成纖維細胞生長因子21對腦缺血再灌注大鼠腦組織病理損傷和氧化應激的影響

張 鋒，侯 君，付良姣，袁 丹，崔 浩

近年來，隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展和人們生活水平的提高，缺血性腦血管疾病已成為威脅全球人類健康的重要因素[1]。缺血性腦血管疾病主要分為短暫性腦缺血發(fā)作和腦梗死，多數(shù)缺血性腦血管疾病病人無任何先兆癥狀[2]，具有高發(fā)生率的特點，需要新型有效療法預防和治療高危性疾病。成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)是成纖維細胞生長因子家族成員之一，是由脂肪組織、胰腺和肝臟分泌的一種多功能蛋白[3]。FGF21與肝素具有結合力，可通過血腦屏障[4]，證實FGF21可治療缺血性腦血管疾病。已有研究表明，大鼠大腦中動脈閉塞后，腹腔注射外源性FGF21可明顯減小腦梗死面積，改善運動神經(jīng)功能[5]。但FGF21對腦缺血再灌注損傷的作用機制尚不明確。本研究旨在探討FGF21對腦缺血再灌注大鼠腦組織病理損傷和氧化應激的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 50只雄性SD大鼠購自常州卡文斯實驗動物有限公司，7周齡，體重(200±10)g，許可證號：SCXK(蘇)2016-0010。置于溫度(22±1)℃和光控(2001 ux，12 h光暗循環(huán))條件下常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.2 實驗藥物和主要試劑 FGF21(CYT-474)購自美國BioVision公司；TTC染液(D025-1-3)、蘇木精-伊紅染液(D006-1-1)、丙二醛(MDA)試劑盒(A003-1-2)、總超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(A001-3-2)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(A020-2-2)購自南京建成生物工程研究所；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(C1091)購自上海碧云天生物技術研究所；Anti神經(jīng)生長因子(NGF，ab6199)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF，ab226843)、Caspase-3(ab13847)、Caspase-8(ab25901)購自美國Abcam公司。

1.3 動物模型建立與分組 將所有大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組和FGF21低劑量組、FGF21中劑量組、FGF21高劑量組。采用線栓法[6]建立大鼠腦缺血再灌注模型：采用10%水合氯醛溶液進行麻醉大鼠，仰臥固定于手術臺，于頸部正中剪開切口，暴露頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，結扎頸外動脈，剪開頸總動脈插入線栓，插入深度18～20 mm，2 h后取出，血管復位。對照組僅分離動脈，縫合切口。FGF21低劑量、FGF21中劑量、FGF21高劑量組腹腔注射FGF21劑量分別為1 mg/kg、2 mg/kg、5 mg/kg[7]，對照組和模型組注射等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)21 d。大鼠向一側移動，提尾對側前肢內收，表明模型建立成功。腦缺血再灌注模型成功率超過80%，若出現(xiàn)術后死亡，以同窩系大鼠配齊。模型建立21 d后處死各組大鼠，干濕法檢測腦含水量，并根據(jù)Zea Longa評分標準[8]進行神經(jīng)損傷評分。

1.4 TTC染色 按照染液說明書，將新鮮腦組織切片置于裝有TTC染液的培養(yǎng)皿中，37 ℃避光孵育30 min，將組織表面多余染液沖洗掉，拍照并觀察樣本顏色變化，切片顯示非梗死區(qū)呈玫瑰紅色，梗死區(qū)組織發(fā)白，紅色區(qū)與灰色區(qū)之間為缺血區(qū)，計算梗死面積比例。

1.5 蘇木精-伊紅染色 取各組大鼠腦組織石蠟包埋切片，采用蘇木精-伊紅染液，將石蠟切片脫蠟，蒸餾水潤濕組織，核染液染色5 min，水洗5 s，漿染液染色30 s，水洗后，濾紙吸干，無水乙醇脫水2次后封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.6 TUNEL染色 大鼠腦組織切片采用二甲苯浸洗2次脫蠟，每次5 min，梯度乙醇脫水。采用蛋白酶K工作液在37 ℃下封閉20 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗兩次。每個切片樣本均加入50 μL TUNEL反應液，37 ℃閉光反應60 min。使用DAPI復染10 min后在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 免疫印跡法(Western Blotting)檢測 收集各組大鼠腦組織細胞并在冰上溶解25 min，以12 000 r/min離心10 min，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，使用BCA試劑盒測定蛋白質含量。提取等量蛋白質樣品(20 mg)，100 ℃條件下變性5 min。之后使用SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉移至PVDF膜，4 ℃條件下加入相應一抗并孵育過夜、清洗，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，孵育2 h，之后加入發(fā)光液，曝光處理。Image J軟件統(tǒng)計灰度值。

1.8 氧化應激指標 根據(jù)試劑盒說明書，采用酶標儀測定總SOD、LDH含量在450 nm處吸光度值；采用可見分光光度計測定MDA含量在532 nm處吸光度值。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；多組間及進一步兩兩比較采用Wilcoxon秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠腦含水量、神經(jīng)損傷評分比較 與對照組比較，模型組腦含水量、神經(jīng)損傷評分均升高(P<0.05)。與模型組比較，F(xiàn)GF21中劑量組、FGF21高劑量組腦含水量、神經(jīng)損傷評分均降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠腦含水量、神經(jīng)損傷評分比較(x±s)

2.2 各組腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積比較 通過TTC染色檢測各組大鼠腦梗死面積。與對照組相較，模型組大鼠腦梗死面積增加(P<0.05)；與模型組比較，F(xiàn)GF21中劑量組、FGF21高劑量組大鼠腦梗死面積縮小(P<0.05)。詳見圖1。

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.3 各組大鼠腦組織病理損傷比較 蘇木精-伊紅染色顯示各組大鼠腦組織病理損傷程度，對照組結構清晰，細胞排列整齊、致密，形態(tài)正常；模型組神經(jīng)細胞變形萎縮，胞體深染，腦組織紋理紊亂，呈明顯病理損傷；FGF21各給藥組較模型組腦組織病理損傷程度有所減輕，細胞排列較整齊。詳見圖2。

圖2 FGF21對腦缺血再灌注大鼠腦組織病理損傷的影響

2.4 各組大鼠NGF、BDNF蛋白表達水平比較 Western Blotting顯示各組大鼠NGF、BDNF蛋白表達水平。與對照組比較，模型組大鼠NGF、BDNF蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組比較，F(xiàn)GF21中劑量組、FGF21高劑量組大鼠NGF、BDNF蛋白水平降低(P<0.05)。詳見圖3。

與對照組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.5 各組大鼠神經(jīng)元細胞凋亡率比較 TUNEL染色顯示各組大鼠神經(jīng)元細胞凋亡情況。與對照組比較，模型組大鼠神經(jīng)元細胞凋亡率升高(P<0.05)；與模型組比較，F(xiàn)GF21中劑量組、FGF21高劑量組大鼠神經(jīng)元細胞凋亡率降低(P<0.05)。詳見圖4。

與對照組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.6 各組大鼠Caspase-3、Caspase-8蛋白表達水平比較 Western Blotting檢測各組大鼠Caspase-3、Caspase-8蛋白表達水平。與對照組比較，模型組大鼠Caspase-3、Caspase-8蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組比較，F(xiàn)GF21中劑量組、FGF21高劑量組大鼠Caspase-3、Caspase-8蛋白水平顯著降低(P<0.05)。詳見圖5。

與對照組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.7 各組大鼠SOD、MDA和LDH含量比較 與對照組比較，模型組大鼠SOD含量降低(P<0.05)，MDA、LDH含量升高(P<0.05)；與模型組比較，F(xiàn)GF21中劑量組、FGF21高劑量組大鼠SOD含量升高(P<0.05)，MDA、LDH含量降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠SOD、MDA和LDH含量比較

3 討 論

隨著人們生活質量提高，老齡化進程加速，缺血性腦血管疾病發(fā)病率逐年升高，由于高發(fā)病率、致殘率、病死率和復發(fā)率，給病人和家庭帶來沉重的經(jīng)濟和精神負擔。缺血性腦血管疾病治療最佳時機為急性期，但傳統(tǒng)藥物治療常難以取得理想療效。相關研究表明，NGF通過抗凋亡、促進神經(jīng)再生、促進血管再生、減輕神經(jīng)炎癥、修復血腦屏障、調節(jié)代謝對缺血性腦血管疾病發(fā)揮保護作用[9]。

腦出血后周圍腦組織產(chǎn)生水腫，造成神經(jīng)功能損傷，而腦水腫產(chǎn)生是由于血腦屏障破壞、微血管通透性增加造成的[10]。血腦屏障破壞是腦缺血再灌注后引發(fā)腦損傷的重要病理生理基礎。血腦屏障通透性增加引起腦水腫，導致顱內壓升高并導致死亡[11]。有研究證實FGF21可通過血腦屏障[12]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21可降低腦缺血再灌注大鼠腦含水量和神經(jīng)損傷評分。提示FGF21可通過血腦屏障進入腦內發(fā)揮平衡調控作用，保護血腦屏障，從而抑制腦水腫。

NGF廣泛分布于外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌及腺體，在胚胎發(fā)育、免疫調節(jié)、造血等方面具有重要的作用[13]。由于腦缺血再灌注發(fā)生后神經(jīng)功能受到損害，神經(jīng)元細胞大量凋亡，促進神經(jīng)元再生及神經(jīng)功能恢復是治療腦缺血再灌注損傷的重要方式[14]。由于NGF在腦組織中無法維持理想濃度，直接給藥NGF難以發(fā)揮穩(wěn)定的生物學效應，因此，調控NGF表達有助于神經(jīng)元恢復。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員，通過與相應受體絡氨酸激酶B結合調節(jié)胚胎神經(jīng)元生長、發(fā)育、誘導分化及突觸連接，BDNF表達降低與海馬等認知功能相關腦區(qū)結構紊亂及功能連接異常有關[15]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21可降低腦缺血再灌注大鼠NGF、BDNF蛋白表達水平。提示FGF21可改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元損傷。

凋亡在腦缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮重要作用，抑制神經(jīng)元細胞凋亡可減輕腦缺血再灌注損傷[16]。Caspase-8是凋亡途徑發(fā)生的主要誘導因子，活化后可激活下游幾乎所有的Caspase酶[17]。Caspase-3激活后是不可逆的，反之激活Caspase-3，形成正反饋，促進細胞凋亡。相關研究表明，降低Caspase-8表達可能誘導神經(jīng)元細胞凋亡[18]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21可降低腦缺血再灌注大鼠Caspase-3、Caspase-8蛋白表達水平。提示FGF21可抑制腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元細胞凋亡。

機體氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡被破壞，形成的氧化應激狀態(tài)是腦缺血再灌注損傷的關鍵機制[19]。SOD、MDA作為抗氧化物酶，可清除細胞活性氧，具有保護細胞免受氧化損傷的作用，與LDH均是常見的檢測氧化應激水平指標[20]。Yang等[5]研究發(fā)現(xiàn)在缺血后再灌注大鼠模型中，F(xiàn)GF21通過激活ERK1/2及PI3K/Akt信號通路，降低氧化應激，保護和修復缺血再灌注后受損神經(jīng)元。本研究結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21可升高腦缺血再灌注大鼠SOD含量，降低MDA、LDH含量。提示FGF21通過調節(jié)氧化應激發(fā)揮改善腦缺血再灌注大鼠腦組織損傷的作用。

綜上所述，通過構建腦缺血再灌注大鼠模型，使用FGF21對模型大鼠進行干預，結果發(fā)現(xiàn)FGF21通過抑制腦水腫，改善病理損傷，抑制神經(jīng)元細胞凋亡，調節(jié)氧化應激，對模型大鼠發(fā)揮保護作用。