單克隆抗體（9G6和3D3），并以這對單抗為基礎(chǔ)建立PVY快速DAS-ELISA檢測方法。通過優(yōu)化DAS-ELISA工作條件，將樣品和檢測抗體同時加入酶標(biāo)板共同孵育，簡化操作步驟并縮短試驗時間，從而提高檢測效率，為PVY的快速檢測、診斷及脫毒種薯的生產(chǎn)提供關(guān)鍵技術(shù)。

1 材料與方法

試驗于2019年在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所微生物重點實驗室完成。

1.1 材料與試劑

PVY病毒、大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所微生物實驗室保存，PVY單克隆抗體3D3、9G6為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所微生物實驗室制備，PVY單克隆抗體3E4為浙江大學(xué)制備；限制內(nèi)切酶R I、I，In-Fusion? HD Cloning Kit均購自TaKaRa公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(shù)有限公司；RNeasy Plant Mini Kit購自QIAGEN公司；ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自賽默飛世爾科技公司；雙組分TMB顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；脫脂奶粉、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG購自Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

洗板機、酶標(biāo)儀購自美國伯騰儀器有限公司；高速冷凍臺式離心機購自日本日立公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器購自上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 PVY-CP蛋白抗原表位分析

將PVYCP基因分段表達為6條多肽：PVY-CP1-180、PVY-CP90-281、PVY-CP1-59、PVY-CP31-89、PVY-CP90-148和PVY-CP120-180，設(shè)計特異性引物（表1），進行PCR擴增，RI和I雙酶切pGEX-6p-1載體，同時對目的基因PCR擴增產(chǎn)物及酶切載體大片段進行膠回收，通過In-Fusion試劑盒將二者連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，表達PVY-CP1-180、PVY-CP90-281、PVY-CP1-59、PVY-CP31-89、PVY-CP90-148和PVY-CP120-1806條多肽。以表達的多肽進行SDS-PAGE電泳，恒壓轉(zhuǎn)膜，MAb（雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清）為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG為二抗，通過Western blot分析MAb所識別的抗原表位。

表1 PVY-CP蛋白分段表達引物

：R I酶切位點R I restriction enzyme cutting site；：I酶切位點I restriction enzyme cutting site

1.4 MAb HRP標(biāo)記

采用簡易過碘酸鈉法對MAb進行HRP標(biāo)記，詳細(xì)步驟參照文獻[22]。

1.5 快速ELISA檢測方法的建立

捕獲抗體100 μL/孔，包被酶標(biāo)板；加入5%脫脂奶280 μL/孔，37℃封閉30 min；將待測樣品按1﹕10（W/V，g·mL-1）比例加入0.01 mol·L-1PBS緩沖液研磨后離心取上清，以上清為溶劑稀釋檢測抗體，將混合液加入酶標(biāo)板，100 μL/孔，37℃靜置孵育；以上每一步結(jié)束后TBST洗板3次；TMB顯色液100 μL/孔，避光顯色5—10 min后加入2 mol·L-1H2SO4溶液50 μL/孔，終止反應(yīng)；在450 nm波長讀取OD值。以P（待測抗原OD450值）/N（陰性抗原OD450值）≥2.1判定檢測結(jié)果為陽性。

1.6 快速ELISA工作條件的優(yōu)化

分別以健康馬鈴薯、感染PVY馬鈴薯的葉片研磨上清液為陰性和陽性對照，運用常規(guī)DAS-ELISA程序進行3株P(guān)VY MAb的配對，以P/N最大值對應(yīng)的抗體組合為工作抗體。采用方陣法確定抗體工作濃度；通過控制變量法分別對捕獲抗體包被條件、待測樣品與檢測抗體混合液孵育時間進行優(yōu)化，以P/N最大值確定捕獲抗體包被條件及待測樣品和檢測抗體共同孵育時間。

采集感染PVY的馬鈴薯葉片，0.01 mol·L-1PBS緩沖液為研磨液充分研磨，將葉片按質(zhì)量體積比從1﹕10（1 g=10 mL）倍比稀釋至1﹕5 120，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，運用優(yōu)化后的檢測方法對其進行檢測，以稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，P/N值為縱坐標(biāo)，得出葉片最佳檢測范圍的稀釋倍數(shù)。

1.7 檢測靈敏度分析

以0.01 mol·L-1PBS緩沖液為稀釋液將PVY-CP蛋白從10 000 ng·mL-1稀釋至0.05 ng·mL-1，運用優(yōu)化后的檢測方法對其進行檢測，每個濃度3個重復(fù)，同時設(shè)置陰性對照，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，P/N值為縱坐標(biāo)，繪制靈敏度曲線[23]。

1.8 特異性分析

利用優(yōu)化后的PVY快速DAS-ELISA對PVY馬鈴薯薯塊及葉片、馬鈴薯S病毒（potato virus S，PVS）、馬鈴薯M病毒（potato virus M，PVM）、馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf-roll virus，PLRV）葉片進行檢測，每份樣品3個重復(fù)，根據(jù)P/N值≥2.1為陽性檢驗檢測方法的特異性。

1.9 符合率檢測

對吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗地隨機采集的50份疑似感染PVY的馬鈴薯樣品，運用建立的快速DAS-ELISA及RT-PCR分別進行檢測，比較檢測結(jié)果，對檢測方法的符合率進行檢驗。按照RNeasy Plant Mini Kit試劑盒提取馬鈴薯葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。根據(jù)PVY檢疫鑒定方法國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 36816—2018）合成用于擴增PVY的RT-PCR簡并引物，PVY-a1-F420：5′-CGATACAAG ACTGATGYCCAGAT-3′；PVY-a1-R1200：5′-TAYTGT TGRGCACAGGTRGGG-3′。PCR條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，62℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72℃再延伸3 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)5%瓊脂糖凝膠電泳，并送往吉林省庫美科技有限公司進行測序驗證。

1.10 不同株系馬鈴薯樣品檢測

運用建立的快速DAS-ELISA對實驗室保存的不同株系PVY（PVYN與PVYO）感染的馬鈴薯樣品進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 MAb識別抗原表位分析

如圖1所示，共表達了6條多肽，首先將PVY-CP蛋白分段表達為有重疊部分的兩條肽段：PVY-CP1-180與PVY-CP90-281，通過Western blot分析MAb 3D3、3E4、9G6識別的抗原表位，結(jié)果如表2所示，3D3對兩條肽段均有識別，即3D3識別的抗原表位位于兩條肽段的重疊部分：PVY-CP90-180，同理可知9G6識別的抗原表位亦位于PVY-CP90-180。而3E4僅識別PVY-CP1-180，不識別PVY-CP90-281，即3E4識別的抗原表位位于PVY-CP1-90。由此得知，3株MAb識別的抗原表位均集中在PVY-CP1-180。進一步分析抗原表位，繼續(xù)將PVY-CP1-180分段表達為PVY-CP1-59、PVY- CP31-89、PVY-CP90-148、PVY-CP120-1804條多肽，仍通過Western blot分析MAb 3D3、3E4、9G6識別的抗原表位，結(jié)果如表2，最終發(fā)現(xiàn)3D3識別的抗原表位位于PVY-CP120-148，3E4識別的抗原表位位于PVY- CP31-59，9G6識別的抗原表位位于PVY-CP90-119，3株MAb均識別不同抗原表位。

圖1 PVY-CP蛋白分段表達示意圖

表2 3株MAb識別抗原表位分析

“+”：Western blot結(jié)果為陽性the western blot result was positive；“-”：Western blot結(jié)果為陰性The western blot result was negative

2.2 PVY快速DAS-ELISA檢測方法的建立及優(yōu)化

以常規(guī)DAS-ELISA檢測方法確定捕獲抗體為9G6，檢測抗體為HRP-3D3。采用方陣法對抗體工作濃度進行優(yōu)化，當(dāng)捕獲抗體濃度為4 μg·mL-1，檢測抗體濃度為2 μg·mL-1時，P/N值最大（表3），檢測效果最好，故確定其為抗體工作濃度。由P/N值最大可確定捕獲抗體最佳包被條件為4℃過夜（圖2-A），包被封閉好的酶標(biāo)板即可用于PVY檢測。

檢測步驟只需將待測樣品與檢測抗體混合液100 μL/孔加入酶標(biāo)板于37℃進行孵育，孵育完成洗滌后加入TMB顯色液，顯色5—10 min后加入2 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，在450 nm波長讀取OD值。如圖2-B，37℃孵育5 min時已可對樣品進行定性判斷，孵育15 min時檢測效果可達到最佳。當(dāng)P/N值≥2.1判定陽性，1.5≤P/N值＜2.1判定為疑似陽性，需進一步檢測，P/N值＜1.5判為陰性結(jié)果。全部檢測過程可以在30 min內(nèi)完成。

表3 抗體最佳工作濃度確定

*：P/N值 P/N value

A：捕獲抗體包被條件對檢測結(jié)果的影響The effect of capture antibody incubating condition on the rapid DAS-ELISA；B：待測樣品與檢測抗體混合液孵育條件對檢測結(jié)果的影響The effect of incubation condition of mixture of sample and the detection antibody on the rapid DAS-ELISA

利用優(yōu)化后的快速DAS-ELISA對PVY馬鈴薯葉片進行檢測，結(jié)果顯示，當(dāng)葉片稀釋倍數(shù)在10—1 280倍時，P/N值≥2.1，檢測結(jié)果呈陽性（圖3-A），確定該檢測方法對PVY馬鈴薯葉片的檢測范圍為10—1 280倍稀釋。

2.3 檢測靈敏度分析

運用建立的快速DAS-ELISA，以PVY-CP蛋白濃度為橫坐標(biāo)，P/N值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3-B），當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?.5 ng·mL-1時P/N＞2.1，檢測結(jié)果呈陽性；當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?.1 ng·mL-1時，P/N值＜2.1，檢測結(jié)果呈陰性，故該檢測方法對PVY-CP蛋白的檢測限為0.5 ng·mL-1。

A：PVY馬鈴薯葉片檢測范圍Detection range of PVY potato leaf；B：PVY蛋白靈敏度曲線Sensitivity curve of PVY protein

2.4 特異性分析

如圖4所示，建立的PVY快速DAS-ELISA檢測PVY馬鈴薯薯塊及葉片結(jié)果均呈陽性，對PVS、PLRV、PVM馬鈴薯葉片進行檢測，檢測結(jié)果呈陰性，表明檢測方法特異性良好。

2.5 符合率檢測

為了對建立的快速DAS-ELISA符合率進行檢驗，運用快速DAS-ELISA對田間隨機采集的50份疑似感染PVY的馬鈴薯樣品進行檢測。結(jié)果顯示，有33份馬鈴薯樣品檢出PVY，17份樣品未檢出。同時，將上述所有樣品進行RT-PCR檢測，結(jié)果表明快速DAS-ELISA檢測陽性樣品均檢測到PVY特異性PCR產(chǎn)物，而在17份DAS-ELISA檢測陰性樣品中，有2份樣品RT-PCR檢測結(jié)果為陽性，推測是樣品中PVY的含量低于本檢測方法的最低檢測限。本研究建立的快速DAS-ELISA與RT-PCR共有48份樣品檢測結(jié)果一致，符合率達96%。

PVY1：感染PVY的馬鈴薯葉片Potato leaves infected with PVY；PVY2：感染PVY的馬鈴薯種薯Potato seeds infected with PVY；PVS、PLRV、PVM：分別為感染PVS、PLRV、PVM的馬鈴薯葉片Potato leaves infected with PVS, PLRV, PVM, respectively

2.6 馬鈴薯樣品檢測

如圖5所示，建立的快速DAS-ELISA檢測方法對PVYN與PVYO馬鈴薯樣品檢測結(jié)果均為陽性，可滿足田間發(fā)生最為廣泛的株系檢測需求。

1—6：PVYN馬鈴薯樣品PVYN potato samples；7—12： PVYO馬鈴薯樣品PVYO potato samples

3 討論

PVY所在的馬鈴薯Y病毒屬（）是最大的植物病毒屬之一，該屬基因組包含一個大的開放閱讀框，表達時先編碼一個多聚蛋白，隨后通過自身編碼的蛋白酶切割為至少10個功能不同的成熟蛋白[24-25]，其中高度保守的CP蛋白在病毒侵染過程中起重要作用，且含有多個抗原決定簇，決定著病毒的抗原性[26-27]。本研究建立快速DAS-ELISA的基礎(chǔ)是捕獲抗體與檢測抗體識別不同的抗原表位，從而避免抗體識別的表位有重疊甚至重合導(dǎo)致抗體競爭性結(jié)合抗原，減弱檢測信號、降低檢測方法靈敏度。目前常用的病毒抗原表位研究方法主要有預(yù)測法、抗原肽合成法、噬菌體展示法、核磁共振分析法及表面等離子共振技術(shù)等[28]，本研究采用重疊多肽合成法將PVY-CP蛋白分段表達為有部分重疊的小段蛋白，通過抗原抗體特異性結(jié)合的原理對抗體識別的抗原表位進行鑒定。在本研究中使用的3株MAb，雖然皆識別不同抗原表位，但由于抗體本身的親和力對抗體的配對效果也有很大影響，故配對效果有一定差異。本研究通過分段表達PVY-CP蛋白，對其抗原表位進行分析，將MAb識別的抗原表位確定在30個氨基酸，篩選出了9G6與3D3兩株識別不同抗原表位且配對檢測效果最佳的MAb，以此為基礎(chǔ)建立了PVY快速DAS-ELISA。

病毒病的發(fā)生和流行是病毒、宿主、環(huán)境等因素共同作用導(dǎo)致的結(jié)果。病毒病流行中存在的暴發(fā)性、間歇性和遷移性與病毒生態(tài)系統(tǒng)中各種生物和非生物因素密切相關(guān)，也由于具有“三性”的特點，病毒病的發(fā)生變得頗為復(fù)雜，使得病毒病的流行預(yù)測困難重重[29-30]。因此，高效快速、準(zhǔn)確的檢測方法對于有效預(yù)防和控制病毒病至關(guān)重要。DAS- ELISA作為血清學(xué)檢測技術(shù)的代表性檢測方法已廣泛應(yīng)用于各類檢測，但受抗體本身的特性影響，DAS-ELISA的檢測步驟較為固定且檢測時間也較長。BIOREBA出產(chǎn)的DAS-ELISA PVY檢測試劑盒需至少2 d[31]，秦艷紅建立的PVY DAS-ELISA為確保試驗效果檢測時間至少需要5 h[32]。本研究建立的PVY快速DAS-ELISA，經(jīng)抗原表位分析后確定的捕獲抗體與檢測抗體識別不同的抗原表位，不存在抗原表位競爭現(xiàn)象，直接以待測樣品研磨液為溶劑稀釋酶標(biāo)檢測抗體至工作濃度，將抗原抗體混合液直接加入包被封閉好的酶標(biāo)板孵育5 min，顯色5—10 min即可終止，較常規(guī)DAS-ELISA簡化了試驗步驟，縮短了檢測時間，30 min即可完成定性檢測，檢測效率顯著提升。

PVY株系分化嚴(yán)重，可分為非重組株系和重組株系。在非重組株系中，發(fā)生較為頻繁的是PVYN和PVYO株系，而在重組株系中，發(fā)生較為頻繁的是PVYN×PVYO類型重組株系[33]。在PVY的研究過程中，雖然不斷有新的重組株系與非重組株系出現(xiàn)，但在田間實際調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PVYN×PVYO類型重組株系是田間主流株系，占據(jù)著非常高的比例[34]。鑒于此，本研究使用建立的快速DAS-ELLSIA檢測方法，對實驗室保存的PVYN和PVYO的馬鈴薯樣品進行了檢測，結(jié)果顯示兩株系樣品檢測結(jié)果均為陽性，表明本研究所建立的檢測方法盡管以識別單一位點的單抗為基礎(chǔ)，但仍可滿足田間生產(chǎn)上的檢測需求。TIAN等[35]對3株商品化PVY單抗識別的抗原表位進行分析后發(fā)現(xiàn)3株商品化單抗表位保守性相對較好，可檢測多種PVY株系，這也證明了單克隆抗體可以用于馬鈴薯種質(zhì)監(jiān)測，滿足生產(chǎn)上的檢測需求。

4 結(jié)論

以高度保守的PVY-CP蛋白作為檢測對象，建立了PVY快速DAS-ELISA，該檢測方法檢測限為0.5 ng·mL-1，僅與感染PVY的馬鈴薯樣品反應(yīng)呈陽性結(jié)果，靈敏度高、特異性強。30 min即可完成檢測，操作簡便、快捷，檢測效率高，有待進一步開發(fā)為試劑盒，為PVY的防控提供技術(shù)及產(chǎn)品支持。

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Mapping of epitopes and establishment of rapid DAS-ELISA for Potato Virus Y Coat Protein

LIANG YuXin1,2, WU JianXiang3, LI XiaoYu2, ZHANG ChunYu2, HOU JiChao1, ZHOU XuePing3,4, WANG YongZhi2,4

1College of Plant Protection, Jilin Agricultural University, Changchun 130118;2Institute of Plant Protection, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033;3Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058;4Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193

【】Potato virus Y (PVY) is one of the most serious viruses that affect the yield and quality of potato. At present, no effective virus treatment agent has been found, and application of virus-free seed potato is the main control measure to prevent PVY damage. The objective of this study is to establish a rapid detection method with high sensitivity and specificity, and to provide technical support for quality control of virus-free seed potato.【】PVY coat protein (CP) was expressed as small polypeptides with overlapping parts, and the epitopes of PVY-CP were analyzed by Western blot. Matching experiments were performed on monoclonal antibodies that recognized different epitopes by conventional double antibody sandwich ELISA (DAS-ELISA), and a pair of monoclonal antibodies with the best detection effect was screened. At the same time, the captured and detected antibodies were confirmed. According to the standard of maximum P/N value, the working concentration of antibody was determined by square titration. The optimal co-incubation time of antibody and antigen was determined by control variable method. The sensitivity of rapid DAS-ELISA was tested with different concentrations of PVY-CP protein as antigen. Potato samples infected with different viruses were used as antigens to detect the specificity of rapid DAS-ELISA. Through rapid DAS-ELISA and RT-PCR detection of 50 samples of potato samples with suspected infection PVY collected in the field, the coincidence rate was tested.Finally, the established rapid DAS-ELISA was used to detect potato samples infected by different PVY strains.【】A panel of monoclonal antibodies (9G6 and 3D3) that can be used for DAS-ELISA were screened using the expressed peptides of PVY CP, and a rapid DAS-ELISA was established based on this panel of MAbs. The ELISA plate coated with the capture antibody 9G6, and then co-incubated with detector antibody HRP labeled 3D3 (2 μg·mL-1) and samples for 5 min at 37℃ after blocking the plate. The detection limit was 0.5 ng·mL-1. The results of specific analysis showed that the established method was only positive for potato samples infected with PVY, and negative for potato virus S (PVS), potato virus M (PVM) and potato leaf-roll virus(PLRV). In comparison with RT-PCR, DAS-ELSIA had the coincidence rate of 96% through testing 50 potato simples, and the results of PVYNand PVYOpotato samples were positive. 【】The established PVY detection method has high sensitivity and specificity, and can be completed within 30 min, which is convenient and fast, and provides key technical support for high-throughput detection of PVY and the production of virus-free seed potato.

potato virus Y (PVY); monoclonal antibody; antigen epitope; double antibody sandwich ELISA (DAS-ELISA)

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.06.007

2020-06-11；

2020-08-14

國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0201604）、吉林省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程人才基金（c92070813）、吉林省科技廳重點項目（20180201013NY）

梁雨欣，E-mail：lyx6620@163.com。通信作者王永志，E-mail：yzwang@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）