小麥籽粒植酸含量聚類及相關(guān)基因位點研究

陳廣鳳，李冬梅，鄧志英，馮建英，鄭世英，鄭 芳，吳秀芬，田紀(jì)春?

（1.德州學(xué)院 生態(tài)與資源環(huán)境學(xué)院，山東 德州 253000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，小麥品質(zhì)育種研究室，作物生物學(xué)國家重點實驗室，山東 泰安 271018）

小麥種質(zhì)資源是小麥育種的主要親本來源，是培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高抗小麥新品種的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平進(jìn)一步提高，健康和營養(yǎng)已成為近十年我國小麥品質(zhì)研究的主題，培育特色功能性小麥新品種是小麥育種專家近幾年來的重要育種目標(biāo)。

目前，微量營養(yǎng)元素鐵、鋅等缺乏造成的營養(yǎng)不良非常嚴(yán)重。全世界約20億人患有不同程度的貧血，其中約12%由缺鐵所致，我國的缺鐵性貧血發(fā)病率為20%左右，貧困地區(qū)兒童和孕婦則高達(dá)45%和35%[1]。小麥?zhǔn)俏覈狈降貐^(qū)的主要糧食作物，提高人體對小麥籽粒中礦物質(zhì)元素鐵、鋅等的吸收利用，對于解決我國人民由于鐵、鋅等元素含量攝入不足造成的健康問題具有重要意義[2-3]。影響鐵、鋅等生物有效性的限制性因子包括植酸、纖維素、丹寧和重金屬等，以植酸最為重要[4-5]。小麥籽粒中植酸含量較為豐富，并且通過與礦物質(zhì)元素鐵、鋅等正二價金屬離子結(jié)合，形成螯合態(tài)植酸鹽，顯著降低人體對鐵、鋅等的吸收利用[6-7]。小麥種質(zhì)資源是選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高抗小麥新品種的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，小麥籽粒中植酸含量較為豐富，品種間籽粒植酸含量存在顯著差異[8-9]，并且含量受遺傳因素和環(huán)境條件的共同作用[10]。因此，對小麥種質(zhì)資源的深入研究，不僅能提高所選用育種材料的目標(biāo)性，而且有利于提高育種科學(xué)預(yù)見性。自1921年Mellanby首次提出植酸對營養(yǎng)的影響以來，植酸與營養(yǎng)的關(guān)系一直是植酸研究的熱點[11]。對其研究主要集中在低植酸玉米、大麥和水稻的研究，以期培育兼具營養(yǎng)和環(huán)保功能的新型低植酸作物[12-13]。李穎睿等[10]、吳澎等[14]和Liu等[8]曾對我國的地方品種和河南、山東、陜西、江蘇和四川等少數(shù)地區(qū)的小麥品種進(jìn)行了植酸含量分析。目前國內(nèi)外對小麥中植酸的研究主要側(cè)重于植酸對小麥生理功能的影響、植酸的抗?fàn)I養(yǎng)效應(yīng)、植酸對人和動物的影響和植酸的工業(yè)應(yīng)用等方面[13]。

到目前為止，在遺傳方面，關(guān)于小麥籽粒植酸含量的報導(dǎo)較少。何秋怡等[15]利用重組自交系群體定位到2個與植酸含量相關(guān)的QTL位點，分布在3B和3D染色體上。凡迪等[16]利用小麥重組自交系群體定位到 6個與籽粒植酸含量相關(guān)的位點，分布于 1B、2A、2B 和 6B 染色體上。總體來說，有關(guān)植酸含量分析的資料十分有限，中國冬麥區(qū)主要品種（系）的植酸含量尚不清楚。

本研究以中國冬麥區(qū)共 205份（包括 20世紀(jì)80年代以來的推廣品種或骨干親本 132 和高代品系73份）小麥種質(zhì)資源為研究材料，測定其植酸含量進(jìn)行聚類分析，并定位解析其單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記關(guān)聯(lián)位點，篩選出低植酸和高植酸種質(zhì)資源，為中國冬麥區(qū)低值酸小麥品質(zhì)育種提供優(yōu)良的育種材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

205份供試材料，包括中國冬麥區(qū)20世紀(jì)80年代以來的推廣品種或骨干親本132份和高代品系73份，其中高代品系全部來自中國山東省。于2016和2017年度將供試材料種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗農(nóng)場，每份材料種3行，2次重復(fù)，行長2 m，均勻播種70粒，行間距25 cm。常規(guī)田間管理，生長期間沒有發(fā)生嚴(yán)重病蟲害和倒伏。

高通量組織研磨機(jī)，SPEX GENO 2010 GRINDER：美國SPEX Sample Prep公司；酶標(biāo)儀，SPECTRA max PLUS384：北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 表型鑒定

種子收獲后，曬干儲存于種子庫中。試驗時取每個小區(qū)的種子分別測定。用高通量組織研磨機(jī)磨粉。按 Chen等[17]的方法測定植酸含量，并適當(dāng)改進(jìn)。將30 mg全粉置于1.5 mL離心管中，加入0.4 mol/L HCl 1 mL和15%的TCA提取液，室溫下振蕩3 h，再以2 000×g離心10 min，然后取 50 μL上清液，置于 1.5 mL離心管中（內(nèi)裝36.3 mmol/L NaOH 550 μL）；加入 200 μL 顯色液（含0.03%氯化鐵，0.3%磺基水楊酸），反應(yīng)后取200 μL溶液，用酶標(biāo)儀在500 nm下讀數(shù)，測定植酸含量。

1.2.2 DNA提取和全基因組90k SNP芯片分型

參照略有改動的 Triticarte Pty.Ltd（http://www.triticarte.com.au/）方法提取供試材料群體DNA，用0.8%瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量和濃度。委托美國加利弗尼亞大學(xué)戴維斯分校植物科學(xué)系生物技術(shù)檢測中心，使用美國 Illumina公司和美國堪薩斯州立大學(xué)共同開發(fā)的小麥90k基因芯片（81 587個SNP）進(jìn)行供試群體DNA的基因分型，利用 GenomeStudio 軟件讀取分型數(shù)據(jù)并以文本文件形式導(dǎo)出保存。用PLINK v1.07對獲得的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，剔除檢出率小于80%和低頻基因頻率小于 5%的 SNP標(biāo)記，最終獲得24 355個SNP用于植酸含量關(guān)聯(lián)分析。

利用 Wang等[18]對 6個 DH遺傳群體（BTSchomburgk AUS33384、Young AUS33414、Chara Glenlea、W7984×Opata M85、Sundor AUS30604和Westonia Kauz）進(jìn)行圖譜整合的位點信息，獲得本研究群體 SNP 位點遺傳信息（表 1）及整合復(fù)合遺傳圖譜[19]。

1.2.3 性狀和標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

應(yīng)用TASSEL 3.0軟件（http://www.maizegenetics.net/）中的MLM（mixed linear model）進(jìn)行性狀和標(biāo)記之間的關(guān)聯(lián)分析。利用Structure 2.3.1軟件計算Q值，用TASSEL 3.0軟件計算Kinship值，對群體結(jié)構(gòu)和基因型過濾后，運(yùn)行 MLM_Q+K模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，當(dāng)標(biāo)記的P≤0.001時認(rèn)為標(biāo)記與性狀存在關(guān)聯(lián)。

1.3 表型數(shù)據(jù)處理

采用 SAS（Statistical Analysis System）8.0 軟件，將植酸含量數(shù)據(jù)分別按年度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，以歐氏距離為標(biāo)準(zhǔn)，按 Ward 類平方和法分別對品種進(jìn)行聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 205份種質(zhì)資源小麥的植酸含量

兩個種植年度環(huán)境植酸含量均值分別為4.99 g/kg和3.31 g/kg，變幅分別為17.90 g/kg和10.20 g/kg。結(jié)果表明，供試群體植酸含量變異范圍較大，偏度和峰度絕對值接近 1，近似符合正態(tài)分布，表明植酸含量屬于數(shù)量性狀，通過品種篩選降低籽粒植酸含量的潛力較大（表2）。

表2 供試群體小麥面粉植酸含量表型變異Table 2 Phenotypic variations of Phytic acid content in the wheat population

2.2 聚類分析

將供試群體所有品種的植酸含量數(shù)據(jù)按年度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，在決定系數(shù)（R2）為 85%水平將供試群體聚為6類（表3）。6類間植酸含量差異均達(dá)到極顯著水平。其中，第2和第3類的品種數(shù)量較少（分別包括3個和2個品種），其次是第1類（包括15個品種）、第5類和第6類（分別包括24個和37個品種），第4類品種數(shù)量最多（包括124個品種）。第3類品種的平均植酸含量最高，為18.35 g/kg，其次是第2、1、5和6類，分別是15.35 g/kg、12.71 g/kg、8.10 g/kg 和 6.19 g/kg。第4類品種的平均植酸含量最低，為2.34 g/kg，顯著低于其他5類。73個高代育種品系，除第2和3類沒有分布之外，其它各類中都有均勻分布。

表3 205份小麥種質(zhì)資源植酸含量聚類分析Table 3 Cluster of 205 cultivars based on Phytic acid content

第4類品種數(shù)量最多，包括124個品種，占群體百分比為60.49%，且平均植酸含量最低，為2.34 g/kg，表明該種質(zhì)群體絕大多數(shù)品種植酸含量較低。并且第四類品種（系）變幅較小，在低植酸含量育種中具有較高的利用價值。其中，132個推廣品種或骨干親本中，B54、B40、B86和B126植酸含量最低，有可能成為重要的育種親本，在低植酸含量小麥品質(zhì)育種中發(fā)揮作用。高代品系 B131、B141、B181和 B149植酸含量最低，結(jié)合品系優(yōu)異性狀，有可能選育出低值酸含量功能性小麥新品種。

2.3 植酸含量全基因組關(guān)聯(lián)位點

兩個種植年度環(huán)境，共檢測到36個與面粉植酸含量相關(guān)聯(lián)的顯著關(guān)聯(lián)位點（P＜0.001），分布在2B、3A、3B、3D、6A和 6B染色體上，單個關(guān)聯(lián)位點表型變異貢獻(xiàn)率為 5.73%～9.69%（表4，圖1）。通過TASSELV3.0 軟件分析，獲得2個環(huán)境下面粉植酸含量全基因組關(guān)聯(lián)分析的QQ圖（圖2），關(guān)聯(lián)群體的群體結(jié)構(gòu)得到了較好控制。E1環(huán)境檢測到24個關(guān)聯(lián)位點，其中，22個位點集中在3A染色體 85-91區(qū)段內(nèi)，說明這個此區(qū)段內(nèi)可能存在控制小麥面粉植酸含量的重要基因。另外兩個位點分別分布在染色體3B和3D上，3D染色體上位點，Tdurum_contig35799_208，達(dá)到極顯著關(guān)聯(lián)水平（2.27×10-5）。E2環(huán)境檢測到12個關(guān)聯(lián)位點，分布在2B、3B、6A和6B染色體上，其中，4個位點集中在3B染色體同一位置，各有3個位點分別集中在6A和6B的同一位置上，說明染色體上這些區(qū)段是控制小麥籽粒植酸含量基因的重要區(qū)段。

表4 植酸含量關(guān)聯(lián)位點及其對表型變異的貢獻(xiàn)率（R2）Table 4 Loci associated with Phytic acid content and percentage of phenotypic variation explained (R2)

圖1 植酸含量全基因組關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖Fig.1 Manhattan plot for Phytic acid content in two environments

圖2 植酸含量全基因組關(guān)聯(lián)分析QQ圖Fig.2 Quantile-quantile plot for Phytic acid content in two environments

2.4 關(guān)聯(lián)位點優(yōu)異等位變異

兩個種植年度環(huán)境中共檢測到36個關(guān)聯(lián)位點，其攜帶不同等位變異品種的植酸含量表型差值為 0～0.98 g/kg。其中，不同等位變異品種的表型差值達(dá)到顯著性差異水平的位點共25個，E1環(huán)境19個位點，E2環(huán)境 6個位點，品種間表型差值為0.33～0.98 g/kg（表5）。在E1環(huán)境檢測到的位點Tdurum_contig35799_208對低植酸含量效應(yīng)最大，差值為0.98 g/kg，該位點的堿基G相對于T為優(yōu)異等位變異。此外，E2環(huán)境中的優(yōu)異等位變異Excalibur_c96134_152-C、Excalibur_c96134_182-T和Tdurum_contig43538_1687-A對低植酸含量效應(yīng)較大。

表5 植酸含量關(guān)聯(lián)位點等位變異表型Table 5 Phenotypic effect of allelic for Phytic acid content loci

續(xù)表5

3 討論

對我國76份小麥地方品種和 62 份來自黃淮、長江中下游和西南麥區(qū)品種的分析表明，小麥植酸含量為5.16～9.87 g/kg[7]。在我國137份微核心種質(zhì)資源中，植酸含量變異范圍為9.59～29.63 g/kg，大多數(shù)品種植酸含量屬于中等水平[14]。400份印度及 CIMMYT品種和人工合成種植酸含量的變異范圍為11.7～19.3 g/kg[20]。黃淮麥區(qū)212份代表性品種的植酸含量為2.18～13.37 g/kg，絕大多數(shù)品種植酸含量屬于中等水平[10]。本研究表明，中國冬麥區(qū)205份20世紀(jì)80年代以來的推廣品種或骨干親本及高代品系的植酸含量為1.00～18.90 g/kg，絕大多數(shù)品種植酸含量較低。與前人報道相比[9,10,14,20]，本研究中植酸含量的變異范圍更大，且絕大多數(shù)品種植酸含量較低，可能與所選取的材料和數(shù)量有關(guān)。目前還沒有對小麥植酸含量進(jìn)行育種選擇，因而其變異范圍較大。因此，在當(dāng)前進(jìn)行小麥低值酸品質(zhì)改良時，首先對現(xiàn)有品種的目標(biāo)性狀進(jìn)行篩選將是一個有效的選擇手段。本研究中，推廣品種或骨干親本中，B54、B40、B86和 B126植酸含量較低，有可能成為重要的育種親本，在低植酸含量小麥品質(zhì)育種中發(fā)揮作用。

高代育種品系具有優(yōu)異目標(biāo)性狀突出、遺傳穩(wěn)定的特征，有經(jīng)濟(jì)價值的可直接在生產(chǎn)上應(yīng)用，也可選育成為品種。本群體中B131、B141、B181和 B149等高代育種品系植酸含量較低，結(jié)合品系優(yōu)異性狀，有可能選育出低值酸含量功能性小麥新品種。

目前，國內(nèi)外對小麥籽粒植酸含量QTL定位方面的報道較少。本研究分別在2B、3B、3D和6B染色體上檢測到植酸含量的QTL位點，何秋怡等[15]在3B和3D染色體上檢測到2個控制植酸含量的 QTL，凡迪等[16]在 2B和 6B染色體上定位到控制植酸含量的QTL，初步推斷這些染色體上可能存在控制植酸含量的重要基因。

國內(nèi)外對小麥鐵、鋅等元素含量已進(jìn)行了較深入研究，品種間存在顯著差異[21]，但植酸含量和鐵、鋅等微量元素含量相關(guān)性研究鮮有報道。建議在本研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測定冬麥區(qū)種質(zhì)資源的鐵、鋅等微量元素含量，同時篩選出值酸含量低且鐵、鋅等微量礦質(zhì)元素含量高的種質(zhì)資源，同時將其用于育種，為小麥新時代品質(zhì)育種提供參考。

4 結(jié)論

兩個種植年度環(huán)境群體植酸含量平均值為4.99 g/kg和3.31 g/kg，變幅分別為17.90 g/kg和10.20 g/kg，群體植酸含量變異范圍較大。聚類分析將群體材料聚為6類。其中，高代育種品系除第2和3類沒有分布之外，其它各類中都有均勻分布；推廣品種或骨干親本中，B54、B40、B86和 B126植酸含量最低，有可能成為重要的育種親本，在低植酸含量小麥品質(zhì)育種中發(fā)揮作用。高代品系 B131、B141、B181和 B149植酸含量最低，結(jié)合品系優(yōu)異性狀，有可能選育出低值酸含量功能性小麥新品種。關(guān)聯(lián)分析共檢測到36 個與小麥籽粒植酸含量相關(guān)聯(lián)的顯著關(guān)聯(lián)位點（P＜0.001），分布在 2B、3A、3B、3D、6A和6B染色體上，單個關(guān)聯(lián)位點表型變異貢獻(xiàn)率為5.73%～9.69%。同時，挖掘了一批低值酸含量基因的優(yōu)異等位變異，例如Tdurum_contig35799_208-G、Excalibur_c96134_152-C、Excalibur_c96134_182-T和Tdurum_contig43538_1687-A對低植酸含量效應(yīng)較大。