鴨坦布蘇病毒凍干高免卵黃抗體的研制

王紅琳 盧 琴 羅青平 張蓉蓉 溫國(guó)元 商 雨 邵華斌

湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430064

鴨坦布蘇病毒病是由黃病毒科、黃病毒屬的坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）引起的以產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋量驟降和雛鴨或育成鴨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀為主要特征的一種新型急性傳染病，又稱為鴨出血性卵巢炎、鴨黃病毒病。以種鴨、蛋鴨產(chǎn)蛋量急劇下降，產(chǎn)蛋率從產(chǎn)蛋高峰90%左右下降至10%不等；雛鴨發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)癥狀甚至死亡為主要特征[1-2]。自2010年暴發(fā)以來(lái)，該病在我國(guó)大陸地區(qū)廣泛傳播，給國(guó)內(nèi)的家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病傳播迅速，蔓延范圍廣，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。卵黃抗體（IgY）是預(yù)防和緊急治療該病的有效防制劑[5]，由于常規(guī)卵黃抗體一般為液體，質(zhì)量不穩(wěn)定、副作用大、體積大運(yùn)輸不便。因此，本試驗(yàn)通過(guò)用鴨坦布蘇病毒滅活疫苗免疫SPF 蛋雞后，收集卵黃進(jìn)行IgY的提純和凍干研究，旨在克服常規(guī)卵黃抗體的缺陷，達(dá)到有效預(yù)防和治療該病的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1）毒種：鴨坦布蘇病毒（DTMUV）JL2011 株，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)研究室分離、保存。

2）鴨坦布蘇病毒病滅活苗：由本實(shí)驗(yàn)室制備，將DTMUV JL2011 株接種SPF 雞胚，按常規(guī)方法[6]制備成油乳劑滅活苗，每毫升疫苗至少含滅活前的鴨坦布蘇病毒106.0 EID50，質(zhì)量檢驗(yàn)合格，備用。

3）SPF 雞胚：由北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司提供的SPF 種蛋，在實(shí)驗(yàn)室孵育至9日齡，備用。

4）SPF 蛋雞：由北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司提供的SPF 種蛋，在實(shí)驗(yàn)室孵育至所需日齡，隔離飼養(yǎng)備用。

5）雛鴨：由湖北宜城某養(yǎng)殖場(chǎng)提供種蛋，在實(shí)驗(yàn)室孵育至7日齡，且鴨坦布蘇病毒抗體為陰性者用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1）蛋雞的免疫及高免雞蛋的收集。用DTMUV滅活苗免疫接種90日齡SPF 蛋雞50 只。首免，每只雞肌肉注射滅活苗1.5 mL；間隔14 d 后進(jìn)行第2 次免疫，每只雞2.0 mL；二免后間隔14 d 進(jìn)行第3 次加強(qiáng)免疫，每只雞2.0 mL。第3 次加強(qiáng)免疫后第14 天開(kāi)始收集雞蛋。做好記錄和標(biāo)記，置于4~8 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2）卵黃抗體（IgY）的提取。將收集的雞蛋用清水沖洗干凈后，浸入水溫42 ℃的0.1%新潔爾滅水溶液中消毒15~20 min，隨后將雞蛋用福爾馬林密閉熏蒸消毒30 min。采取手工打蛋，充分除去蛋清、胚盤和系帶，收集卵黃于一潔凈容器內(nèi)，充分?jǐn)嚢枋沟包S呈均勻膏狀，然后加入等體積經(jīng)65 ℃30 min消毒并冷卻的蒸餾水，攪拌混勻后，60~65 ℃加熱滅活8~15 min。先加入相當(dāng)于原卵黃體積4 倍，用鹽酸調(diào)pH 為4.2 的蒸餾水，將水溫降至1~4 ℃，加入滅活的蛋黃液，邊加邊攪拌，之后4~8 ℃保溫靜置4 h，離心分離上清液；加入辛酸至終濃度為0.02%，攪拌混勻，室溫靜置2~4 h。用尼龍濾布粗濾，再用超濾膜過(guò)濾濃縮，備用，取樣待檢。

3）雞胚中和試驗(yàn)。用滅菌生理鹽水將萃提的IgY 做10、102、103、104、105、106倍稀釋，分別與100倍ELD50的鴨坦布蘇病毒等比混合，37 ℃作用1 h，接種10日齡SPF 雞胚，0.2 mL/枚，各5 枚，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照組和102倍稀釋的未免疫的SPF 雞蛋卵黃對(duì)照組，7 d 內(nèi)觀察雞胚死亡情況，用Reed-Muench法計(jì)算卵黃抗體中和效價(jià)。

4）凍干。取萃提后無(wú)菌檢驗(yàn)合格的IgY 溶液加入脫脂牛奶、蔗糖等作為穩(wěn)定劑，充分搖勻，定量分裝，迅速進(jìn)行冷凍真空干燥（按《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》2000年版附錄進(jìn)行）。

5）IgY 凍干前后的效價(jià)檢測(cè)。隨機(jī)抽取凍干前后各3 瓶樣品，采用間接ELISA 方法[7]檢測(cè)其效價(jià)，同時(shí)設(shè)非免疫雞蛋的卵黃作為對(duì)照。

6）攻毒保護(hù)試驗(yàn)。將20 只健康7日齡雛鴨隨機(jī)分成2 組，IgY 免疫組10 只，對(duì)照組10 只，免疫組每只雛鴨皮下接種制備的凍干卵黃抗體0.5 mL，24 h 后免疫組和對(duì)照組均肌肉注射DTMUV 強(qiáng)毒株，隔離飼養(yǎng)，觀察14 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞胚中和試驗(yàn)

將第2 次免疫后2 周到第3 次免疫后8 周收集的雞蛋分為9 組，分別取樣進(jìn)行雞胚中和試驗(yàn)。結(jié)果標(biāo)明，第3 次免疫后2 周IgY 溶液的雞胚中和效價(jià)達(dá)到1∶103.5，與鄒曉娟[8]研究結(jié)果高度一致；三免后4 周、5 周達(dá)到最高（1∶104.5），有效中和效價(jià)一直持續(xù)到三免后7 周，8 周下降至1∶103.0（圖1）。

圖1 DTMUV 滅活苗免疫蛋雞后IgY 抗體消長(zhǎng)規(guī)律

2.2 IgY 凍干前后的效價(jià)檢測(cè)

間接ELISA 方法檢測(cè)結(jié)果如圖2，凍干前（免疫組1~3）、凍干后（凍干卵黃組1~3）的特異性明顯高于非免疫組，判定標(biāo)準(zhǔn)為S/N≥2.1 為陽(yáng)性。說(shuō)明IgY凍干前、后效價(jià)保持一致，凍干對(duì)效價(jià)沒(méi)有影響。

圖2 鴨坦布蘇病毒卵黃抗體凍干前后的效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

2.3 攻毒保護(hù)試驗(yàn)

IgY 免疫組10 只鴨免疫卵黃抗體24 h 后，肌肉注射DTMU 毒株后第3 天有2 只鴨出現(xiàn)減食、精神萎靡、腹瀉等癥狀，持續(xù)2~3 d 后逐漸恢復(fù)正常，未出現(xiàn)死亡，保護(hù)率達(dá)100%，觀察14 d 后對(duì)鴨進(jìn)行剖檢，均無(wú)肉眼可見(jiàn)的病理變化；對(duì)照組的10 只雛鴨在攻毒后3 d 開(kāi)始出現(xiàn)減食、精神萎靡、腹瀉等癥狀，并有部分鴨出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈、運(yùn)動(dòng)失調(diào)等神經(jīng)癥狀，隨后陸續(xù)死亡8 只，死亡鴨剖檢均可見(jiàn)肝臟腫大、淤血、壞死、脾臟腫大、心肌岀血等病理變化，觀察14 d 后，剖檢發(fā)病未死亡的2 只鴨，可見(jiàn)肝臟、脾臟腫大等病理變化，保護(hù)率20%（表1）。

表1 凍干卵黃抗體的攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

1）本研究用鴨坦布蘇病毒病滅活苗三次免疫產(chǎn)蛋雞，收取高免雞蛋，將萃提的IgY 溶液制成凍干制劑后，其效價(jià)沒(méi)有發(fā)生改變，克服了常規(guī)水劑卵黃抗體的缺陷，具有質(zhì)量穩(wěn)定、副作用小、無(wú)殘留、易于保存、運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)，為鴨坦布蘇病毒的防控提供了一種有效的凍干高免卵黃抗體制劑。

2）間接ELISA 方法是血清學(xué)中較常用的檢測(cè)方法之一，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高及檢測(cè)速度快等特點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于動(dòng)物的疾病診斷及疫苗效果的評(píng)價(jià)方面，本試驗(yàn)證明也可用于卵黃抗體的免疫效價(jià)評(píng)價(jià)，與施少華等[7]研究結(jié)果相吻合。

3）本研究制備的凍干卵黃抗體對(duì)7日齡雛鴨的免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，未免疫卵黃抗體健康雛鴨的發(fā)病率達(dá)100%，死亡率達(dá)80%；而卵黃抗體免疫組的死亡率為0%，保護(hù)率達(dá)100%，說(shuō)明卵黃抗體能夠有效保護(hù)鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒的攻擊。凍干卵黃抗體對(duì)產(chǎn)蛋鴨的免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)及臨床應(yīng)用效果有待于下一步研究。

4）鴨坦布蘇病毒病一年四季均可發(fā)生，在防控中使用高免卵黃抗體時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療；②疫苗免疫失敗后可用高免卵黃抗體緊急預(yù)防接種加以控制，減少死亡；③注射高免卵黃抗體時(shí)為防止局部感染，可同時(shí)投喂2~3 d的廣譜抗生素效果更好。