利用DNA片段測序方法探究枳屬和富民枳的分類地位

張余 龔洵 馮秀彥

摘 要： 富民枳（Poncirus polyandra）屬于蕓香科（Rutaceae）枳屬（Poncirus Raf.）。自發(fā)表以來，分類地位一直備受爭議，其中在Flora of China中認(rèn)為富民枳為柑橘雜交種（Poncirus? polyandra），把枳屬歸并于柑橘屬（Citrus）。該研究選取枳屬的富民枳、枳（Poncirus trifoliata）及柑橘屬下8個種共10個種47個個體作為研究材料，以九里香（Murraya exotica）為外類群，利用3個葉綠體片段（trnL-trnF、trnS-trnG、rbcL）、ITS片段和1個單拷貝核基因（Chr5）數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，探究枳屬和富民枳的分類地位。結(jié)果表明：基于3個葉綠體片段數(shù)據(jù)構(gòu)建的最大似然樹（ML）和貝葉斯樹（BI）的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致， 10個物種聚為兩大分支，即柑橘屬的8個物種聚為一大分支，富民枳和枳聚為另一大分支。其中，富民枳所有個體聚為一小單系分支，枳的所有個體聚為一小單系分支，支持枳屬和富民枳獨立存在。2個核DNA片段數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，枳屬的兩個種與柑橘屬的8個物種聚在一個大分支里，無法確立枳屬的單系地位，但富民枳的9個個體聚在一起，暗示富民枳在遺傳上是一個獨立的類群。綜上研究認(rèn)為，無論是葉綠體DNA數(shù)據(jù)還是核DNA數(shù)據(jù)均支持富民枳是一個獨立的物種，但核DNA數(shù)據(jù)不支持枳屬成立。

關(guān)鍵詞： 枳屬， 富民枳， 柑橘屬， 系統(tǒng)發(fā)育， 分類地位

Abstract： Poncirus polyandra belongs to the genus Poncirus Raf. of Rutaceae. Since it was published， its taxonomic status has always been controversial. In Flora of China， P. polyandra was regarded as a Citrus hybrid （Poncirus polyandra）， and the genus Poncirus was included in the genus Citrus. In this study， we used three chloroplast DNA fragments （trnL-trnF， trnS-trnG， rbcL）， ITS and one single copy nuclear genes （Chr5） to construct phylogenetic trees to explore the taxonomic status of the genus Poncirus and P. polyandra. We sampled a total of 47 individuals from ten species， including P. polyandra and P. trifoliata of the genus Poncirus as well as eight other species of the genus Citrus by using Murraya exotica was used as the outgroup. The results were as follows： The maximum likelihood trees （ML） and Bayesian inference trees （BI） constructed by all data were basically identical in topological structure. The cpDNA results showed that all species were clustered into two clades： eight species of Citrus were clustered into one major clade， and P. polyandra and P. trifoliata were clustered into another major clade. Meanwhile， all individuals of P. polyandra and P. trifoliata were grouped into a monophyletic subclade respectively， supporting the independence of Poncirus and P. polyandra could exist independently; However， the results of two nuclear DNA fragments showed that two species of Poncirus and the eight species of Citrus clustered into a large clade， indicating that the genus Poncirus cannot be recognized independently. Moreover， nine individuals of P. polyandra were monophyletic， suggesting that P. polyandra was a genetically independent lineage. In summary， both chloroplast DNA data and nuclear DNA data supported that P. polyandra was an independent taxa， but nuclear DNA data from our study did not support the independence of Poncirus.

Key words：? Poncirus Raf， Poncirus polyandra， Citrus， phylogeny， phylogenetic position

枳屬（Poncirus Raf.），又名枸橘屬，屬下植物有枳（Poncirus trifoliata）和富民枳（P. polyandra）兩個種（方德秋，1993），原產(chǎn)于我國，是蕓香科（Rutaceae）柑橘亞科下的一屬，區(qū)別于柑橘、金柑等屬，主要分布于長江中游兩岸各省及淮河流域一帶，分布范圍較柑橘屬更廣。該屬在我國傳統(tǒng)醫(yī)藥上使用很早，早在李時珍《本草綱目》中有記載。近代中醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其藥用作用主要是因為存在一種枳苷的物質(zhì)（胡源祥等，2017a， b）。在生產(chǎn)上，枳屬植物是一種優(yōu)秀的柑橘矮化砧，抗逆性強(qiáng)。枳屬的劃分一直與枳的系統(tǒng)分類位置有密切關(guān)系，枳屬的研究曾歷經(jīng)三個階段：（1）枳屬的不認(rèn)可階段，在公元1178年韓彥直《橘錄》被稱作枸橘，1763年分類學(xué)家林奈把枳歸類于柑橘屬;（2）枳屬認(rèn)可階段，認(rèn)為枳屬區(qū)別于柑橘屬（Tomimatsu， 1968;Tomimatsu & Hashimoto， 1968）;（3）枳屬的分類存在爭議，2008年Flora of China修訂版中把枳屬歸類到柑橘屬（Zhang， 2008），但有些學(xué)者認(rèn)為枳屬區(qū)別于柑橘屬，并且是一種優(yōu)秀的種質(zhì)資源（Heo et al.2018;George & Lapointe， 2019）。

富民枳屬于蕓香科（Rutaceae）枳屬，是丁素琴等（1984）發(fā)表的一個新種，它是國家二級保護(hù)植物，分布于云南富民縣的特有種。富民枳是常綠小喬木，區(qū)別于枳的形態(tài)特征（武曉曉等，2018），分類地位備受爭議，作為枳屬的一個新種得到了葉片同工酶證據(jù)（Fang， 1993）、 SSR 標(biāo)記的高純合率（Pang et al.， 2003）及核型分析（劉利勤等，2007）的支持，但郭天池等（1996）認(rèn)為富民枳是一個天然枳橙類型。在當(dāng)?shù)馗幻耔壮Ｗ鳛樗幱弥参锸褂茫且环N珍貴的藥用資源，可以抑制新生血管形成，降低腫瘤細(xì)胞表達(dá)（胡源詳?shù)龋?017c）。由于人為因素的影響、原生地的過度放牧以及作為常綠觀賞植物的大量挖掘，富民枳已經(jīng)野外滅絕（邢定生，2008），于2009年被列入云南極小種群拯救計劃五個物種之一。但是富民枳的分類地位仍然沒有得到解決，2008年Flora of China修訂版中認(rèn)為富民枳是柑橘屬的一個雜交種（Poncirus × polyandra）（Zhang， 2008），而張珊珊等（2018）把富民枳作為一個獨立的種并進(jìn)行了遺傳多樣性的研究。

在形態(tài)界定物種存在爭議的情況下，可借助分子手段解決。目前，已發(fā)展起一系列的DNA分子標(biāo)記，如SSR （Simple Sequence Repeats，簡單重復(fù)序列）、ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，簡單重復(fù)序列間多態(tài)性）、SRAP （Sequence-Related Amplified Polymorphism，序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性）等被用來研究富民枳與其近緣屬植物間的親緣關(guān)系（龐小明等，2003;張連峰，2006;劉通，2014）。然而，DNA分子片段直接測序技術(shù)在國內(nèi)很多植物研究上均有報道（李映志， 2006），常見的有葉綠體DNA （cpDNA）片段（李小孟，2010）和核基因（nDNA）。因為旁系同源的存在，核基因報道較少，但nDNA作為植物遺傳物質(zhì)最重要的載體，且具雙親遺傳特性方面優(yōu)點，是一種理想的DNA分子標(biāo)記，常用于種屬分類關(guān)系的探究（成彩霞等，2018）。本研究利用母系遺傳的cpDNA和雙親遺傳的nDNA直接測序的方法，以期探究枳屬和富民枳的分類地位。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究共采集枳屬和柑橘屬植物的47份分子材料，其中包括9份栽培于中國科學(xué)院昆明植物研究所的富民枳新鮮植物葉片材料，這9株富民枳于1992年從富民枳的原生地富民縣大營鎮(zhèn)老青山冬瓜嶺引種（102.49465 E，25.22583 N，海拔2 180 m）;8份枳的新鮮植物葉片材料，其中2份來自中國科學(xué)院昆明植物研究所;3份紅河大翼橙低溫冷藏植物葉片材料（中國科學(xué)院昆明植物研究所資源室龔洵課題組）;6份枳橙的新鮮植物葉片材料;4份柚新鮮植物葉片材料;6份柑橘新鮮植物葉片材料;3份香櫞新鮮植物葉片材料;3份金柑新鮮植物葉片材料;2份箭葉橙新鮮植物葉片材料和3份宜昌橙新鮮植物葉片材料。另外采集1份九里香（Murraya exotica）新鮮植物葉片材料作為本研究的外類群。采集的新鮮葉片立即放入硅膠干燥，將干燥好的葉片在-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｖ参锊牧喜杉畔⒁姳?。

1.2 方法

采用改良的CTAB法從植物材料中提取總DNA （Doyle， 1991）。通過查閱文獻(xiàn)，從常用于植物系統(tǒng)學(xué)、群體遺傳學(xué)和保護(hù)生物學(xué)等的DNA分子片段中進(jìn)行篩選，共篩選到3個cpDNA片段和2個nDNA片段（唐政， 2014; 楊曉明， 2017），其引物信息見表2。對于目的條帶清晰，特異性好的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送昆明碩擎生物有限公司進(jìn)行雙向測序以保證測序的準(zhǔn)確性，測序使用與擴(kuò)增相同的引物，測序序列已上傳到NCBI，接受號為MN585512-MN585655和MN638942-MN639037。

1.3 數(shù)據(jù)分析

DNA分子片段經(jīng)過測序后，利用SEQMAN （Swindell & Plasterer， 1997）軟件進(jìn)行序列的編輯和拼接。然后將拼接好的序列用BioEdit ver. 7.0.4.1 （Hall， 1999）進(jìn)行序列的比對和手工校對。對于3個葉綠體DNA分子片段，利用PAUP ver. 4.0b10 （Swofford， 2003）軟件進(jìn)行序列聯(lián)合并進(jìn)行同質(zhì)性檢驗，若P>0.05則說明片段的一致性好，可以用于聯(lián)合分析。因為2個核基因（ITS和chr5）外顯子片段都存在雙峰的個體，且一致性檢驗P<0.05，因此，未將核基因進(jìn)行聯(lián)合分析。

以蕓香科九里香做為外類群，采用最大似然法（maximum likelihood，ML）和貝葉斯法（Bayesian inference，BI）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以進(jìn)行枳屬和富民枳的分類地位研究。ML分析所需模型及樹的構(gòu)建均在軟件MEGA ver. 5 （Tamra et al.， 2011）中執(zhí)行，樹的構(gòu)建選用Nearest-Neighbor-Interchange （NNI） 搜索方法， 支持率的估計采用1 000次重復(fù)分支上方的數(shù)字代表靴帶值（A）和后驗概率（B）。下同。

抽樣的靴帶分析。BI分析所需最佳堿基替代模型在軟件Jmodeltest ver. 2.3.1 （Darriba et al.， 2012）中計算，BI分析在軟件MrBayes ver. 3.1.2 （Ronquist & Huelsenbeck， 2003）中進(jìn)行，每一個馬爾可夫鏈從一個隨機(jī)的樹開始，運行106個循環(huán)，每100次循環(huán)取樣一次，支持率選用后驗概率（Posterior Probability， PP），利用軟件Figtree讀取最終的樹文件。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體聯(lián)合片段分析

所研究的葉綠體片段長度在類群間和個體間均一致，trnL-trnF的長度為948 bp，共檢測到16個多態(tài)位點，包括11個位點變異和5個插入/缺失;trnS-trnG的長度為806 bp，共檢測到44個多態(tài)位點，包括40個位點變異和4個插入/缺失;rbcL的長度為1 266 bp，共檢測到18個多態(tài)位點，包括9個位點變異和9個插入/缺失。將3個片段進(jìn)行同質(zhì)性檢驗并聯(lián)合，一致長度為3 020 bp。

基于最大似然法和貝葉斯法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示，構(gòu)建最大似然樹選用最佳模型為T92模型，貝葉斯分析選用TPMluf-Nei模型，最大似然樹和貝葉斯樹分支上方的數(shù)字分別代表靴帶值（Bootstrap value， BS）和后驗概率（PP）。兩種推導(dǎo)法構(gòu)建系統(tǒng)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)比較一致，內(nèi)類群的所有物種聚成兩大支且得到了較高的支持率，其中柑橘屬的8個物種聚為一大分支（BS=60; PP=0.959），枳屬的富民枳和枳聚為另一大分支（BS=98; PP=1），枳屬與柑橘屬的類群并沒有交叉，二者均是單系。其中在枳屬的這一分支里，富民枳的所有個體聚為一小單系分支，枳的所有個體聚為另一小單系分支，均得到了高支持率（BB=98， 83; PP=1， 0.924）。在柑橘屬的分支里，每個物種的所有個體都聚為一個小的單系分支，并不存在交叉。但兩種方法在對柑橘屬物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的處理上存在稍許差別，如紅河大翼橙的系統(tǒng)位置不同，最大似然樹顯示紅河大翼橙位于分支內(nèi)部位置，而貝葉斯樹顯示紅河大翼橙最早分化出來。兩種樹均顯示枳橙和香櫞聚為一支，隨后又與柚聚在一起，說明它們的親緣關(guān)系較近;金柑和宜昌橙聚在一支，說明二者具有較近的親緣關(guān)系。

2.2 ITS片段分析

ITS片段經(jīng)過整理剪切的一致長度為756 bp，共檢測到66個多態(tài)位點，包括63個位點變異和3個插入/缺失。構(gòu)建最大似然樹選取HKY+G+I為最佳模型，貝葉斯分析選用TIM3+G模型?；贗TS聯(lián)合片段構(gòu)建的最大似然樹和貝葉斯樹見圖2，ML樹和BI樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)并不一致，但兩種樹的結(jié)果均顯示富民枳和枳聚為一支（BS=54;PP=0.982），嵌套在柑橘屬的分支里，但富民枳和枳與柑橘屬的其他物種并沒有交叉。ML樹所得到的聚類關(guān)系支持率均較低，結(jié)果顯示柑橘最先分化出來，然后是紅河大翼橙、金柑、香櫞和宜昌橙，而四者呈并系關(guān)系（BS<50）;柚和枳橙聚為一支，然后二者又與箭葉橙聚在一起（BS=56）。BI樹所得到的聚類關(guān)系支持率均較高，結(jié)果顯示所有物種聚為三大支（PP=1），箭葉橙為一分支;富民枳、枳、紅河大翼橙、柑橘、香櫞、金柑和宜昌橙聚為一大分支（PP=0.994），其中富民枳與枳聚為一小單系分支（PP=0.982），另外5個柑橘屬植物聚為另一小單系分支，但它們呈并系關(guān)系（PP=0.986）;枳橙與柚聚為另一大分支（PP=0.522）。

2.3 單拷貝核基因Chr5分析

Chr5片段比對剪切后一致性長度為780 bp，共檢測到39個多態(tài)位點，全為位點變異，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3，其中ML樹構(gòu)建選擇TM93+I模型，BI樹的構(gòu)建模型為TIM1。基于Chr5片段構(gòu)建的ML樹和BI樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是一致的，結(jié)果見圖3。與ITS數(shù)據(jù)結(jié)果相似，富民枳和枳聚為一支嵌套在柑橘屬植物的分支里，但二者與柑橘屬的其他物種并沒有交叉，ML樹的支持率較低，BI樹的支持率較高。系統(tǒng)樹結(jié)果顯示紅河大翼橙最先分化出來（BS<50;PP=1），然后是宜昌橙（BS=65;PP=0.862），隨后枳橙、柚、香櫞、柑橘、箭葉橙和金柑聚為一支（BS=62;PP=0.516），最后與富民枳和枳的分支聚為一大分支（BS=62;PP=0.993）。

3 討論與結(jié)論

3.1 枳屬的分類地位

本研究以“枳屬”單獨存在為基礎(chǔ)，選擇枳屬的兩個種和柑橘屬的8個種為研究對象，利用3個cpDNA片段、ITS和1個核基因?qū)﹁讓俚南到y(tǒng)發(fā)育進(jìn)行研究。cpDNA的數(shù)據(jù)結(jié)果均一致支持枳屬為一單系，與柑橘屬的物種并無交叉，說明兩屬之間無基因交流。本研究結(jié)果和武曉曉等（2018）、楊曉明（2017）及Wu et al.（2018）的研究結(jié)果一致，枳屬能夠作為一個獨立的屬，而不應(yīng)將其歸并到柑橘屬中。但3個葉綠體聯(lián)合片段的ML樹和BI樹顯示柑橘屬物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系是不一致的，如紅河大翼橙的系統(tǒng)位置不同，ML樹顯示紅河大翼橙位于分支內(nèi)部位置，而BI樹顯示紅河大翼橙是最早分化出來的物種。這可能是由于3個葉綠體DNA分子片段信息位點不足，基于不同的方法推斷出來的結(jié)果存在沖突。

與cpDNA的研究結(jié)果不同的是ITS和Chr5的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示枳屬并不能與柑橘屬分開，而是嵌套在柑橘屬的分支里，說明兩個核DNA的數(shù)據(jù)并不支持枳屬能夠單獨成屬，而應(yīng)歸并在柑橘屬里，這與2008年Flora of China修訂版（Zhang， 2008）中對枳屬的處理是一致的，但與Wu et al.（2018）基于基因組數(shù)據(jù)的研究結(jié)果不一致。另外，這2個核DNA數(shù)據(jù)顯示柑橘屬8個物種的關(guān)系也不一致，比如紅河大翼橙，在ITS構(gòu)建的系統(tǒng)樹上處于內(nèi)部分支里，而在Chr5構(gòu)建的系統(tǒng)樹上顯示最早分化出來。不同核DNA分子片段數(shù)據(jù)揭示的結(jié)果不一致，可能是由于核基因的不完全譜系分選造成的，亦或它們受到的選擇壓力和進(jìn)化速率不一致造成的。另外，在核基因中往往存在重組現(xiàn)象，可能對物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系也會存在影響。

本研究中，不同類型的DNA分子片段數(shù)據(jù)在對枳屬和柑橘屬物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系解決上存在差異，cpDNA數(shù)據(jù)支持枳屬能夠獨立成屬，而核DNA數(shù)據(jù)顯示枳屬嵌套在柑橘屬里不能單獨成屬。因為質(zhì)體基因是母系遺傳的，而核基因是雙親遺傳的，質(zhì)體基因所擁有的Ne是核基因的1/4，Ne可以影響一個物種單倍型成為單系的速度（Moore， 1995）。因此，基于1個質(zhì)體基因物種的單倍型成為單系所需的時間是基于1個核基因所需時間的1/4，即質(zhì)體基因能更快地體現(xiàn)出一個物種的單倍型成為單系。可能在解決屬的分類地位時，葉綠體數(shù)據(jù)也能盡早體現(xiàn)出來。所以在本研究中，葉綠體數(shù)據(jù)能夠解決枳屬的分類地位，而兩個核DNA則不行。另外，根據(jù)Moore的觀點，在1個質(zhì)體基因能95%成功地解決一個物種是單系時，就需要用16或者40個核基因才能達(dá)到如此成功率。所以，想要解決一個屬或者物種的分類地位就需要采用更多的核基因，這也可能造成本研究中較少的核基因不能解決枳屬的分類地位。另外，葉綠體片段數(shù)據(jù)與核基因數(shù)據(jù)結(jié)果存在差異，也可能暗示枳屬雜交起源，這需要采用更多的核基因數(shù)據(jù)或從組學(xué)水平上進(jìn)行深入探究。

3.2 富民枳的分類地位

序列位點差異直觀反映各個研究材料之間基因?qū)哟紊系牟町愋?，這種研究方式是直觀有效的，這種方法在很多植物領(lǐng)域都有利用。本研究通過具有母系遺傳特性的3個葉綠體片段和具有雙親遺傳特性的核基因片段ITS和Chr5數(shù)據(jù)來研究富民枳的分類地位以及它與枳、紅河大翼橙、枳橙、柚、柑橘、香櫞、金柑、箭葉橙這些種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。基于ML法和BI法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均顯示富民枳的9個個體聚在一起，并未與其他任何物種有交叉，支持富民枳是一個遺傳上相對獨立的類群，而不支持Flora of China將其作為柑橘屬的一個雜交種的分類處理。因此，富民枳不是一個柑橘雜交種，而是為一個獨立“好種”，且與前人研究結(jié)果一致（吳興恩等， 2006;龔桂芝等， 2008）。本研究結(jié)果表明，雖然核DNA數(shù)據(jù)并不支持枳屬的成立，但是，無論葉綠體DNA數(shù)據(jù)還是核DNA數(shù)據(jù)均支持富民枳是一個獨立的物種，是一種優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源（張珊珊等，2018），具有重要的保護(hù)價值。

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（責(zé)任編輯 何永艷）