活血化瘀解毒法對(duì)OSF 患者GSK-3β、β-連環(huán)蛋白水平的影響及作用機(jī)制的研究

左巧娟，譚 勁，禹 潔，陳世娟，李 群，朱 萱

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)1.第一附屬醫(yī)院口腔科；2.科技處，湖南 長(zhǎng)沙410000）

口腔黏膜下纖維化（oral submucous fibrosis，OSF）屬于一種漸變性和炎癥性的黏膜纖維化慢性疾病，是世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）公認(rèn)的口腔癌前病變［1-2］?？谇火つは吕w維化患者的臨床癥狀有口腔黏膜無(wú)斑塊或纖維條索，扁平苔蘚充血、糜爛、有刺激性疼痛，有明顯的機(jī)械或化學(xué)因素刺激等?；颊咭坏┏霈F(xiàn)進(jìn)行性的張口受限的癥狀，其口腔內(nèi)的唇、舌、口底、咽等部位均可能受到累及，嚴(yán)重者病癥甚至?xí)_(dá)到患者的咽部，造成嚴(yán)重的侵襲［3，4］。由此可見(jiàn)，此病可侵犯口腔的任何部位，入侵性較強(qiáng)。首次發(fā)現(xiàn)此病的地方是20 世紀(jì)50 年代初期的印度，但在尼泊爾、泰國(guó)、馬來(lái)西亞、烏干達(dá)以及美國(guó)等也有相關(guān)病例的報(bào)道。我國(guó)湖南湘潭、臺(tái)灣地區(qū)也是本病的高發(fā)地區(qū)。目前看，眾多的西藥只能改善和緩解OSF 癥狀，未能根治此病。近年來(lái)，中醫(yī)藥治療OSF 取得了較好的療效，本文選取2018 年5 月～2019 年12 月本院收治的120 例OSF 患者，研究活血化瘀解毒法對(duì)OSF 患者的治療效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年5 月～2019 年12 月我院收治的120例OSF 患者，按照抽簽法分為常規(guī)治療組和活血化瘀解毒組，各60 例。常規(guī)治療組男性34 例，女性26例，平均年齡（34.1±3.6）歲，平均病程（3.4±5.5）周；活血化瘀解毒組男性37 例，女性23 例，平均年齡（32.7±5.2）歲，平均病程（1.9±3.7）周；兩組患者資料比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。本次研究患者及其家屬均知情，且均簽署了知情同意書(shū)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《口腔黏膜病學(xué)》中OSF 診斷標(biāo)準(zhǔn)；近1 個(gè)月未接受相關(guān)治療；患者年齡18～65 歲。

排除標(biāo)準(zhǔn)：血液系統(tǒng)疾??；意識(shí)障礙、認(rèn)知障礙患者；哺乳期或妊娠期；合并嚴(yán)重感染性疾病；資料不全患者。

1.2 方法

常規(guī)治療組在其口腔黏膜病變區(qū)兩側(cè)將1 mL曲安奈德（昆明積大制藥股份有限公司；生產(chǎn)批號(hào)：20160123；40 mg/mL）多次注射，每周兩次持續(xù)治療4 周?；钛鼋舛窘M使用活血化瘀解毒法進(jìn)行治療，方藥組成：當(dāng)歸15 g，紅花10 g，赤芍10 g，丹參15 g，玄參15 g，生地黃15 g，白花蛇舌草10 g，金銀花10 g。1 d 1 劑，分早晚溫服，連續(xù)服藥5 周。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察兩組治療前后的口腔黏膜病損面積、張口度、齦溝液及唾液中SFRP1 水平、中醫(yī)癥候評(píng)分、Wnt/β-catenin 信號(hào)通路蛋白表達(dá)量和臨床療效。

1.3.1 SFRP1 在齦溝液及唾液中的比較 使用ELISA 法檢測(cè)齦溝液及唾液中SFRP1 的水平，使用美國(guó)Proteintech 公司生產(chǎn)的Human S-100B ELI?SAKit 試劑，所有檢測(cè)操作根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：將血清置于室溫后，取出試劑盒，標(biāo)記酶標(biāo)板，制作標(biāo)準(zhǔn)品，以1∶2 的稀釋液稀釋樣品；在反應(yīng)孔上依次加入稀釋好的待測(cè)血清及標(biāo)準(zhǔn)品100 μL/孔，放置37℃恒溫孵育箱中濕育2 h；用專用洗滌液將反應(yīng)板清洗3 次后，加入抗體工作液（1∶100 倍稀釋后）100 μL /孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續(xù)清洗反應(yīng)板4 次后，在反應(yīng)孔內(nèi)加入TMB 溶液100 μL /孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min 后在將終止液加入反應(yīng)孔，將反應(yīng)孔放置酶標(biāo)儀上測(cè)量吸光度并繪制曲線，參照去曲線上的數(shù)值相應(yīng)得出樣本中SFRP1 的值。

1.3.2 中醫(yī)癥候評(píng)分比較 根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》記錄口腔黏膜發(fā)白發(fā)硬、口腔黏膜刺激痛、纖維條索的癥狀，按其癥狀程度分別為一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)分別計(jì)1、2、3 分，癥狀消失計(jì)0 分，并評(píng)價(jià)療效。

1.3.3 兩組治療前后Wnt/β-catenin 信號(hào)通路蛋白表達(dá)量 Western blot 法檢測(cè)GSK-3β、β-連環(huán)蛋白表達(dá)，并進(jìn)行組間比較。抽取兩組研究對(duì)象早晨空腹外周抗凝靜脈血6 mL，用Hanks 液進(jìn)行等倍稀釋，嚴(yán)格根據(jù)操作要求分離提取中性粒細(xì)胞，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×107，采用Western blot 法提取中性粒細(xì)胞全蛋白，接著通過(guò)BCA 試劑盒實(shí)施蛋白濃度定量，泳道上樣量均為20 μ g，然后電泳處理后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，加入抗體和發(fā)光處理后利用凝膠顯像儀進(jìn)行顯像，分析GSK-3β、β-連環(huán)蛋白條帶灰度值，以GAPDH 作為內(nèi)參蛋白。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)TGF-β1、IL-6 蛋白水平。

1.3.4 臨床療效比較 依據(jù)《中華口腔科學(xué)》對(duì)患者的治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)：（1）顯效：開(kāi)口度達(dá)到10 mm 以上，癥狀得到顯著緩解或消失，癥狀積分減少≥80%；（2）有效：開(kāi)口度在10 mm以內(nèi)，癥狀在一定程度上緩解，癥狀積分減少在40%～80%；（3）無(wú)效：癥狀毫無(wú)緩解，甚至加重，癥狀積分減少＜40%。總有效率=（顯效+有效）/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 口腔黏膜病損面積及張口度的比較

兩組治療前口腔黏膜病損面積及張口度對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組治療后張口度均大于治療前，口腔黏膜病損面積小于治療前（P＜0.05），且治療后活血化瘀解毒組張口度大于常規(guī)治療組，口腔黏膜病損面積小于常規(guī)治療組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組口腔黏膜病損面積及張口度的比較（n=60，±s）Tab 1 Comparison of lesion area and mouth opening de?gree of oral mucosa（n=60，±s）

表1 兩組口腔黏膜病損面積及張口度的比較（n=60，±s）Tab 1 Comparison of lesion area and mouth opening de?gree of oral mucosa（n=60，±s）

組別張口度（mm）治療前治療后口腔黏膜病損面積（cm2）治療前治療后常規(guī)治療組30.17±4.82 35.47±6.72 8.79±2.17 7.85±1.42活血化瘀解毒組t P 29.72±4.83 0.511 0.610 39.82±7.67 3.304 0.001 8.84±2.14 0.127 0.899 5.49±1.27 9.596 0.000

2.2 SFRP1 在齦溝液及唾液中的水平比較

兩組治療前SFRP1 在齦溝液及唾液中的水平對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組治療后SFRP1 在齦溝液及唾液中的水平均高于治療前（P＜0.05），且治療后活血化瘀解毒組患者SFRP1 在齦溝液及唾液中的水平高于常規(guī)治療組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 中醫(yī)癥候評(píng)分比較

兩組治療前中醫(yī)癥候評(píng)分對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組治療后中醫(yī)癥候評(píng)分均低于治療前（P＜0.05），且治療后活血化瘀解毒組中醫(yī)癥候口腔黏膜刺激痛、口腔黏膜發(fā)白發(fā)硬、纖維條索評(píng)分均低于常規(guī)治療組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 兩組SFRP1 在齦溝液及唾液中的水平比較（n=60，±s）Tab 2 Comparison of SFRP1 levels in gingival crevicular fluid and saliva（n=60，±s）

表2 兩組SFRP1 在齦溝液及唾液中的水平比較（n=60，±s）Tab 2 Comparison of SFRP1 levels in gingival crevicular fluid and saliva（n=60，±s）

組別齦溝液唾液治療后115.97±24.72 138.42±31.75 4.322 0.000常規(guī)治療組活血化瘀解毒組t P治療前89.04±24.35 88.45±24.17 0.133 0.894治療前97.35±23.16 96.84±24.81 0.116 0.908治療后127.48±30.27 141.74±31.93 2.511 0.013

表3 兩組中醫(yī)癥候評(píng)分比較（n=60，±s）Tab 3 Comparison of TCM syndrome score（n=60，±s）

表3 兩組中醫(yī)癥候評(píng)分比較（n=60，±s）Tab 3 Comparison of TCM syndrome score（n=60，±s）

組別口腔黏膜刺激痛治療前9.48±2.17 9.40±2.21 0.201 0.842治療后6.48±1.19 3.69±1.17 12.950 0.000口腔黏膜發(fā)白發(fā)硬治療前7.39±1.97 7.48±1.86 0.257 0.797治療后5.17±0.95 3.78±0.68 9.216 0.000常規(guī)治療組活血化瘀解毒組t P纖維條索治療前10.85±2.45 10.76±2.48 0.200 0.842治療后7.52±1.59 4.67±1.38 10.490 0.000

2.4 兩組治療前后Wnt/β-catenin 信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較

兩組治療前TGF-β1、IL-6、GSK-3β、β-連環(huán)蛋白表達(dá)對(duì)比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；兩組治 療 后TGF-β1、IL-6、GSK-3β、β-連 環(huán) 蛋 白 表達(dá)均低于治療前（P＜0.05），且治療后活血化瘀解 毒 組TGF-β1、IL-6、GSK-3β、β-連 環(huán) 蛋 白 表達(dá)低于常規(guī)治療組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 兩組治療前后Wnt/β-catenin 信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較（n=60，±s）Tab 4 Comparison of Wnt/β-catenin signaling pathway protein expression between the two groups before and after treatment（n=60，±s）

表4 兩組治療前后Wnt/β-catenin 信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較（n=60，±s）Tab 4 Comparison of Wnt/β-catenin signaling pathway protein expression between the two groups before and after treatment（n=60，±s）

組別常規(guī)治療組活血化瘀解毒組GSK-3β（g/L）治療前3.59±0.78 3.51±0.74 0.576 0.565治療后2.49±0.81 1.42±0.37 9.307 0.000 β-catenin（g/L）治療前4.38±0.79 4.30±0.75 0.568 0.571治療后2.34±0.84 1.12±0.27 10.710 0.000 TGF-β1（μg/L）治療前25.94±6.49 25.79±6.58 0.126 0.902治療后13.17±3.57 6.49±2.02 12.610 0.000 t P IL-6（pg/mL）治療前26.89±6.48 26.84±6.42 0.483 0.966治療后16.58±4.18 8.19±2.91 12.760 0.000

2.5 臨床療效比較

活血化瘀解毒組臨床治療總有效率高于常規(guī)治療組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 兩組臨床療效比較［n=60，n（%）］Tab 5 Comparison of clinical efficacy［n=60，n（%）］

3 討論

OSF 是一種具有慢性、進(jìn)行性、隱匿性等特征的口腔黏膜斑紋類(lèi)疾病，且OSF 可進(jìn)一步癌變，是國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)者們熱點(diǎn)研究課題［5］。進(jìn)食刺激性食物、嚼食檳榔、免疫、營(yíng)養(yǎng)、遺傳等是OSF 誘因。本病的高發(fā)人群為20～50 歲的青壯年，無(wú)明顯性別差異［6］。但在不同的國(guó)家和地區(qū)中，男、女患者的比例又在一定程度上有所不同［7］。但也有研究顯示，OSF 趨向男性化，可能與男性患者嚼食檳榔和抽煙喝酒等相關(guān)。我國(guó)男性患上口腔黏膜下纖維化的幾率大于女性［8］。在中國(guó)的醫(yī)學(xué)古籍中并沒(méi)有OSF 的相關(guān)記載，但在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中有與此病癥狀相似的疾病，根據(jù)其臨床癥狀及表現(xiàn)，將其歸納為中醫(yī)的“血瘀”、“積聚”等病證范疇。根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，淤是本病中醫(yī)病機(jī)中的特點(diǎn)之一，治以活血養(yǎng)血、清熱解毒為主，療效顯著［9］。

在中醫(yī)學(xué)看來(lái)本病的患者因長(zhǎng)時(shí)間食用辛辣燥熱的食品，進(jìn)而導(dǎo)致濕熱毒邪入侵體內(nèi)，蘊(yùn)藏在人體脈絡(luò)中，阻塞“三道（指谷道、氣道、水道）”、“兩路（指龍路、火路）”，導(dǎo)致局部經(jīng)絡(luò)氣血運(yùn)行不通暢，淤毒停駐在體內(nèi)而發(fā)病，因此，治療時(shí)采用活血養(yǎng)血、清熱解毒的方法［10］。藥方中當(dāng)歸的功效是：活血補(bǔ)血和止痛調(diào)經(jīng)；紅花的功效是：通經(jīng)活血；赤芍的功效是：涼血活血和止痛散瘀；丹參的功效是：活血化瘀解毒、通經(jīng)止痛；若將此四味藥放在一起，則可以起到加強(qiáng)活血的功效和養(yǎng)血通脈的作用。生地黃的功效是：涼血和營(yíng)、養(yǎng)陰生津；白花蛇舌草的功效是：清熱解毒散淤、散結(jié)鎮(zhèn)痛；金銀花的功效是：清熱解毒、清解血毒，其性輕、芬香透達(dá) 又 可 祛 邪 外 出［11，12］。在 臨 癥 治 療 時(shí)，可 以 根據(jù)患者淤、毒的程度，酌情加適量的蟲(chóng)類(lèi)藥物起到破血行氣、化痰散結(jié)、走竄通達(dá)的特性，或者加強(qiáng)行氣止痛的功效，這樣的話效果會(huì)更加理想［13-15］。在本文研究中，活血化瘀解毒法可有效地改善口腔黏膜病損面積、張口度、Wnt/β-catenin 信號(hào)通路蛋白表達(dá)量等各項(xiàng)指標(biāo)，緩解患者口腔黏膜的疼痛感和受損面積，達(dá)到改善患者機(jī)體免疫功能狀態(tài)，阻止纖維化的進(jìn)程。治療以外的時(shí)間可使用開(kāi)口器、壓舌板等加強(qiáng)張口訓(xùn)練，每天早中晚飯前各一次，每次5 min。

在多種纖維化的疾病中TGF-β1 對(duì)促進(jìn)纖維化有著重要作用，而IL-6 是種多功能細(xì)胞因子可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞成熟，也可阻止機(jī)體炎癥［16，17］。 Wnt/β -catenin 通 路 包 括GSK-3β、β -catenin 兩個(gè)蛋白因子，在Wnt 通路中各司其職。在正常情況下，Wnt 通路是沉默的，小部分βcatenin 存于細(xì)胞質(zhì)中，絕大部分在細(xì)胞膜處與E-cad 形成復(fù)合物，對(duì)細(xì)胞的黏附和遷移其作用［18］。當(dāng)Wnt 通路被激活時(shí)，一系列的分子事件 則 會(huì) 導(dǎo) 致β-catenin 增 多［19］。β-catenin 進(jìn) 入 細(xì)胞核與其他因子相結(jié)合形成核內(nèi)復(fù)合物［20］。在本文研究中，治療前兩組患者的TGF-β1、IL-6、GSK-3β、β-catenin 表 達(dá) 均 較 高，此 時(shí)Wnt 通路活躍，但在使用活血化瘀解毒法治療后TGFβ1、IL-6、GSK-3β、β-catenin 表 達(dá) 均 在 一 定 程 度上降低，中止了Wnt 通路的活躍，改善炎性因子水平，纖維蛋白原降低，張口度增加，患者口腔黏膜病損面積減小，效果顯著。

綜上所述，活血化瘀解毒法可通過(guò)作用于Wnt/β-catenin 信 號(hào) 通 路，調(diào) 控TGF-β1、IL-6、GSK-3β、β-連環(huán)蛋白的表達(dá)，改善口腔黏膜下纖維化患者臨床癥狀，緩解機(jī)體炎癥，減輕疼痛，效果顯著。