植物乳桿菌對苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)和細(xì)菌菌群的影響

王 媛，王雁萍，趙珊珊，楊逢源，郝湘妹，范小苗

(1.鄭州大學(xué) 物理學(xué)院 河南 鄭州450001；2.河南省離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南 鄭州450001；3.鄭州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 河南 鄭州450001)

0 引言

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，人們對于畜產(chǎn)品的需求也逐漸增加。缺乏充足、優(yōu)質(zhì)的綠色飼料是制約畜產(chǎn)品快速發(fā)展的主要因素之一[1]。苜蓿 (Medicagosativa)具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和蛋白質(zhì)含量，已成為奶牛日糧中使用最為廣泛的飼料成分之一[2]，但苜蓿的生產(chǎn)多為季節(jié)性，無法持續(xù)為畜牧業(yè)提供優(yōu)質(zhì)飼料。青貯是一種保持飼料作物常綠的方法，通過厭氧發(fā)酵延長飼料的儲藏時(shí)間，提高飼料適口性。進(jìn)行苜蓿青貯的理想干物質(zhì)條件為30%～35%[3]，但在該條件下，苜蓿的可溶性碳水化合物含量低，緩沖能較高，相較于其他牧草，自然青貯品質(zhì)較差。此外，苜蓿的收獲季節(jié)大多為雨季，導(dǎo)致苜蓿自然晾曬和干燥困難，同樣增加了自然青貯的難度。植物乳桿菌作為青貯添加劑能夠有效提高苜蓿的青貯品質(zhì)，加速乳酸發(fā)酵進(jìn)程，快速降低青貯環(huán)境的pH值，提高發(fā)酵品質(zhì)[1, 4-6]。細(xì)菌菌群在青貯過程中具有重要作用，同時(shí)也受到多種因素的影響，包括青貯添加劑、青貯條件以及材料附生微生物等[7-8]。因此，研究添加植物乳桿菌對苜蓿青貯發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群組成的影響具有一定的意義。高通量測序技術(shù)[9]已經(jīng)廣泛應(yīng)用于測定各種環(huán)境中細(xì)菌菌群的組成，包括青貯環(huán)境。目前，利用高通量測序評估干物質(zhì)含量低于理想狀態(tài)下，添加或不添加植物乳桿菌的苜蓿青貯效果，以及細(xì)菌菌群與pH值、發(fā)酵代謝產(chǎn)物之間的相關(guān)性報(bào)道較少。為此，本文通過高通量測序技術(shù)探究添加植物乳桿菌對紫花苜蓿青貯60 d的細(xì)菌菌群以及發(fā)酵品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 苜蓿青貯飼料的制備

實(shí)驗(yàn)所用紫花苜蓿是在河南省鄭州市(34.76°N，113.65°E；海拔110.4 m)收割的初花期紫花苜蓿。自然狀態(tài)下萎蔫至含水量為26.60%，用鍘刀將其鍘為1～2 cm的小段。使用植物乳桿菌YX (臺灣亞新生物技術(shù)有限公司) 或植物乳桿菌ZZU A341 (山西初花期紫花苜蓿附生菌株) 作為青貯添加劑。將切碎的紫花苜蓿混合均勻，分為3個處理組：① 無添加劑對照組 (CK)； ② 植物乳桿菌YX (LPI，1×106cfu/g)； ③ 植物乳桿菌ZZU A341 (LPA，1×106cfu/g)。將約500 g苜蓿碎飼料和5 mLOD600為0.8的細(xì)菌懸液(1×106cfu/g)混合均勻(CK組中添加5 mL無菌水)，抽真空后在室溫(25 ℃)下保存，每個處理組設(shè)置三個重復(fù)樣本。

1.2 微生物組成、化學(xué)成分、發(fā)酵常規(guī)指標(biāo)分析

青貯前測定苜蓿原料的微生物組成、化學(xué)成分和發(fā)酵常規(guī)指標(biāo)，緩沖能(BC)采用鹽酸-氫氧化鈉法[10]測定。青貯60 d后在超凈工作臺進(jìn)行拆袋處理，每個樣本混合均勻后共分為三份樣品，依次分析其細(xì)菌菌群、化學(xué)成分以及發(fā)酵常規(guī)指標(biāo)。第一份樣品在拆袋后儲藏于-20 ℃，用來獲取青貯飼料60 d的細(xì)菌DNA。使用細(xì)菌DNA試劑盒D3350-02 (Omega Biotek, Norcross, GA, USA) 提取細(xì)菌總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的濃度，量化后的DNA樣本保存在 -20 ℃ 以備后續(xù)分析，利用正向引物515 F和反向引物806 R擴(kuò)增不同區(qū)域 (16S V4) 的16S rDNA基因[11]。PCR產(chǎn)物從2%瓊脂糖凝膠中提取，使用GeneJET 凝膠提取試劑盒(Thermo Fisher Scientific Inc., Carlsbad, CA, USA)進(jìn)一步純化。16S rDNA 擴(kuò)增子測序使用Thermo Fisher’s Ion S5TMXL (北京百邁客生物科技有限公司)進(jìn)行。利用FLASH(版本1.2.11)組裝reads，根據(jù)QIIME質(zhì)量控制程序(版本1.9.1)刪除質(zhì)量較差的reads，通過Uparse軟件(v7.0.1001)進(jìn)行序列分析。第二份樣品將10 g青貯苜蓿與90 mL無菌水混合，用pH計(jì) (上海梅特勒-托萊多儀器有限公司) 測量pH值。使用高效液相色譜儀 (Waters Inc., Massachusetts, USA) 測定樣品中有機(jī)酸濃度，色譜柱規(guī)格為Carbomix H-NP10∶8%(7.8 m×300 mm×10 μm)，流動相為0.025 4% H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫為55 ℃。采用苯酚-次氯酸鈉比色法[12]測定氨態(tài)氮 (AN) 含量。第三份樣品在60 ℃下烘干48 h至恒重，測定其干物質(zhì)(DM)含量。將干燥后的樣品用打粉機(jī)粉碎后使用40目篩子過濾，采用蒽酮-硫酸法[13]測定樣品中可溶性碳水化合物(WSC)的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用IBM SPSS(版本21.0)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用R軟件(版本2.15.3)進(jìn)行細(xì)菌群落的α多樣性分析、主成分分析、Spearman相關(guān)性分析。使用Uparse軟件對所有樣品的Clean read進(jìn)行聚類，用Mothur方法與SILVA132(http:∥www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行細(xì)菌菌群注釋分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 苜蓿原料的特性

青貯前紫花苜蓿原料的pH值為6.06，DM含量為26.60%，WSC含量為17.56 g/kg DM，BC含量為460.00 mE/kg DM，在新鮮苜蓿樣品中未檢測到有機(jī)酸和AN。

2.2 苜蓿青貯60 d的化學(xué)成分與發(fā)酵常規(guī)指標(biāo)

苜蓿青貯60 d的化學(xué)成分與發(fā)酵常規(guī)指標(biāo)分別如表1、表2所示，其中CK代表無添加劑自然青貯，LPI、LPA分別代表添加植物乳桿菌YX或ZZU A341青貯。青貯60 d后，CK組的DM含量顯著降低(P<0.05)，DM損失率高于LPI或LPA組；LPI或LPA組的pH值和乳酸含量與CK組差異顯著(P<0.05)，AN含量低于CK組，且僅在CK組中檢測到丁酸。

表1 苜蓿青貯60 d的化學(xué)成分Table 1 The chemical composition of alfalfa silage for 60 d

表2 苜蓿青貯60 d的發(fā)酵指標(biāo)Table 2 The fermentation index of alfalfa silage for 60 d

2.3 青貯60 d的α多樣性分析

青貯60 d時(shí)，利用高通量測序技術(shù)分析青貯苜蓿微生物菌群的均一性與多樣性。圖1 為青貯飼料不同組別間Shannon指數(shù)和Shannon指數(shù)組間差異蜜蜂群圖(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)，反映了不同樣本間微生物物種均一性和多樣性的差別。如圖1所示，與青貯前相比，青貯后樣品中微生物菌群的多樣性降低。

M，新鮮苜蓿；CK，自然青貯；LPI，添加植物乳桿菌YX青貯；LPA，添加植物乳桿菌ZZU A341青貯。圖1 Shannon指數(shù)(a)和Shannon指數(shù)組間差異(b)蜜蜂群圖Figure 1 Beeswarm plots of Shannon indices (a) and difference of Shannon indices between groups (b)

M，新鮮苜蓿；CK，自然青貯；LPI，添加植物乳桿菌YX青貯；LPA，添加植物乳桿菌ZZU A341青貯。圖2 基于青貯苜蓿發(fā)酵產(chǎn)物與微生物信息的主成分分析Figure 2 Principal component analysis of alfalfa silage fermentation products and microbial information

2.4 青貯60 d 發(fā)酵產(chǎn)物與微生物的主成分分析

基于發(fā)酵產(chǎn)物與微生物信息對青貯60 d的結(jié)果進(jìn)行主成分分析(PCA)。在主成分分析圖中，距離越接近，表明微生物組成越相似。圖2為基于青貯苜蓿發(fā)酵產(chǎn)物與微生物信息的主成分分析。兩個主成分PC1和PC2可以分別解釋46.24%和14.68%的差異。結(jié)果顯示，CK組與LPI或LPA組的微生物菌群聚類均明顯分離。

2.5 青貯60 d細(xì)菌菌群的相對豐度

圖3為門水平和屬水平上細(xì)菌菌群相對豐度柱形圖。圖3(a)為青貯60 d門水平上各細(xì)菌菌群的相對豐度，青貯后Firmicutes 門和 Proteobacteria門相對豐度增加。圖3(b)為屬水平上各細(xì)菌菌群的相對豐度，CK組中的優(yōu)勢細(xì)菌菌群為Garciella屬(59.75%)，其次為Weissella屬(7.18%)和Lactobacillus屬(2.45%)。LPI或LPA組中的優(yōu)勢菌群為Lactobacillus屬，相對豐度分別為71.73%和57.44%；Garciella屬的相對豐度分別為8.29%和24.22%，Weissella屬的相對豐度分別為2.03%和1.18%。

M，新鮮苜蓿；CK，自然青貯；LPI，添加植物乳桿菌YX青貯；LPA，添加植物乳桿菌ZZU A341青貯。圖3 門水平和屬水平上細(xì)菌菌群相對豐度柱形圖Figure 3 Column chart of relative abundance of bacterial flora at the phylum level and genus level

2.6 青貯60 d環(huán)境因子與細(xì)菌菌群之間的相關(guān)性

利用Spearman相關(guān)系數(shù)研究青貯苜蓿細(xì)菌菌群相對豐度與pH值、發(fā)酵代謝產(chǎn)物之間的相關(guān)性，得到兩兩之間的相關(guān)性系數(shù)(r)和顯著性P值。r介于-1和1之間，r<0時(shí)為負(fù)相關(guān)，r>0時(shí)為正相關(guān)。Spearman發(fā)酵代謝產(chǎn)物與細(xì)菌菌群相關(guān)性分析熱圖如圖4所示(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。結(jié)果表明，Lactobacillus屬與pH值和AN含量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.97，r=-0.91；r=-0.67，r=-0.73；P<0.05)，與乳酸和乙酸的比值呈顯著正相關(guān)(r=0.93，r=0.82；P<0.05)。Garciella屬和Weissella屬與pH值和AN含量呈正相關(guān)(r=0.95，r=0.40；r=0.63，r=0.72)；Weissella屬與乳酸和乙酸的比值呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.90，r=-0.72；P<0.05)。

LA，乳酸；AA，乙酸；LA.AA，乳酸和乙酸的比值；WSC，可溶性碳水化合物；AN，氨態(tài)氮。圖4 Spearman發(fā)酵代謝產(chǎn)物與細(xì)菌菌群相關(guān)性分析熱圖Figure 4 Heat map of correlation analysis between Spearman fermentation metabolites and bacterial flora

3 討論

苜蓿的WSC含量低、BC含量高，與其他牧草相比較難青貯，且收獲時(shí)的雨季會增加苜蓿材料的濕度。苜蓿原料的含水量會對青貯過程中的發(fā)酵速率和細(xì)菌菌群產(chǎn)生影響，含水量過高容易引起梭菌發(fā)酵，不利于乳酸菌繁殖[14]。本文旨在研究苜蓿DM含量低于理想狀態(tài)下，添加植物乳桿菌青貯對發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群及發(fā)酵品質(zhì)的影響。青貯60 d后，與LPI或LPA組相比，CK組乳酸積累量較低，pH值、AN含量和DM損失率較高，表明在較高含水量條件下自然青貯發(fā)酵品質(zhì)較差。乳酸菌作為青貯添加劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于牧草青貯實(shí)驗(yàn)中[15]。在本研究中，LPI或LPA組乳酸發(fā)酵充足，降低了青貯環(huán)境的pH值，有效抑制了青貯過程中的丁酸發(fā)酵。AN被認(rèn)為是氨基酸脫氨、脫酸的結(jié)果[16]，會降低青貯飼料的營養(yǎng)價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)中LPI或LPA組的AN含量均低于CK組，青貯品質(zhì)較好。

Ni等[1]認(rèn)為，高含水量的苜蓿青貯中，乳酸積累進(jìn)程較為緩慢，無法快速降低青貯環(huán)境的pH值以及細(xì)菌菌群多樣性。LPI或LPA組的細(xì)菌菌群多樣性低于CK組，與其具有較低的pH值和AN含量相關(guān)。與CK組相比，LPI或LPA組的細(xì)菌菌群組成發(fā)生明顯改變，這可能是其發(fā)酵品質(zhì)優(yōu)于CK組的原因之一[17]。Eikmeyer等[5]利用NGS技術(shù)分析牧草青貯14 d和58 d的細(xì)菌菌群，F(xiàn)irmicutes門為優(yōu)勢菌門；Keshri等[18]認(rèn)為，青貯環(huán)境中較低的pH值和厭氧條件有利于Firmicutes門的生長繁殖，均與本文的研究結(jié)果一致。LPI或LPA組中Garciella屬和Weissella屬相對豐度較低，Lactobacillus屬相對豐度較高，表明植物乳桿菌作為青貯添加劑可以改變細(xì)菌菌群組成。一般認(rèn)為AN與青貯過程中Clostridial發(fā)酵有關(guān)，Garciella是一種厭氧嗜熱菌，屬于Clostridiales (門)、Clostridia(屬)，存在于青貯環(huán)境中將會增加青貯難度[19-21]。在本研究中與LPI或LPA組相比，CK組中Garciella屬的相對豐度較高，還具有較高的AN含量和pH值，與環(huán)境因子分析中Garciella屬與pH值和AN含量呈正相關(guān)相符。牧草自然青貯中的優(yōu)勢菌屬一般為Lactococcus屬、Leuconostoc屬和Weissella屬[5]；燕麥進(jìn)行自然青貯的優(yōu)勢菌屬為Weissella屬、Leuconostoc屬和Pediococcus屬[22]。本研究中，CK組中Weissella屬相對豐度高于LPI或LPA組，Weissella屬發(fā)酵產(chǎn)酸能力可能低于植物乳桿菌，導(dǎo)致乳酸發(fā)酵不足以延遲pH值下降，無法有效抑制青貯環(huán)境中不良微生物的活動，這一結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)中Weissella屬與pH值和AN含量呈正相關(guān)一致。有研究報(bào)道，在牧草青貯過程中參與乳酸發(fā)酵的細(xì)菌菌群主要有Lactobacillus屬、Pedicoccus屬、Weissella屬和Leuconostoc屬[17,23]。青貯過程中Lactobacillus屬相對豐度較高，代表青貯實(shí)驗(yàn)較為成功[7]，本研究中Lactobacillus屬在LPI或LPA組中相對豐度較高，且青貯組中細(xì)菌菌群多樣性、AN含量和pH值均較低，該現(xiàn)象和Lactobacillus屬與pH值及AN含量呈顯著負(fù)相關(guān)，以及與乳酸和乙酸的比值呈顯著正相關(guān)相符。